Summary
Prostat enfeksiyonu kronik prostatit pelvik ağrı arabuluculuk katkıda bulunan bir faktör olabilir. Biz standardize edilmiş bakteriyel inokulum, zamanla farelerde dokunsal allodini ölçmek için erkek farelerde ve metodoloji üretra içine bakteri instilasyon hazırlama prosedürü açıklanmaktadır.
Abstract
Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) idrar yolu enfeksiyonları ve bakteriyel prostatit 1 önemli bir rol oynamaktadır patojenlerdir. Biz son zamanlarda UPEC kronik pelvik ağrı 2, Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS) 3,4 bir özelliği başlatılmasında önemli bir role sahip olduğunu göstermiştir. Klinik UPEC ile prostat enfeksiyonu doku hasarı ve otoimmünite 5 mekanizmalarının başlatılması içerebilir mekanizmalar yoluyla kronik ağrı başlatmak ve kurabilir.
Prostat UPEC patogenezini anlamak için bir meydan okuma manipülasyon prostat bezinin nispi erişilememesi olduğunu. Böylece de prostat bir artan enfeksiyon oluşturma erkek farelere UPEC bir klinik suşu vermek üzere, daha önce anlatılan intraüretral enfeksiyon yöntemiyle 6 kullanılmıştır. Burada, biz ba standartlaştırılması için protokoller tarifgibi bakteri perfüze anestetize erkek fareler catheterizing için işlem olarak cterial inokulum 7.
CP / CPPS öncelikle dokunsal allodini 4 varlığı ile karakterizedir. Davranış testleri ifade viseral ağrı 8-10 kaynaklanan kutanöz hiperaljezi kavramına dayanmaktadır. Visseral dokularda bir irritabl odak normal olmayan ağrılı uyaranlar (allodini) için abartılı bir tepki veren Kutanöz ağrı eşikleri azaltır. Yatan visseral ağrının şiddeti ile artış eğilimindedir anormal yanıtları cilt sonucu normal kuvvet uygulanması. Bu UPEC bakteri ile bir tek enfeksiyonuna yanıt olarak zaman içinde dokunsal allodini ölçmek için von Frey lifler kullanmak NOD / ShiLtJ farelerde yöntemi açıklanmaktadır.
Protocol
1. Fare Aşılama için bakteri Hazırlık
Aşağıdaki aseptik koşullar altında yapılmalıdır.
- Kapakları biri 17 x 100 mm polipropilen tüpler atın ve taze Luria broth (LB) medya 3 ml ekleyin. Otoklavlanmış ipuçlarını kullanarak, gerginlik CP1 2 bazı dondurulmuş bakteri gliserol stok almak ve LB ortamı içeren tüpe kültürünün küçük bir miktar transfer. Oksijen yine tüp girebilir, böylece tüp kapak değiştirin - kültür aerobik koşullar altında büyüyebilir gerekmektedir. 37 Sıra tüp ° gecede 220 rpm'de bir sallayarak inkübatör C.
- Ertesi gün, 3 ml LB ortamı ile yeni bir tüp vermek üzere gece boyunca kültür 5 ul aktarmak ve 37 ° C 'de bir gece boyunca kuluçka makinesi içinde statik koşullar altında büyüyebilir
- Günde aa 50 ml tüp içinde 3 taşıma kültürün 40 ul, 40 ml LB ortamı her içeren. 37 ° C sabit inkübatör gecede yerleştirin.
- Açın ve 4 ° C'ye santrifüj ayarlayınBir kez santrifüj son sıcaklığa ulaştığını, 40 ml Nalgene santrifüj tüpüne her 40 ml kültürü aktarmak.
- Gerektiğinde LB medya ile ses seviyesini ayarlamak - santrifüj dengelemek için tüpleri tartılır. 20 dakika boyunca 6000 rpm'de tüpler Spin.
- Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve yavaşça 40 ml steril PBS bakteriyel pelet askıya.
- PBS ile adım 1.5 tekrarlayın.
- Süpernatantı kapalı aspire ve 500 ul steril PBS içinde bakteri askıya. 1.5 ml mikrofuge'de tüpüne çözümü aktarın. Süspansiyonu 10 ul alın ve buz gibi soğuk PBS 990 ul seyreltin. Aşılama için gerekli hacim belirlemek için OD 420 nm okumak için bir spektrofotometre kullanın. Uygun miktarda belirlemek için buz gibi soğuk PBS içinde pelet askıya: OD 420 nm sayısı (ml) alın ve bakteriyel pelet [ex tahmini hacmi çıkarın. OD 420 nm = 0.545, pelet yaklaşık 0.075 ml. 0,545-0,075 = 0,470].
- 10. Bakteriyel süspansiyon ul ve di kaldırma990 ul buz gibi soğuk PBS içinde ud. OD 420 nm okuyun. Hedefi 1.000 seyreltilmiş süspansiyonu ± .010 bir OD 420 nm değeri elde etmektir. Sizin seyreltme sayısı bu hedefin üzerinde ise, süspansiyon daha fazla hacim kazandırmak ve başka bir okuma almak. Numarası altında ise 0,990 ardından istediğiniz okuma elde edilinceye kadar erteleme ve tekrar OD 420 nm okuma aşağı spin.
2. Hayvan Enfeksiyon
Fareler (5-7 haftalık, her grupta on) Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 'den satın alındı.
- Fare bir pleksiglas odasında izofluran% 1-4 solunması ile anestezi ve yatık kadar izlenir.
- Bir seferde bir fare bir cam Hamilton şırınga (1.5-2.0 cm uzunluğunda) değiştirilmiş 30 G iğne takılı bir polietilen (PE10) kateter ile kateterizasyon ile bakterilerin instilasyonu için alınır. Kateter iğne merkeze yerleştirilir. Fare Plac olduğunued anestezi altında dorsal yüzeyi üzerinde bir burun konisi kullanılarak yapılmaktadır.
- Fare penis penil üretra girişinde yağlanması için kullanılan hafif basınç ve pamuklu çubuk üzerine yağ bolca tarafından çekilmektedir.
- 10 ul fosfat-tamponlu 1 x 10 8 bakteri içeren tuzlu kateterizasyon anestetize farelerin üretra içine katılmaktadır.
- Bakteri bağlanma sağlamak için acil idrara çıkma ve önlemek için bakteri giriş sonra fareler pleksiglas bölme içinde 15 dakika süreyle bir anestezi altındaki bir durumda muhafaza edilir.
- Fare onların tekrar kafeslerine yerleştirildi ve sonraki 24 saat boyunca izlenir.
3. Davranış Testi
Fare öncesinde enfeksiyon (bazal) ve gün 3, 7, 14, 21 ve enfeksiyon sonrası 28 üzerinde test edildi. Referans hiperaljezi ve dokunsal allodini karın 11,12 ve plantar r uygulanan von Frey filamentleri kullanılarak test edildiarka pençe 13 egion. Test-saati günlük sabit bir de perfomed edildi, standart metodoloji ve tüm hayvanların tek deneyci testi kullanılmıştır. Grupların Kör test hayvan modellerinde davranış bazlı test ağrı ile ilgili sınırlamalar ile mücadele için kullanılmıştır. 0.04 arasında kuvvetler, 0.16, 0.4, 1.0 ve 4.0 g (Stoelting, ABD) ile beş ayrı von Frey filamentlerin çekilme yanıtların karın ve frekans uygulanmıştır hesaplanmıştır.
- Alışma sürecinden bir 30 dakika süre sonra, fareler bir paslanmaz çelik tel ızgara taban ile evde yapılan bireysel pleksiglas odacığı (6 x 10 x12 cm) yerleştirilmiştir.
- Referans hiperaljezi ve dokunsal allodini beş von Frey filamentleri kullanılarak test edildi. Her filament toplam 10 kez 5 sn bir uyarıcılar arası süre ile 1-2 saniye uygulandı ve tüyleri kuvvet artan düzende test edildi.
- Her bir fılaman, prostat Genel çevresinde alt karın bölgesine uygulanır vebakım duyarsızlaştırma önlemek veya etkilerini "rüzgar" Bu bölgedeki farklı alanlarda teşvik götürüldü. Filamentler 10 kez toplam uyarımlar arasında en az 5 saniye aralıklarla 1-2 saniye için kuvvet artan sırada uygulanmıştır.
- Davranış üç tip filament stimülasyon olumlu bir yanıt olarak kabul edilir: karın 1) keskin retraksiyonu; 2) hemen yalama veya filament stimülasyon alan kazıma; 3) atlama.
- Tepki frekansı olumlu yanıt yüzdesi (10 üzerinden, 10 =% 50 örneğin 5 karşılıklar) olarak hesaplandı ve data cevabı frekans ortalama yüzdesi ± SE olarak rapor edildi
- 25'den fazla pozitif toplam taban yanıtları Hayvanlar çalışmanın dışında tutulmuştur.
- Dokunsal allodini 0.04 güçleri, 0.16, 0.4, 1.0 ve 4.0 g ile von Frey filamentleri kullanılarak arka pençenin plantar bölgeye üzerinde test edildi. Medyan% 50 geri çekme eşiği (5) yukarı-aşağı tuşlarını kullanarak değerlendirildifilaman hafif bir açı kadar test 0.04 g filaman ile başlatılan yöntem arka pençenin plantar yüzeye dik olarak uygulanır. Filament olumlu bir yanıt gözlenmiştir kadar artan sırayla test edildi. Filament pozitif tepki testi pençe pençe ya yalama keskin bir geri çekilme ya olarak tanımlandı. Olumlu bir yanıt kaydedildi zaman bir sonraki daha zayıf filaman uygulandı, ve bir negatif cevap gözlendi, sonra bir sonraki daha güçlü bir filaman uygulanmıştır.
- Açıklanan deneyler ve metodoloji incelenen ve onaylanan Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ile ve komite kullanabilirsiniz edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz bakteriyel enfeksiyon üzerine kronik ağrı varlığı için NOD / ShiLtj ve C57BL/6J erkek farelerde incelenmiştir. Erkek fareler (5-7 haftalık) üretra (Şekil 1) içine salin ya da bakteri ile damlatıldı edildi. Salin-coşturup C57BL/6J fareler ve UPEC ile enfekte C57BL/6J farelerin von Frey filamentleri ile pelvik bölgeye mekanik uyarılması deney 28 günlük kurs (Şekil 1) sırasında değişmedi bir tepki frekansı sonuçlandı. Buna karşılık, UPEC-enfekte NOD farelerde anlamlı olarak daha yüksekti pelvik stimülasyon tepkiler sergiledi ve 28. gün (p <0.05; Şekil 3) kadar belirgin olarak yüksek kalmıştır. Bakteriyel enfeksiyon arka pençe (veriler gösterilmemiştir) plantar bölgenin dokunsal duyarlılık açısından değişiklikler ile sonuçlanmıştır.
tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Şekil 1. Deneysel akış şeması. 1 x 10 8 bakteri üç günlük bir kültür tarafından hazırlanan PBS içinde süspanse ve kateterizasyon ile anestezi fareler üretra içine damlatıldı. Sonuç dokunsal allodini .04 güçleri, .16, .4, 1 ve 4 g von Frey filamentleri kullanılarak ölçüldü.
Şekil 2. Von Frey lifleri. Fare kullanarak dokunsal allodini test için Metodoloji bakteriyel enfeksiyon öncesi ve sonrası enfeksiyon gün (PID) 7, 14, 21, ve 28 test edilmiştir. Davranış Üç farklı filament stimülasyon olumlu cevap olarak kabul edildi: karın 1) keskin retraksiyonu; 2) hemen yalama veya filament stimülasyon alan kazıma;) veya 3 atlama. Tepki sık olumlu yanıt yüzdesi (10 üzerinden) ve d olarak hesaplanmıştırata yanıtı frekans ortalama yüzdesi ± SE olarak rapor edilmiştir.
Şekil 3,. UPEC bakteriler tarafından indüklenen. Dokunsal allodini viseral hiperaljezi beş kalibre güçlerinin von Frey filamentleri kullanılarak pelvik bölgenin mekanik uyarılması yanıtlar olarak ölçüldü anılacaktır. Veri pozitif cevapların ortalama yüzdeleri ± SE bakteri instilasyonu (bazal) öncesi ve PID'ler 7, 14, 21, ve 28. olarak bildirilmiştir. ANOVA UPEC ile enfekte NOD fareleri (P <0.05) test edilen bütün filamentler için başlangıçta ile karşılaştırıldığında 28 PID değerlerini 7 frekans yanıt olarak anlamlı bir artış göstermiştir. Her PID yüzde yanıt bazal yanıtları göre Tüm lifler toplam cevapları olarak hesaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UPEC ile fare prostat enfeksiyonu bakteriyel prostatit, CP / CPPS patogenezinde veya kronik inflamasyon bir predispozan olay olarak dahil olabilir olayların in vivo modelleme için sağlar. Yöntemler kadın idrar yolu enfeksiyonu 7,14 in UPEC modellerde edebiyat büyük bir gövde üzerine bakteriyel hazırlanması ve instillasyon beraberlik için nitelendirdi. Modeli potansiyel aşı adayları ve immün modülasyon mekanizmalarının test patogenezinde çalışmak için geniş uygulanabilirliği vardır. Ölçülebilir bir şekilde ağrı davranışı takip yeteneği enfeksiyon kaynaklı ağrı patogenezinde çalışma ve potansiyel ağrı tedavi test etmek için bir preklinik model olarak tanır.
Fare enfeksiyon modelinin başarısını belirleyen çeşitli kritik adımlar vardır. Sallama ve statik kültürleri ile üç günlük kültür metodu UPEC için önemli olduğu bilinen pili optimal ekspresyonu için yapılırepitel hücrelerine bağlanma. Bu UPEC tarafından başarılı organı kolonizasyonu için kritik bir adımdır. Bakteriyel büyüme için teknikler 1 x 10 8 bakteri 7 içeren tamponlu tuzlu fosfat-10 ul elde etmek için optimize edilmiş OD 420 adım ile UPEC büyüme için özellikle dizayn edilmiştir. Diğer türler veya bakteri suşlarının potansiyel olarak farklı oranlarda büyümesi ve standardizasyon 1 x 10 8 bakteri verir uygun OD türetmek için önemli olacaktır. Bakteri farklı suşlar zorlanma 14 tarafından ifade virülans faktörleri büyük oranda bağımlı durumdadır benzersiz şekilde mesane ve prostat hücreleri için uygun. Murin prostat Başarılı enfeksiyonu nedenle virulans faktörlerinin uygun tamamlayıcı bir UPEC suşu kullanımı üzerine bağımlı olacaktır. Hemen 15 dk en az hafif anestezi durumda hayvanların bakımı, enfeksiyon sonrasında bu eklentileri sağlamak önemlidirsürülmüş bakterilerin idrar normal mekanizmaları üretradan coşturup hacmi temizlemeden önce patogenezi iliştirin ve başlatmak için zaman var.
Farelerde Tactile allodini altta yatan viseral patoloji bir sonucudur ve bu gibi mükemmel konak suşu spesifisitesi ile karakterize edilir. Biz daha önce erkek NOD / ShiLtJ farelerde UPEC bir patojen aynı suşu C57BL/67 farelerde 2 allodini inducing aciz iken 3 gün içinde pik ve kronik sürekli olduğunu allodini uyardığını nitelendirdiler. Çalışmalarımız yatan neden olarak NOD / ShiLtJ farelerde otoimmün süreçlerin UPEC indüklenen hızlanma öneririz. Böylece, konak genetik arka plan dokunsal allodini geliştirilmesi için önemlidir. Allodini tarafsız ve başarılı bir ölçüm için anahtar Diğer önemli adımlar test her zaman tedavi kimliğine kör olduğunu garantileyerek, aynı test her zaman p ölçümü sorumludurdeney, gün boyunca benzer test kez kullanımı, farelerin barınma koşulları ve bir deney yanı sıra denemeleri arasındaki zaman noktalarında içinde hem standart koşulları sağlanmasında oints.
Murin enfeksiyon modelinde dikkatle sonucu yorumlanması sırasında dikkate alınması gereken sınırlamalar bir numarası vardır. Bakteriler intraurethrally mesane gibi prostat bulaştırma yeteneğine sahip damlatıldı. Bu altta yatan patoloji olarak herhangi bir sistemik veya genel parametrelerin yorumlanmasına birden organlardan olabilir zorlaştırmaktadır. Bununla birlikte, klinik prostat ve elde edilen bakteri suşlarının kullanımını hem de mesane ve prostat eş zamanlı inceleme uygun yorumlama sağlar. Buna ek olarak, enfeksiyonun metodoloji insan erkeklerde muhtemel artan enfeksiyon yöntem simüle eder.
Burada anlatılan enfeksiyon modelinde, daha önce bildirilen pri farklıdırMarily UPEC kullanılan, ana fare zorlanma ve kültür teknikleri farklılıklar 6 ve üretra 15 içine aşılamış bakterilerin hacmi zorlanma. Bu çalışmada hastalığın 2 arabuluculuk iyi karakterize prostat kaynaklı kronik prostatit UPEC suşu kullanır. Önceki çalışmalar öncelikle inceleyerek inflamasyonla ilişkili olaylar için kullanılan, ancak dokunsal allodini 6,15 açısından karakterize değildi mesane enfeksiyonları veya akut prostatit türetilen bakteri kullandık. Diğer birçok hayvan modellerinde prostatit uyardığı otoimmün mekanizmaların 5,16, hormonal manipülasyon 17 ve neonatal timektomi 18 faydalanması gerektiğini bildirilmiştir. Bu modellerin her organ-spesifik hastalık patolojisi ve önceden varolan tekniklerin kullanımı da dahil olmak üzere bazı olumlu özelliklere sahip iken CP / CPPS gerçek patogenezinde bu yöntemlerin önemi bilinmemektedir. Bunun aksine, bu yöntem insan açıklananuscript prostat hastalığının patogenezinde bir başlatıcı olduğu öne sürülmüştür potansiyel bir mekanizma ile ilgilidir. Ayrıca, CP / CPPS patogenezi anlamak için kendi programını ötesinde, teknikleri de prostatın kronik inflamasyon kurulması ve incelenmesinde yararlanılabilir ve BPH (Benign prostat hiperplazisi) ve prostat kanserinde rolü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma NIH / NIDDK hibe 1K01DK079019A2 (PT) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture tubes | BD Falcon | 352059 | |
| LB Broth Miller | EMD | EM1.10285.0500 | |
| Nalgene Centrifuge Tubes | Thermo | 3118-0050 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Catheter needle 30G | Hamilton | 91030 | |
| PE10 tubing | BD intramedic | 427400 | |
| Von Frey Filaments | Stoelting | 58025-31 |
References
- Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
- Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
- Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
- Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
- Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
- Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102 (2011).
- Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232 (2009).
- Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
- Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
- Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
- Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
- Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).
