Summary
Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.
Abstract
Proteomics Forschung enthüllt die beeindruckende Komplexität von eukaryotischen Proteom in bisher unerreichter Genauigkeit. Es ist nun eine allgemein akzeptierte Vorstellung, dass Proteine in Zellen existieren meist nicht als isolierte Einheiten, sondern üben ihre biologische Aktivität in Verbindung mit vielen anderen Proteinen beim Menschen zehn oder mehr bilden Montagelinien in der Zelle für die meisten, wenn nicht alle lebenswichtigen Funktionen. 1 , 2 Kenntnisse über die Funktion und die Architektur dieser Multiprotein Baugruppen erfordert ihre Bestimmung in höchster Qualität und ausreichender Menge für eine detaillierte Analyse. Der Mangel vieler Proteinkomplexe in Zellen, insbesondere in Eukaryonten, verbietet ihre Extraktion aus nativen Quellen und erfordert rekombinante Herstellung. Die Baculovirusexpressionsvektor System (BEVS) hat sich als besonders nützlich für die Herstellung von eukaryotischen Proteinen, deren Aktivität oft auf posttranslationale Prozessierung, dass andere häufig verwendete Ausdruck Systeme oft kannnicht unterstützt. 3 BEVS mit einem rekombinanten Baculovirus, in die das Gen von Interesse eingeführt wird, um Insekten Zellkulturen, die wiederum das Protein der Wahl infizieren wurde. MultiBac eine BEVS, die besonders wurde für die Herstellung von eukaryontischen Protein-Komplexe, die viele Untereinheiten enthalten zugeschnitten. 4 Eine wesentliche Voraussetzung für die Herstellung von Proteinen und deren Komplexe sind stabil Protokolle für alle Schritte in einem Ausdruck Experiment, das sich hervorragend als implementiert werden beteiligt Standard Operating Procedures (SOPs) und auch von Nicht-Spezialisten Nutzer vergleichsweise einfach gefolgt. Die MultiBac Plattform am European Molecular Biology Laboratory (EMBL) verwendet SOPs für alle Schritte in einer Multiproteinkomplex Ausdruck Experiment beteiligt, ab Einsetzen der Gene in einer konstruierten baculovirale Genom für die heterologe Proteinproduktion Immobilien zum kleinen Analyse des Proteins optimiert Exemplare produziert. 5-8 Die Plattformwird in einer Open-Access-Modus bei EMBL Grenoble installiert und unterstützt viele Wissenschaftler aus Hochschule und Industrie, um Protein-Komplex Forschungsprojekte beschleunigen.
Introduction
Biologische Aktivität von Anordnungen von Proteinen und anderen Biomolekülen, die gemeinsam wirken, um zelluläre Funktionen katalysieren gesteuert. Bemerkenswerte Beispiele sind die Maschinen, die die Erbinformation in der DNA in Boten-RNA enthalten transkribiert. Beim Menschen kommen mehr als 100 Proteine zusammen in einer definierten und geregelt Verfahren, um Gene zu transkribieren, wobei große Multiproteinkomplexen mit 10 und mehr Untereinheiten, einschließlich RNA-Polymerase II und der allgemeinen Transkriptionsfaktoren wie TFIID, TFIIH und andere. 9 Andere Beispiele sind die Ribosomen, die aus vielen Proteinen und RNA-Molekülen, die Proteinsynthese, oder die Kernporenkomplex die für pendelt Biomolekülen durch die Kernhülle in Eukaryoten katalysiert. Eine detaillierte Architektur und biochemische Präparation von im wesentlichen Mehrkomponenten-Maschinen in der Zelle ist wichtig, um ihre Funktion zu verstehen. Die Strukturaufklärung von prokaryotischen und eukaryotic Ribosomen, zum Beispiel, bildeten Markenzeichen Ereignisse eine beispiellose Einblicke in die Funktionsweise dieser makromolekularen Maschinen führen ihre vorgesehenen Funktionen in der Zelle. 10,11
Ribosomen in ausreichender Quantität und Qualität für detaillierte Studie durch Reinigen des endogenen Material aus kultivierten Zellen, aufgrund der Tatsache, dass bis zu 30% der Zellmasse von Ribosomen besteht, erhalten werden. RNA-Polymerase II ist bereits weniger reichlich um Größenordnungen, und viele tausend Liter Hefekultur mussten verarbeitet werden, um eine detaillierte atomare Angesichts dieser wesentlichen komplexe zentrale, um die Transkription zu erhalten. 12. Die überwiegende Mehrheit der anderen wesentlichen Komplexe sind jedoch in viel niedrigere Mengen in nativen Zellen und somit nicht ausreichend aus nativen Ausgangsmaterial gereinigt werden. Um solche Komplexe zugänglich detaillierte strukturelle und funktionelle Analyse machen erfordert heterologe Produktion durch Verwendung von rekombinanten techniques.
Produktion rekombinanter Proteine hatte einen großen Einfluss auf die Life-Science-Forschung. Viele Proteine wurden rekombinant hergestellt und deren Struktur und Funktion bei hoher Auflösung seziert. Strukturelle Genomik-Programme haben den Vorteil der Aufklärung der Genome vieler Organismen, um das Genprodukt Repertoire von ganzen Organismen in High-Throughput (HT)-Modus anzugehen. Tausende von Protein-Strukturen sind damit bestimmt. Bis heute hat die produktiv genutzten System für Produktion rekombinanter Proteine wurden E. coli, und viele Expressionssysteme entwickelt worden und im Laufe der Jahre verfeinert für die heterologe Produktion in diesem Wirt. Die Plasmide eine Fülle von Funktionalitäten zur Protein-Produktion in E. aktivieren coli füllen ganze Kataloge von kommerziellen Anbietern.
Allerdings E. coli sind bestimmte Grenzen gesetzt, die es ungeeignet für viele eukaryotische Proteine machen und in pGelenk-Protein-Komplexe mit vielen Untereinheiten. Daher wurde die Proteinproduktion in eukaryotischen Wirten immer die Methode der Wahl in den letzten Jahren geworden. Ein besonders geeignetes System eukaryontische Proteine ist das Baculovirus-(BEVS), die auf einem rekombinanten Baculovirus Durchführung der heterologen Gene für Insekten Zellkulturen im Labor gezüchtet infizieren beruht. Die MultiBac System ist ein in jüngerer Zeit entwickelt BEVS die besonders für die Herstellung von eukaryotischen Protein-Komplexen mit vielen Untereinheiten (Abbildung 1) zugeschnitten ist. MultiBac erste wurde im Jahr 2004 eingeführt. 13 Seit seiner Einführung hat MultiBac kontinuierlich verfeinert und gestrafft, um die Handhabung zu vereinfachen, verbessern Zielprotein Qualität und in der Regel machen das System für Nicht-Fachanwender durch die Gestaltung effizienter Standard Operating Procedures (SOPs). 4 MultiBac hat in vielen Laboratorien weltweit umgesetzt, in acAdemia und Industrie. Am EMBL in Grenoble, wurden grenzüberschreitenden Zugang Programme anstelle von der Europäischen Kommission bis zum Experten Ausbildung an der MultiBac Plattform für Wissenschaftler, die dieses Produktionssystem für die Förderung ihrer Forschung nutzen wollten setzen. Der Aufbau und die Funktion von vielen Protein-Komplexe, die bisher nicht zugänglich waren, indem Proben mit MultiBac produziert wurde aufgeklärt. 4 Im Folgenden werden die wesentlichen Schritte der Produktion MultiBac in Protokollen zusammengefasst, wie sie im Betrieb auf der Anlage am MultiBac EMBL Grenoble sind.
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Protocol
1. Tandem Recombineering (TR) für das Erstellen Multigen Expression Konstrukte
- Planung der Co-Expression Strategie. Design-Ansatz für die Aufnahme Ihrer Gene von Interesse in Donatoren und Akzeptoren. Mögliche physiologische Submodule Ihrer komplexen sollten zusammen auf spezifische Akzeptoren und Donatoren gruppiert werden. Verwenden Multiplikation Modul bestehend aus Homing Endonuklease (HE) - BstXI Paare Expressionskassetten auf einzelne Donor und Akzeptor Plasmide kombinieren 7,8 Erstellen Sie alle relevanten Konstrukte in silico und Validierung Strategie gründlich, bevor Sie mit experimentellen Arbeiten.. Zum Beispiel sollte die Gene von Interesse ausgewählt nicht zu enthalten HE oder andere Restriktionsstellen und die Anwesenheit der korrekten offenen Leserahmen (ORFs) validiert werden soll. Überlegen Sie daher synthetische Gene für Insekt Zelle Codonverwendung und mRNA sekundäre Struktur optimiert, um Protein-Produktion Ebenen sowie Beseitigung jeglicher exi verbessernstechen HE Websites aus den Genen von Interesse. Erwägen Sie, Reinigungs-Tags basierend auf Daten aus der Literatur über flexible oder ausgesetzt N-oder C-Termini von Proteinen Ihrer Wahl. Betrachten Sie die Anwendung polyprotein Strategien, die auf die Herstellung mehrere Protein-Untereinheiten in Ihrer komplexen zielen, wenn die relativen Mengen der einzelnen Proteine aufgrund Stöchiometrie Fragen im Komplex kontrolliert werden müssen. 4 Ausarbeitung detaillierter "How-To"-Dokument (electronic book Labor wird empfohlen) mit Alle projiziert experimentellen Schritte des Projekts im Vorfeld der vollständigen multigene Konstrukt (n). Erstellen Sie elektronische Dateien der Cre-LoxP fusionierten Plasmide zum Beispiel mit Hilfe des Cre-ACEMBLER Software, die von der Berger Gruppe Homepage (heruntergeladen werden kann www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
- Legen Sie Ihre Gene von Interesse in ausgewählte Spender undAkzeptoren durch Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase, oder alternativ durch Ligation unabhängigen Methoden nach veröffentlichten Protokollen. 5,6,14 Wenn Sie Zugang zu einem Liquid-Handling-Arbeitsplatz und wenn Sie planen, eine große Anzahl von Konstrukten erzeugt werden ( zum Beispiel für die kombinatorische Ansätze) erwägen Robotik Script entwickelt und von der Berger-Gruppe (Abbildung 2). 14,15 implementiert Wenn ein Liquid-Handling-Arbeitsplatz nicht zur Verfügung steht, ermöglicht die manuelle Bedienung über Mikrotiterplatten Geninsertion in einem HT wie Mode.
- Einschränkungen durch die Notwendigkeit, die Stöchiometrie der Untereinheiten steuern ausgedrückt auferlegt materialisieren. Im Falle der stöchiometrisch unausgewogenen Expression von einzelnen Untereinheiten eines Proteinkomplexes, in Erwägung ziehen, Polyprotein Strategien auf mehrere Untereinheiten des Komplexes und eine spezifische Protease (z. B. Tabakätzvirus NIa Protease) in einzelnen großen ORFs von s beabstandet conjoinpecific proteolytische Websites. 4,8 Betrachten Zusammenarbeit, die ein oder mehrere Polyproteine mit einzelnen Expressionskassetten wenn Sie eine sehr große Anlage mit vielen Untereinheiten und haben weit reichen Molekulargewichte der einzelnen Untereinheiten. Betrachten Koexpression mehrerer Gene, die für das gleiche Protein in ein Polyprotein oder mehrere gleiche Expressionskassetten wenn das Protein durch eine niedrige Produktion Ausbeute auszeichnet. 4,13
- Bestätigen Sie alle Donor und Akzeptor Konstrukte durch Restriktionskartierung (wahlweise in High-Throughput) und Sequenzierung geklont. Fahren Sie mit Donor-Acceptor-Kombinationen durch Cre-Rekombination LoxP verschmelzen, um die multigene Ausdruck Konstrukte der Wahl zu erzeugen. Bestätigen gereinigt Acceptor-Donor Fusion Plasmide durch Restriktionskartierung, verwenden elektronische Sequenzen durch Cre-ACEMBLER oder ähnlichen Programmen als Referenz erstellt.
- Bewahren gereinigt und validiert Spender, Akzeptoren und Donor-Acceptor Fusionen bei -20 ° C oder -80 ° C. Archiv plasmids und ihre Sequenzen (Microsoft Excel, Filemaker, etc.) sorgfältig zur späteren Verwendung.
2. Composite-Multigen Baculovirus Erzeugung, Verstärkung und Lagerung
- Integrieren multigene Transfervektoren die MultiBac baculovirale Genom durch Umwandlung in DH10-Zellen, die das virale Genom und die Funktionalitäten für Tn7 Umsetzung erforderlich. Beachten Sie, dass die MultiBac Baculovirus-Genom mit bestimmten Genen von Interesse (YFP Marker, Chaperone, etc.) in einem eigenen loxP-Stelle (entwickelt in das Genom distal zum Tn7 Bindungsstelle) durch eine in vivo Cre Reaktion vorhergehenden Tn7 Integration vorgespannt werden. 13 Nach Tn7 Umsetzung werden die Zellen mit Composite Baculovirus enthält die Gene von Interesse durch blau / weiß-Screening (erfolgreiche Tn7 Umsetzung führt zu einem Verlust von α-Komplementierung der β-Galactosidase, daher bleiben Kolonien mit richtigen Tn7 Umsetzung auf selektiven einem weißengar Platten mit X-gal) und das Genom wird durch alkalische Lyse und Ethanol / Isopropanol-Fällung hergestellt. 5,6
- Transfektion und erste Virus-Produktion. Platz 6-Well-Gewebekulturplatten in sterile Haube. Von log-Phase Sf21 Insekt Zellkultur, Samen aus Aliquots von Zellen in den Vertiefungen und Transfektion durch Zugabe des gereinigten baculovirale Genom und eine Transfektionsreagenz in Kulturmedien gemischt, wie beschrieben. 6 Ernte anfänglichen Virus nach 48-60 Stunden durch Entfernen der Medien ( hohe Qualität, niedrige Titer Virus V 0, in der Regel 3 ml pro Vertiefung). Beilage frisches Medium und Test für die Proteinproduktion (und, falls ein YFP Marker vorhanden ist, für die Fluoreszenz) nach weiteren 2-3 Tagen. 6,7
- Amplifikation von Virus, niedrige MOI Regime. Verwenden V 0 Virus auf 25-50 ml der Zellen in der log-Phase (Zelldichte <1x10 6 Zellen pro ml) in kleinen (100-250 ml) Erlenmeyer Schüttelkolben aufgeregt infizierenauf orbitale Plattform Schüttler (Abbildung 3). Zählen von Zellen aufgeteilt und alle 24 Stunden, bis die Zellen aufhören Verdoppelung (Proliferation Verhaftung). Folgen einer niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion dh Anzahl von Viruspartikeln pro Zelle) Therapie: Die Zellen müssen verdoppeln (mindestens) einmal (MOI <1), ansonsten Wiederholen Experiment mit einem kleineren Volumen V 0 zugegeben. Üblicherweise werden 3 ml V 0 verwendet, um 25 ml der Sf21 Insektenzellen mit einer Dichte von 0.5x10 6 Zellen / ml infiziert. Dies ist wichtig, um zu verhindern, nachteilig Überverstärkung und automatische Löschen von Viren, die zu einem Verlust der heterologen Genen von Interesse führen. Ernte-V 1-Virus (25-50 ml) nach 48-60 Stunden durch Pelletierung Zellen und Entfernen der Medien, die das Virus. Ergänzung mit frischen Medien und Test für YFP und Proteinproduktion durch Entfernen 1x10 6 Zellen alle 12 oder 24 Stunden, Pelletierung und Validierung von Protein-Produktion und Marker-Protein (YFP)-Signal. 6, Amplify Virus (zuV 2) weiter, wenn größere Mengen an Expression durch Infektion bis zu 400 ml Zellen in 2 L Schüttelkolben mit V 1-Virus unter Beachtung der oben genannten niedrigen MOI Regime (Zellen muss mindestens einmal verdoppeln nach Infektion mit V 1) ab. Stringent testen Proteinproduktion und Markerprotein Signal während der Amplifikation zu einer Akkumulation von defekten Viren nicht mehr mit den Genen von Interesse zu vermeiden. 5-7 Use Zellpellets akkumulieren bei jedem Schritt bereits Verstärkungen für die Festlegung Aufreinigungsprotokolle für den Ausdruck Protein-Komplex von Interesse.
- BIIC Lagerung von Produktion Virus. Wir empfehlen dringend, V 2-Virus, wie die Produktion Virus zu speichern, indem Sie die BIIC (B aculovirus-i nfected i nsect c Ellen)-Methode, um Änderungen (z. B. Verlust des Gens von Interesse) des rekombinanten Virus zu verhindern und hohe Expression bewahren Ebenes 16 Pellet infizierten Zellen 24 Stunden nach der Festnahme Proliferation beobachtet wird -. in diesem Stadium Zellen enthalten komplette Viruspartikel kurz bevor sie freigegeben (durch Knospung) in den Medien werden. Entfernen Medien und gefriergetrocknet Aliquots des Zellpellets in flüssigem Stickstoff und speichern unbegrenzt. 7,16
3. Protein Produktion und Downstream Processing
- Infizieren große (r) Kulturen und Überwachung YFP. Verwenden V 1, V 2 oder gefroren BIIC Aliquots zu größeren Zellkulturen für die Produktion läuft (in der Regel 400 ml in 2 L Flaschen) zu infizieren. Halten Sie sich an niedrigen MOI Regime (Virus anpassen Volumen für die Infektion verwendet werden, so dass infizierte Kultur verdoppelt mindestens einmal). Vergrößern infizierten Kultur Bände, wenn durch die Anzahl der Flaschen benötigt. Wenn YFP Markerprotein vorhanden ist, in definierten Abständen 1x10 6 Zellen zurückziehen, Pellet-und lysieren Zellen und überwachen Entwicklung des YFP-Signal, bis ein Plateau erreicht ist indicating maximale Produktion rekombinanter Proteine. YFP Ebenen können in einem Standard-96-Well-Platte Leser fähig zur Aufnahme Fluoreszenz-Signale (zB Tecan SPECTRAFluor) gemessen werden. Ernten Sie die Zellen in diesem Stadium. Shop Zellpellets bei -20 ° C (kurzfristig) oder -80 ° C (langfristig).
- Zelllyse und Fraktionierung. Lyse Zellen von Ihrem Lieblings-Methode der Wahl, zugeschnitten auf die Anforderungen Ihrer Protein (Frost-Tau-, Beschallung, Französisch Presse, ua). 5-7 Fraktionierung Cytosol und Zellkerne und Test für die Präsenz Ihrer Proteine von Interesse. Entwickeln Aufreinigungsprotokolle basierend auf den Ergebnissen zur Proteinreinigung zu vereinfachen. Betrachten Sie die Anwendung Einweichen Verfahren, um Ihre Protein aus dem Kernfraktion extrahieren unter hohem KCl Bedingungen, wenn Ihr Proteine im Zellkern befinden. 7,18
- Proteinreinigung (Mikro-Skala, in großem Maßstab). Beachten Sie, dass oft kleine Mengen (10 oder 25 ml) von Zellkultur-su sindizient für den Erhalt von Zell-Pellets zur Reinigung erhebliche Mengen an Ihre Proteine von Interesse aufgrund der typischerweise hohen oder sehr hohen Produktionsniveau von heterologen Proteinen in den Baculovirus / Insektenzellen-Systeme (oft 10-100 mg Protein pro L Kultur und mehr). In Verbindung mit Mikro-Reinigung (Multiwellplatten, microtip Methoden, GE Healthcare ÄKTAmicro System, etc.) ist es möglich, biochemischen und Aktivität Daten und oft auch ausreichende Menge der gewünschten Proteine und Komplexe für nanoliter Maßstab Hochdurchsatz-Kristallisation (HTX erhalten ). Betrachten unter Verwendung von Metall Affinitätsreinigung (Clonetech Takara Talon Qiagen NiNTA Metallchelator Harze) und einen Oligo-Histidin (6-10 Reste) tag auf freiliegenden Untereinheiten des Proteinkomplexes, um die Reinigung zu erleichtern, in Verbindung mit Ionenaustausch-und Größenausschluss-Chromatographie in kleinen Volumes mit zum Beispiel den ÄKTAmicro oder ein ähnliches kleines Volumen Reinigung Maschine (Abbildung 4
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Representative Results
Starke Co-Expression von heterologen Proteinen durch die MultiBac System erreicht wird in 1d (Sonden gemacht 48 h nach Infektion eines Suspensionszellkultur) gezeigt. Die überexprimiert Proteinbanden eindeutig im Ganzzellextrakt (SNP) und dem geklärten Lysat (SN) erkennbar. Die Qualität und Quantität des Proteins hergestellt ist oft ausreichend, um Strukturaufklärung von Protein-Komplexen, wie der mitotischen Checkpoint komplexen MCC in 1e gezeigt aktivieren. 17
Abbildung 2 zeigt die Work-Flow eines Gens Montage Experiment von Roboter-assistierte Tandem Rekombination (TR). Robust DNA Montage Protokolle waren in Robotik Routinen scripted für parallelisierte Montage multigene Ausdruck Konstrukte. Einzelne Schritte werden Roboter in Snap-shots (- IV 2c, I) gezeigt. Die DNA-Komponenten zusammengesetzt werden, werden durch PCR erzeugt und Qualität gesteuertE-Gele (Abbildung 2d, links); die versammelten multigene Konstrukte werden ebenfalls durch PCR mit speziell Primer-Sets (Abbildung 2d, rechts) validiert 14,15.
Rekombinanten Baculovirus Erzeugung und Verstärkung folgt standard operating procedures (schematisch in Abbildung 3a dargestellt). Momentaufnahmen von Zellen in einer Monoschicht kultiviert werden angezeigt (Abbildung 3b, I. & II.) Nach der Infektion mit einem Virus MultiBac.
Downstream Processing der rekombinanten Protein-Komplexe können durch Verwendung von Multi-Well-Platte oder microtip basierende Chromatographie zur Affinitätsreinigung durch Größenausschlusschromatographie (SEC) der Komplexe durch die Integration in den Workflow kleine Systeme wie die gefolgt miniaturisiert werden ÄKTAmicro (Abbildung 4a). Ein Vertreter SEC Profil eines ~ 700 kDa menschlichen Transkriptionsfaktorkomplexes gezeigt. Probe durch Verwendung von gereinigtemdie ÄKTAmicro in kleinem Maßstab ist in der Regel ausreichend für die Charakterisierung von biochemischen und biophysikalischen Mittel einschließlich Elektronenmikroskopie (Abb. 4b).
Abbildung 1. MultiBac Plattform-Technologie für Multiproteinkomplex Produktion. (A) Gene von Interesse in den MultiBac baculovirale Genom mit Tn7 Umsetzung in Verbindung mit blau / weiß-Screening integriert. Ein loxP-Ort auf der Rückgrat-Virus ermöglicht Zugabe weiterer Funktionen, wie ein fluoreszierendes Markerprotein Virus Leistung und heterologe Proteinproduktion überwachen. (B) Der Baculovirus nimmt einen länglichen Stab Form und wird durch eine flexible Hülle, die zur Aufnahme vermehren kann dadurch die groß (> 130 kb) zirkuläre doppelsträngige DNA-Genom. Große heterologen Geninsertionen im Genom toleriert by Verlängern des Umschlags. (c) Standard-Erlenmeyerkolben auf Schüttler Plattformen für den Anbau von großen Schildlaus Zellkulturen heterologen Protein-Produktion verwendet werden. (d) Die MultiBac System effizient produziert rekombinante Proteine, die oft deutlich sichtbar schon in der ganzen Zellextrakt (SNP). (e) Die Struktur der mitotischen Checkpoint Komplex wurde durch Röntgenbeugung von Kristallen aus der Probe mit MultiBac System. produziert 17 gewachsen aufgeklärt Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. (Automated) Tandem Recombineering (TR). (A) Tandem Rekombination nutzt kleine Arrays von synthetischen Plasmid-DNA Moleküle, so genannte Donatoren und Akzeptoren zur Montage multigene Expressionskonstrukte, gegebenenfalls in Roboter-gestützten Modus mit einem Liquid-Handling-Arbeitsplatz (rechts). (b) Der TR Workflow gezeigt. SLIC steht für Sequenz und Ligation unabhängigen Klonen, steht für die Cre Cre-LoxP Fusion Verkettung Donatoren und Akzeptoren in die Gene von Interesse durch SLIC eingefügt wurden. Multigen Ausdruck Konstrukte dieses Verfahren Rekombination mit SLIC und Cre im Tandem werden dann in den MultiBac Baculovirusgenom integriert und für die kleinen und großen Expression in Insektenzellen Zellkulturen durch das rekombinante Virus infiziert generiert. (C) Snapshots der Roboter-assistierte TR Prozess einschließlich der Bereitstellung von Matrizen-DNA und Primer (I), Herstellung von PCR-Reaktionen in Mikrotiterplatten (II), PCR-Amplifikation von DNA (III) und Herstellung von multigene Konstrukte in Bakterienkultur durch alkalische Lyse in Multiwell-Platten gewachsen gezeigt ( IV). (d) PCR-Produkte für TR verwendet werden visualisiert von unsING die E-Gel-System (links). Abgeschlossen multigene Konstrukte werden durch analytische PCR-Reaktionen auf eine E-Gel (rechts) geladen validiert. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. MultiBac Virus Erzeugung, Verstärkung, Abstellraum. (A) Die Standard Operating Procedure (SOP) des MultiBac Plattform am EMBL Grenoble ist in einer schematischen Darstellung gezeigt. Rekombinante MultiBac Virus wird durch blau-weiß Screening identifiziert und hergestellt aus Bakterienkulturen. Initial Transfektion erfolgt auf 6-well Platten mit Monoschichten aus Insektenzellen (Sf21, Sf9, Hi5, andere) ausgesät. Virus wird verstärkt und Zielprotein hergestellt in Erlenmeyer Schüttler. Virus von Aliquots der infizierten Insektenzellen (BIIC) gespeichert. Florescence wird als analytisches Werkzeug, wenn aufgezeichnetYFP (oder ein anderes fluoreszierendes Protein) als Marker-Protein beispielsweise in die loxP-Stelle auf dem MultiBac Baculovirus-Genom integriert. (B) Schnappschüsse von Insektenzellen mit Baculovirus infizierten MultiBac gezeigt. Die Zellen vermehren stoppen, in der Größe (I.) zu erhöhen. Zellfusionen beobachtet werden (II). Virus budded aus den infizierten Zellen in den Medien gesammelt und genutzt werden, um größere Zellkulturen für Protein-Komplex Produktion (III, IV) zu infizieren. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Protein komplexer Produktions-und Down-Stream-Verarbeitung. Protein-Komplex Probe kann bereits bequem von kleinen anfänglichen Zellkulturen werden durch den Einsatz miniaturisierter Reinigungsverfahren wie mehrlagig oder gereinigt microtip-basierte Reinigung, gegebenenfalls in Verbindung mit kleinvolumigen Chromatographie-Systeme (links). Oft ist die Ausbeute bereits diesen "analytische" Reinigung läuft (Mitte) ist ausreichend für die Analyse der Struktur und Funktion des gereinigten Komplexes durch eine Vielzahl von Mitteln, einschließlich Elektronenmikroskopie (rechts). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Video Snap-shots in den Abbildungen 2 und 3 zeigen den gesamten Prozess von Roboter-assistierte Generation von cDNA multigene Ausdruck baut den ganzen Weg nach Infektion von Insekten Zellkulturen für die Proteinproduktion. New Reagenzien (Plasmide und Viren) und robuste Protokolle wurden entwickelt, um eine Pipeline sich auf SOP ermöglichen. Die gesamte Pipeline wurde als Plattform-Technologie am EMBL in Grenoble umgesetzt. Die MultiBac Plattform wurde von vielen Wissenschaftlern aus Forschung und Industrie, die in der Forschung tätig sind Multiprotein zugegriffen wurde. Die Ausbildung wird von engagierten Zugang Zugang Programme von der Europäischen Kommission (P-CUBE, BioStruct-X) finanziert unterstützt.
Die Verfügbarkeit von SOPs zur Durchführung Proteinkomplex Ausdruck mithilfe des MultiBac System hat diese Technologie leicht zugänglich auch für Nicht-Spezialisten Benutzer gerendert. Roboter-assistierte Operation beschleunigt Multiproteinkomplex Produktion insbesondere, wenn eine hinreichend große Anzahl von Komplexen, z. B. Varianten und Mutanten von einer Probe von Interesse, müssen parallel erzeugt werden. Allerdings Handbetrieb bei geringen bis mittleren Durchsatz auch stark profitiert von der Verfügbarkeit von SOPs. Nach unserer Erfahrung benötigt, die Prozesse erfolgreich scripted könnte in Robotik Routinen zum ersten mit erheblichem Aufwand verfeinert werden, bis ausreichend robust Protokolle wurden erhalten, die kompatibel sind mit Hilfe eines Roboters. Solche Protokolle bilden die Grundlage unserer SOPs. 5,6,14,15 Tatsächlich ist die Umsetzung dieser robuste Protokolle für den Roboter zu einem sehr erheblichen Effizienzgewinn auch der manuellen Operationen in unserem Labor führen.
Viele Proteine und Protein-Komplexe wurden und werden produziert, indem die MultiBac System, das wir entwickelt und in der Nähe von 500 Labors weltweit haben die Reagenzien erhalten. MultiBac hat die Forschung nicht nur in der strukturellen Biologie, sondern auch in vielen ande katalysiertäh Bereichen Life Sciences, die untersuchen oder nutzen die Wechselwirkungen zwischen Proteinen in großen Baugruppen. MultiBac wurde auch verwendet, um Protein-Targets von erheblichem Interesse, einschließlich pharmakologischer Virus-ähnliche Partikel, die nützliche Impfstoffkandidaten werden kann entstehen. 4 jüngerer Zeit MultiBac auch verwendet worden, um Gene in Säugetierzellen und Zellkulturen liefern oder sogar ganze Organismen Gentherapie. 4 Wir erwarten, dass Ansätze wie die in diesem Beitrag dargestellt erweisen werden für viele Bereiche der Forschung mit Multiprotein Baugruppen und komplexe Zusammenspiel von biologischen Makromolekülen, die die Grundlage von zellulären Prozessen in Gesundheit und Krankheit bilden nützlich.
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Disclosures
IB ist Erfinder von Patenten und Patentanmeldungen Detaillierung Teile der Technologie hier beschrieben.
Acknowledgments
Wir danken Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond und alle ehemaligen und derzeitigen Mitglieder der Berger Labor für Hilfe und Beratung. Die MultiBac Plattform und deren Entwicklung wurden und werden großzügig durch die Finanzierung von Stellen, einschließlich des Schweizerischen Nationalfonds (SNF), der Agence Nationale de Recherche (ANR) und dem Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) und der Europäischen Kommission (EC) unterstützt in Rahmenprogramme (FP) 6 und 7. Unterstützung für den grenzüberschreitenden Zugang wird durch die EG-RP7-Projekte P-CUBE (vorausgesetzt www.p-cube.eu ) und BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Die Französisch Ministerium für Wissenschaft ist besonders für die Unterstützung der MultiBac Plattform am EMBL durch die Investissement d'Avenir Projekt FRISBI anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
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