Summary
단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.
Abstract
프로테오믹스 연구는 전례없는 정밀도 진핵 세포 프로테옴의 인상적인 복잡성을 밝혔다. 지금 세포에있는 단백질은 주로 고립 된 개체로하지 존재하지만, 대부분의 경우 모든 생명 기능을위한 셀의 조립 라인을 형성, 인간 10 명 이상, 많은 다른 단백질과 관련있는 생물학적 활성을 발휘하는 일반적으로 인정 개념이다. 1 이 multiprotein의 어셈블리의 기능과 구조의 2 지식은 자세한 분석을 위해 우수한 품질과 충분한 양에서의 공급이 필요합니다. 세포에서 많은 단백질 단지의 소수는 진핵 세포에서 특히 네이티브 소스에서 해당 추출을 금지하고, 재조합 생산을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)는 진핵 생물의 단백질을 생산하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다,의 활동은 종종 번역 후 처리에 의존하는 다른 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 종종 할 수있는지원하지 3. BEVS 관심의 유전자가 차례로 선택의 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양을 감염 삽입 된 재조합 배큘로 바이러스를 사용합니다. MultiBac 특히 많은 소단위를 포함하는 진핵 세포 단백질 단지의 생산을위한 맞춤형 된 BEVS이다. 4 효율적인 단백질 생산과 단지를위한 중요한 전제 조건 이상적으로 구현 될 수있는 식 실험에 관련된 모든 단계에 대한 강력한 프로토콜입니다 표준 작업 절차 (SOP)와 비교 쉽게 전문가가 아닌 사용자도 따랐다. 유럽 분자 생물학 연구소 (EMBL)에서 MultiBac 플랫폼은 단백질의 소규모 분석 외래 단백질 생산 특성에 최적화 된 설계 baculoviral 게놈에 유전자의 삽입부터 시작 multiprotein의 복잡한 발현 실험에 관련된 모든 단계에 대한 SOP를 사용 생산 시편. 5-8 플랫폼EMBL 그르노블에서 오픈 액세스 모드로 설치되어 학계 및 단백질의 복잡한 연구 프로젝트를 가속화하는 업계의 많은 과학자를 지원하고 있습니다.
Introduction
생물학적 활성은 단백질과 세포 기능을 촉진하기 위해 콘서트에서 역할을 다른 생체 분자의 어셈블리에 의해 제어됩니다. 주목할만한 예는 메신저 RNA에 DNA에 들어있는 유전 정보를 표기 기계 있습니다. 인간, 100 개 이상의 단백질이다 RNA 중합 효소 II와 같은 TFIID, TFIIH 등과 같은 일반적인 전사 인자. 9 다른 예제를 포함하여 10 더 소단위 대형 multiprotein의 단지를 형성 유전자를 속기 정의와 규제 과정에서 함께 온 리보솜, 단백질 합성, 또는 진핵 생물의 핵 봉투를 통해 생체 분자를 왕복을 담당하는 핵 기공 복합체를 촉매 많은 단백질과 RNA 분자로 구성. 셀에 기본적으로 모두 다 성분계 시스템의 상세한 건축 및 생화학 해부 그들의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 원핵 세포와 eukar의 구조 규명yotic 리보솜은, 예를 들어, 이러한 고분자 기계 셀에 자신의 지정된 기능을 수행하는 방법에 전례없는 통찰력을 항복 특징 이벤트를 창설. 10,11
리보솜은 최대 세포 질량의 30 %가 리보솜으로 구성되어 있다는 사실로 인해 배양 세포에서 내인성 물질을 정화하여 자세한 연구를위한 충분한 질과 양에서 얻을 수 있습니다. RNA 중합 효소 II는 다른 중요한 단지의 압도적 인 다수가있는 그러나 존재 이미 효모 문화의 적은 크기의 순서로 풍부한, 많은 천 리터 전사의 중심이 필수적인 복합의 세부 원자 뷰를 얻기 위해 처리해야했습니다. 12 따라서 원시 세포, 그리고 훨씬 낮은 금액 네이티브 소스 재료에서 적절하게 정제 할 수 없습니다. 자세한 구조와 기능 분석에 액세스 같은 단지를 렌더링하려면 재조합 테를 사용하여 이종의 생산을 필요로chniques.
재조합 단백질 생산은 생명 과학 연구에 큰 영향을 미쳤다. 대부분의 단백질은 재조합 생산, 그들의 구조와 기능은 높은 해상도 해부 하였다. 구조 유전체학 프로그램은 높은 처리량 (HT) 모드에서 전체 생물의 유전자 제품의 레퍼토리를 해결하기 위해 많은 생물의 게놈의 해명의 장점을 가지고있다. 단백질 구조의 수천 따라서 결정되었습니다. 지금까지, 재조합 단백질 생산을위한 가장 다산 사용되는 시스템은 E.되었습니다 대장균, 많은 발현 시스템이 호스트 외래 생산 년 동안 개발하고 세련되었다. E.에서 단백질 생산을 가능하게하는 기능의 과다를 숨겨 플라스미드 대장균 상업 제공자의 전체 카탈로그를 작성하십시오.
하지만, E. 대장균은 많은 진핵 생물의 단백질을 생산하는 것이 적합하지 않은 특정 제한 사항이 있습니다 및 P의많은 소단위와 관절 단백질 복합체. 따라서, 진핵 호스트 단백질 생산은 증가 최근 몇 년 동안 선택의 방법이되었다. 진핵 생물의 단백질을 생산하기 위해 특별히 잘 적응 시스템은 실험실에서 재배 곤충 세포 배양을 감염 외래 유전자를 운반하는 재조합 배큘로 바이러스에 의존 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)입니다. MultiBac 시스템은 특히 많은 소단위 (그림 1) 진핵 세포 단백질 단지의 생산에 맞게 조정되어 더 최근에 개발 된 BEVS입니다. MultiBac는 2004 년에 처음 도입되었다. 13는 도입 이후, MultiBac 지속적으로 세련되어 있고, 취급을 간단하게 목적 단백질의 품질을 개선하고 일반적으로 효율적인 표준 운영 절차 (SOP에)를 설계하여 비 전문가 사용자에게 시스템에 액세스 할 수 있도록하는 스트림 - 늘어서있다. 4 MultiBac는 AC에 전 세계적으로 많은 실험실에서 구현되었습니다ademia 산업. 그르노블에서 EMBL에서 다국적 액세스 프로그램은 그들의 연구를 발전이 생산 시스템을 사용하고자 과학자 MultiBac 플랫폼에서 전문적인 교육을 제공하기 위해 유럽위원회에 의해 장소에 넣어했다. 그들은 EMBL 그르노블에서 MultiBac 시설에 운영에 있기 때문에 지금까지 접근되지 않은 많은 단백질 복합체의 구조와 기능 MultiBac으로 제작 샘플을 사용하여 해명했다. 4 다음에서 MultiBac 생산의 필수적인 단계는 프로토콜에 요약되어있다.
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Protocol
1. Multigene 사 식 구문 생성을위한 텐덤 Recombineering (TR)
- 공동 식 전략 계획. 기증자와 수락 자에 관심 유전자를 삽입하기위한 설계 방법. 귀하의 복잡한 잠재적 인 생리 서브 모듈은 특정 수락 자 및 기증자에 함께 그룹화해야합니다. 개인 기증자와 수락 플라스미드에서 발현 카세트를 결합 BstXI 쌍 7,8는 실리코에 관련된 모든 구문을 생성하고 실험적인 작업을 진행하기 전에 철저하게 전략을 검증 - 원점 복귀 효소 (HE)으로 구성된 곱셈 모듈을 사용합니다.. 예를 들어, 그 유전자는 HE 또는 다른 제한 사이트 및 정확한 열린 독서 프레임 (ORF를)의 존재를 확인해야한다 포함하지 않는 것으로 확인해야합니다. 단백질 생산 수준뿐만 아니라 EXI의 제거를 향상시키기 위해 곤충 세포 코돈과 mRNA의 이차 구조에 최적화 된 합성 유전자를 주문하는 것을 고려해야HE 관심의 유전자에서 사이트 찌르기. 유연한 또는 노출 된 N-또는 선택의 단백질의 C-말단에 대한 문헌 데이터를 기반으로 정화 태그를 배치하는 것이 좋습니다. 개별 단백질의 상대적 양이 복잡한에 의한 화학 양론 문제 제어해야하는 경우 복잡한 여러 가지 단백질 소단위 생산을 목표로 polyprotein 전략을 적용하는 것이 좋습니다. "방법"문서 (전자 실험실 책을 추천합니다) 4 선발 준비합니다 포함 프로젝트의 모든 예상 실험 단계를 완료 Multigene 사 구문 (들)에 이르기까지. 버거 그룹 홈 페이지 (에서 다운로드 할 수 있습니다 크레-ACEMBLER 소프트웨어를 사용하여 예를 들어, 크레-LoxP 융합 플라스미드의 전자 파일을 생성 www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ).
- 선택한 기증자에 관심 유전자를 삽입하고제한 효소와 리가를 사용하거나, 또는 게시 된 프로토콜에 따라 내고 독립적 인 방법을 사용하여 수용체. 5,6,14 당신은 액체 취급 워크 스테이션에 액세스 할 수 있으며 경우 생성되는 구조의 큰 수 (계획 인 경우 조합 방법에 대한 예를 들어) 액체 처리 워크 스테이션을 사용할 수없는 경우 버거 그룹 (그림 2). 14,15가 개발 및 구현 로봇 스크립트를 사용하여 고려 microtitre 플레이트를 사용하여 수동 조작 패션과 같은 HT의 유전자를 삽입 할 수 있습니다.
- 표현 소단위의 화학 양론을 제어 할 필요에 의해 부과 된 제약 조건은 실현 될 수 있습니다. 단백질 복합체의 각 소단위의 화학 양 론적 불균형 발현의 경우들에 의해 간격을 하나의 큰 ORF를 귀하의 복잡한 여러 소단위와 특정 단백질 분해 효소 (예 : 담배 식각 바이러스 NIA 단백질 분해 효소)를 결합하다 할 polyprotein 전략을 적용하는 것을 고려해야pecific 단백질 분해 사이트. 4,8는 고려의 공동 표현은 여러 소단위로 매우 큰 복잡한이 널리 개별 소단위의 분자량에 이르는 경우 단일 식 카세트와 하나 또는 여러 polyproteins합니다. 고려의 공동 발현하는 단백질이 낮은 생산 수율로 특징되는 경우 polyprotein 또는 여러 개의 동일한 표현 카세트와 같은 단백질 코딩 몇 가지 유전자를. 4,13
- 제한 매핑 (선택적으로 높은 처리량)과 시퀀싱에 의해 복제 된 모든 도너와 억 셉터 구조를 확인합니다. 선택의 Multigene 사 식 구조를 생성하는 크레-LoxP 재조합에 의해 기증자 수락 조합을 융합로 이동합니다. 제한 매핑에 의해 수락 기증자 융합 플라스미드를 정제 검증, 크레-ACEMBLER 또는 참조로 유사한 프로그램에 의해 생성 된 전자 시퀀스를 사용합니다.
- -20 ° C에서 정제 및 검증 기부자, 수락 자 및 기증자 수락 융합을 저장하거나 -80 ° C. 아카이브 PLasmids 나중에 사용을 위해 신중하게 시퀀스 (Microsoft Excel에서 파일 메이커, 등).
2. 복합 Multigene 사에 배큘로 바이러스 생성, 증폭 및 저장
- 바이러스 게놈 Tn7 전위에 필요한 기능을 숨겨 DH10 세포로 변환하여 Multigene 사 전송 벡터에게 MultiBac baculoviral 게놈을 통합 할 수 있습니다. Multibac baculoviral 게놈 Tn7 통합 이전 생체 크레 반응에 의해 자신의 LoxP 사이트에서 관심있는 특정 유전자 (YFP 마커, 보호자 등) (Tn7 첨부 파일 사이트에 말초 게놈에 설계)를 미리로드 할 수 있습니다. 13 Tn7 치환 한 후, 관심있는 유전자를 포함하는 복합 배큘로 바이러스와 세포 블루 / 화이트 심사 (β-갈 락토시다 아제의 α-상보성의 손실에 성공 Tn7 전위의 결과에 의해 선택되어 있으므로, 정확한 Tn7 전위와 식민지 선택에 흰색 남아갈치 X-gal을 포함하고있는 고체 배지)와 게놈 알칼리 용해, 에탄올 / 이소프로판올 침전에 의해 준비가되어 있습니다. 5,6
- 형질 전환 및 초기 바이러스 제작. 멸균 후드에 장소는 6 - 잘 조직 배양 플레이트. 로그 상 SF21 곤충 세포 배양에서 설명 된 배양 배지에 혼합 정제 baculoviral 게놈의 transfection 시약을 추가하여 우물과 형질에있는 세포의 분주 밖으로 씨. 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 6 수확 초기 바이러스 ( 높은 품질, 낮은 역가의 바이러스 V 0, 잘 당 일반적으로 3 ML). 추가 2-3 일 에의 한 발송 후 단백질 생산을위한 새로운 미디어 및 테스트 (그리고, YFP 마커가있는 경우, 형광)을 보충합니다. 6,7
- 바이러스의 증폭, 낮은 MOI 요법. 작은 (100-250 ML) 삼각 플라스크 셰이커 동요에 로그 단계에서 세포의 25-50 ML (ML 당 세포 밀도는 <1X10 6 세포)를 감염 V 0 바이러스를 사용궤도 플랫폼 셰이커 (그림 3). 세포를 카운트하고 세포 (확산 체포) 두배을 중지 할 때까지 매 24 시간을 분할합니다. (셀 당 바이러스 입자의 감염 즉, 수의 다양성) MOI 낮은식이 요법을 따르 세포는 한 번 (MOI <1), 그렇지 않으면 V 0의 작은 볼륨 실험을 반복한다 (적어도) 두 번해야 덧붙였다. 일반적으로, V 0의 3 ㎖를 0.5x10 6 세포 / ㎖의 농도로 SF21 곤충 세포의 25 ML를 감염하는 데 사용됩니다. 이 해로운 것을 방지하는 것이 필수적입니다 이형 유전자의 손실이 발생할 수있는 바이러스에 앰프 및 자동 삭제. 세포 펠렛 및 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 수확 V 1 바이러스 (25-50 ML). 6, 1X10 6 개의 세포마다 12 또는 24 시간을 제거 펠렛 단백질 생산 및 마커 단백질 (YFP) 신호를 검증.하여 YFP 단백질 생산을위한 새로운 미디어와 시험과 보충 (에 바이러스를 증폭V 2) 더 큰 식 볼륨은 위의 낮은 MOI식이 요법 (세포가 V 1 감염 후 적어도 한 번 두 번해야합니다) 존중 V 1 바이러스 2 L 쉐이크 플라스크에 400 ML의 셀을 감염시켜 목표로하는 경우. 엄격 더 이상 관심의 유전자를 포함하지 않는 결함이 바이러스의 축적을 방지하기 위해 증폭하는 동안 단백질 생산 및 마커 단백질 신호를 테스트 할 수 있습니다. 각각의 증폭에 축적 5-7를 사용하여 세포 펠렛은 관심의 표현 단백질 복합체에 대한 정화 프로토콜을 설정하기위한 단계에서 이미.
- 생산 바이러스의 BIIC 저장. 우리는 강력하게 사용하여 제작 바이러스로 V 2 바이러스를 저장하는 것이 좋습니다 BIIC (B aculovirus - 나는 C ELL 학생을 nsect nfected) 재조합 바이러스의 수정 (관심의 유전자의 예를 들면 손실) 방지하고 높은 표현을 보존하는 방법을 수평의 확산 체포 후 24 시간이 관찰되어 16 펠렛 감염된 세포 -.들이 미디어에 (신진)에 의해 출시 될 직전에이 단계의 세포에 완료 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 액체 질소에 미디어와 세포 펠렛의 동결 분주을 제거하고 무기한 저장합니다. 7,16가
3. 단백질 생산 및 다운 스트림 처리
- 대형 (R) 문화 및 모니터링 YFP를 감염. 생산 실행 (2 L 플라스크에 일반적으로 400 ML)에 대한 더 큰 세포 배양 감염을 V 1, V 2 또는 냉동 BIIC 분주을 사용합니다. 낮은 MOI 요법 (예 :이 감염된 문화가 적어도 한 번 두 배로 감염에 사용되는 바이러스 볼륨을 조정)을 준수하십시오. 플라스크의 수를 곱하여 필요한 경우 감염된 문화 볼륨을 확대합니다. YFP 마커 단백질이 존재하는 경우, 정의 된 간격 1X10 6 개의 세포에서 철수 펠렛 세포를 용해하고 고원이 공업에 도달 할 때까지 YFP 신호의 변화를 모니터링최대 재조합 단백질 생산을 icating. YFP 수준은 형광 신호 (예를 들어 TECAN SPECTRAFluor)을 기록 할 수있는 표준 96 웰 플레이트 리더로 측정 할 수 있습니다. 이 단계에서 수확 세포. -20 ° C (단기) 또는 -80에서 보관 세포 펠렛 ° C (장기).
- 세포 용해 및 분별. 귀하의 단백질 요구 사항 (동결 - 해동, 초음파, 프렌치 프레스, 등)에 맞게 선택의 당신의 마음에 드는 방법으로 세포를 용해. 5-7 분별 세포질과 관심의 단백질의 존재에 대한 핵 및 테스트. 단백질 정제를 단순화하기 위해 결과에 따라 정화 프로토콜을 개발한다. 귀하의 단백질이 핵에있는 경우 높은 KCl을 조건으로 핵 분획에서 단백질을 추출하기 위해 적시 절차를 적용을 고려하십시오. 7,18
- 단백질 정제 (마이크로 스케일, 대규모). 세포 배양의 종종 작은 볼륨 (10, 25 ml)에 쓰입니다 점에 유의때문에 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템 (L 문화와 더 많은 당 단백질의 자주 10-100 MG)에서 외래 단백질의 일반적으로 높거나 매우 높은 생산 수준으로 관심의 단백질의 상당한 금액을 정화 세포 펠렛을 얻기위한 fficient. 마이크로 정화 (다중 웰 플레이트, microtip을 방법, GE 헬스 케어 ÄKTAmicro 시스템 등)와 함께에서 생화학 및 활동 자료와 종종 나노 리터 규모의 높은 처리량 결정에 대해 원하는 단백질과 복합체의 충분한 양 (HTX을 얻을 수있다 ). 작은의 이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 함께, 정화를 촉진하기 복잡하여 단백질의 노출 소단위에 금속 친화력 정화 (Clonetech 다카라 TALON 퀴 아젠 NiNTA 금속 킬레이트 수지)와 올리고-히스티딘 (6-10 잔류) 태그를 사용하는 것이 좋습니다 예를 들어 ÄKTAmicro 또는 유사한 작은 양 정화 기계를 (그림 4 사용 권
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Representative Results
MultiBac 시스템에 의해 달성 이종 단백질의 강력한 공동 발현은 그림 1D (서스펜션 세포 배양 감염 후 48 시간 촬영 프로브)에 표시됩니다. 과다 발현 단백질 밴드는 전체 세포 추출물 (SNP) 및 삭제 해물 (SN)에 명확하게 식별 할 수 있습니다. 생산 된 단백질 재료의 품질과 수량은 종종 그림 1E에서와 같이 같은 유사 분열 체크 포인트 복잡한 MCC 등의 단백질 복합체의 구조 결정을 가능하게하기에 충분합니다. 17
그림 2는 로봇을 이용한 탠덤 recombineering (TR)에 의해 유전자의 조립 실험의 작업 흐름을 표시합니다. 강력한 DNA 어셈블리 프로토콜은 Multigene 사 식 구조의 병렬 조립 로봇 루틴에 스크립트했다. 개별 로봇 단계는 스냅 샷 (- IV 그림 2C, I)로 표시됩니다. 조립하는 DNA의 구성 요소는 PCR에 의해 생성 및 질에 의해 제어됩니다E-젤 (그림 2D, 왼쪽은) 조립 Multigene 사 구문도 마찬가지로 프라이머의 설계 세트 (그림 2D, 오른쪽)과 PCR에 의해 확인된다 14,15.
재조합 배큘로 바이러스 생성 및 증폭 표준 운영 절차 (개략적으로 그림 3A에 표시) 다음과 같습니다. 단층 배양 세포의 스냅 샷은 MultiBac 바이러스 (그림 3B, I. 및 II주세요.) 다음과 같은 감염을 표시됩니다.
재조합 단백질 단지의 다운 스트림 처리 등과 같은 작업 흐름 작은 규모의 시스템으로 통합하여 단지 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 다음 친화력 정화 다 잘 판 또는 microtip을 기반 크로마토 그래피를 사용하여 소형화 할 수있다 ÄKTAmicro (그림 4A). ~ 700 kDa의 인간 전사 인자 복합체의 대표적인 SEC 프로파일이 표시됩니다. 샘플을 사용하여 정제작은 규모의 ÄKTAmicro는 전자 현미경 (그림 4b) 등의 생화학 및 생물 물리학 적 방법으로 특성화 일반적으로 충분합니다.
그림 1. multiprotein의 복잡한 생산 MultiBac 플랫폼 기술. (A) 그 유전자는 블루 / 화이트 심사와 함께 Tn7 트랜스를 사용하여 Multibac baculoviral 게놈에 통합됩니다. 바이러스 백본에 LoxP 사이트는 형광 마커 단백질과 같은 추가 기능의 추가는 바이러스 성능과 외래 단백질 생산을 모니터링 할 수 있습니다. (B) 배큘로 바이러스는 길쭉한 스틱 형태를 채택하고 수용 할 수 있도록 보완 할 수있는 유연한 봉투에 의해 특징입니다 큰 (> 130킬로바이트) 원형 이중 가닥 DNA 게놈. 게놈에 큰 외래 유전자 삽입은 B 용납된다y는 봉투를 길게. (C) 궤도 셰이커 플랫폼의 표준 삼각 플라스크가 heterologues 단백질 생산을위한 대규모 곤충 세포 배양 성장을 위해 사용될 수있다. (D) MultiBac 시스템이 효율적으로 이미 종종 명확하게 볼 수 있습니다 재조합 단백질 생산 전체를 세포 추출물 (SNP). (E) 유사 분열 체크 포인트 복합체의 구조 MultiBac 시스템. 17으로 제작 샘플에서 성장 결정의 X-선 회절에 의해 밝혀 한 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. (자동) 직렬 Recombineering (TR). () 직렬 recombineering는 배수 조립 기증자와 수락 자 합성 플라스미드 DNA 분자의 작은 배열을 불리는 활용igene 식 구문은 선택적으로 로봇을 이용한 모드에서 액체 취급 작업장 (오른쪽)를 사용하여. (B) TR 워크 플로가 표시됩니다. SLIC가 순서와 결찰 독립적 인 복제를 의미, 크레 관심의 유전자가 SLIC가 삽입 된 넣을 크레-LoxP 융합 연결하는 기증자와 수락 자를 의미합니다. Multigene 사 식은 다음 MultiBac 배큘로 바이러스의 게놈에 통합 재조합 바이러스에 감염된 곤충 세포 배양에서 크고 작은 규모의 표현에 사용되는 직렬로 SLIC와 크레을 사용하여이 recombineering 절차에 의해 생성 된 생성합니다. 로봇을 이용한 TR의 (C) 스냅 샷 과정 (멀티 웰 플레이트에 알칼리 용해에 의해 세균 배양에서 재배 된 구문 템플릿 DNA와 프라이머 (I), 다중 웰 플레이트 (II), PCR의 DNA를 (III)의 증폭 및 Multigene 사의 준비 PCR 반응 준비의 제공을 포함하여 표시됩니다 IV는). (D) TR에 사용되는 PCR 제품은 저희에 의해 시각입니다전자 젤 시스템 (왼쪽) ING. 완료 Multigene 사 구문은 전자 젤 (오른쪽)에로드 분석 PCR 반응에 의해 검증됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. MultiBac 바이러스 발생, 증폭, 저장. () EMBL 그르노블에서 MultiBac 플랫폼의 표준 운영 절차 (SOP)의 모식도에 표시됩니다. 재조합 MultiBac 바이러스는 블루 - 화이트 심사에 의해 식별 및 세균 배양에서 준비가되어 있습니다. 최초의 형질 전환 곤충 세포의 단층 (SF21, SF9, Hi5는, 등)에 파종 6 - 잘 접시에 일어난다. 바이러스는 삼각 쉐이커에서 증폭 및 대상 단백질 생산됩니다. 바이러스는 감염된 곤충 세포의 동결 분주 (BIIC)로 저장됩니다. 개화는 분석 도구처럼 기록된다YFP (또는 다른 형광 단백질) MultiBac baculoviral 게놈 loxP 사이트의 존재에 예를 들어, 마커 단백질로 통합되었습니다. (B) MultiBac 배큘로 바이러스에 감염된 곤충 세포의 스냅 샷이 표시됩니다. 세포가 증식 정지, 크기 (I.) 증가. 세포 융합은 (II) 관찰된다. 미디어에 감염된 세포 떨어져 싹 바이러스가 수집 및 단백질의 복잡한 생산 (III, IV)를위한 큰 세포 배양을 감염하는 데 사용됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 단백질의 복잡한 생산 및 다운 스트림 처리. 단백질 복합체 샘플은 이미 편리와 같은 다중 벽 또는 소형 정화 방법을 활용하여 작은 규모의 초기 세포 배양에서 정제 할 수 microtip을을선택적 작은 볼륨 크로마토 그래피 시스템 (왼쪽)와 함께 기반의 정화. 종종 이미 이러한 "분석"정화 실행 (가운데)의 수율은 전자 현미경 (오른쪽) 등 다양한 방법으로 정제 단지의 구조와 기능 분석을위한 충분합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
그림 2와 3의 비디오 스냅 샷 Multigene 사 표현의 cDNA를에서 로봇을 이용한 세대에서 전체 프로세스를 설명하는 단백질 생산을위한 곤충 세포 배양 감염으로 모든 방법을 구성합니다. 새로운 시약 (플라스미드 및 바이러스) 및 강력한 프로토콜을 표준 운영 절차에 의존하는 파이프 라인을 사용하기 위해 개발되었습니다. 전체 파이프 라인은 그르노블에서 EMBL에서 플랫폼 기술로 구현되었습니다. MultiBac 플랫폼은 multiprotein의 연구에 종사하는 학계 및 업계의 많은 과학자들에 의해 읽혔습니다. 교육 접근은 유럽위원회 (P-CUBE, BioSTRUCT-X)에 의해 자금 전용 액세스 프로그램에 의해 지원됩니다.
MultiBac 시스템을 사용하여 단백질의 복잡한 표현을 수행하는 SOP를 여부는 전문가가 아닌 사용자도 쉽게 의무가이 기술을 렌더링하고있다. 로봇을 이용한 작업 partic에 multiprotein의 복잡한 생산을 가속화ular 때 단지 충분히 큰 숫자가, 그 표본의 예 변종과 돌연변이에 대한 병렬로 생성 할 필요가있다. SOP에의 이용에서 그러나 낮은 중간 처리에서 수동 조작도 크게 혜택을 제공합니다. 충분히 강력한 프로토콜이 로봇을 사용하여와 호환되는 얻을 때까지 우리의 경험에서, 로봇 루틴에 성공적으로 스크립팅 할 수있는 과정은 상당한 노력과 첫 번째 정제 할 필요가 있었다. 이러한 프로토콜은 우리의 SOP를의 기초를 형성합니다. 5,6,14,15, 실제로 로봇이 강력한 프로토콜의 구현 우리 연구실에서도 수동 작업의 매우 상당한 효율 증가로 이어집니다.
많은 단백질과 단백질 복합체가 있었고, 생산되고 우리가 개발 한 MultiBac 시스템을 사용하여, 그리고 전세계에 가까운 500 실험실 시약을 획득했습니다. MultiBac는 구조 생물학뿐만 아니라 많은 OTH에서뿐만 아니라 연구를 촉진하고있다조사 또는 큰 어셈블리의 단백질 사이의 상호 작용을 악용 생명 과학의 어 영역. MultiBac도가 최근에 4 MultiBac 또한 포유 동물 세포 및 세포 배양에 유전자를 전달하는 데 사용되었습니다. 유용한 백신 후보가 될 수 바이러스 같은 입자를 포함한 많은 약물 관심의 단백질 표적을 생산하는 데 사용, 또는 전체 생물되었습니다 유전자 치료 4. 우리는 이와 공헌에 나와있는 것과 같은 접근 방식 multiprotein의 어셈블리 및 건강과 질병에서 세포 프로세스의 기초를 형성 생물학적 거대 분자의 복잡한 상호 작용에 관련된 연구의 많은 분야에 유용하다는 것을 증명 것으로 예상.
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Disclosures
IB는 여기에 설명 된 기술의 일부를 자세히 설명 특허 및 특허 출원에 발명가이다.
Acknowledgments
우리는 크리스토프 Bieniossek, 사이먼 Trowitzsch, 다니엘 피츠 제럴드, 유이치로 타카, 크리스티안 Schaffitzel, 이본 Hunziker, 티모시 리치몬드와 도움과 조언 버거 실험실의 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. MultiBac 플랫폼과 개발했습니다 아낌없이 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 직원은 국립 공들인 (ANR)와 센터 국립 공들인 Scientifique (CNRS)와 유럽위원회 (EC) 등의 자금 지원 기관에서 지원하는 프레임 워크 프로그램 (FP) 6과 7. 다국적 액세스에 대한 지원은 EC FP7 프로젝트 P-CUBE (에 의해 제공됩니다 www.p-cube.eu )와 BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). 과학의 프랑스 교육부는 특히 투자 회사 디 Avenir에서 프로젝트 FRISBI 통해 EMBL에서 MultiBac 플랫폼을 지원하기 위해 인정 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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