Summary
عالية الدقة الأشعة السينية التصوير المقطعي (HRCT) هو غير مدمرة تقنية التصوير التشخيصي التي يمكن استخدامها لدراسة بنية ووظيفة الأوعية الدموية النباتية في 3D. نحن لشرح كيفية HRCT يسهل استكشاف شبكات الخشب عبر مجموعة واسعة من الأنسجة النباتية والأنواع.
Abstract
عالية الدقة الأشعة السينية التصوير المقطعي (HRCT) هو غير مدمرة تقنية التصوير التشخيصي مع القدرة على القرار شبه ميكرون التي يجري الآن استخدامها لتقييم بنية ووظيفة شبكة الخشب المصنع في ثلاثة أبعاد (3D) (على سبيل المثال برودرسن وآخرون . عام 2010؛ 2011؛ 2012a، ب). ويستند HRCT التصوير على نفس المبادئ نظم CT الطبية، ولكن النتائج ارتفاع كثافة السنكروترون مصدر الأشعة السينية في دقة أعلى المكانية وانخفض الصورة اكتساب الوقت. هنا، علينا أن نبرهن بالتفصيل كيف السنكروترون القائم الذي يتم استخدامه HRCT (أجريت في بيركلي المصدر، LBNL الضوء المتقدم، CA، الولايات المتحدة الأمريكية) بالاشتراك مع برنامج Avizo (VSG شركة، برلنغتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) لاستكشاف الخشب المصنع في رفعه الأنسجة والنباتات الحية. هذه الأداة تتيح للمستخدمين تصوير جديدة لتجاوز التقليدية الخفيفة، ثابت 2D أو micrographs الإلكترون وعينات الدراسة باستخدام مقاطع مسلسل الظاهري في أي طائرة. عدد لا حصر له من شرائح في أي اتجاه جيتم إجراء على نفس العينة، وهي الميزة التي من المستحيل جسديا باستخدام أساليب المجهر التقليدية.
النتائج تظهر التي يمكن تطبيقها على كل من HRCT العشبية والنباتات الخشبية، ومجموعة من أجهزة النبات (أوراق أي أعناق، وينبع، جذوع وجذور). الأرقام الواردة هنا مساعدة في توضيح كل مجموعة من النباتات التشريح ممثل الأوعية الدموية ونوع من التفاصيل المستخرجة من قواعد البيانات HRCT، بما في ذلك المسح الضوئي للساحل الخشب الأحمر (سيكويا sempervirens)، والجوز (جاجلانس النيابة.)، والبلوط (البلوط SPP)، والقيقب ( شتلات شجرة أيسر النيابة.) لعباد الشمس (هيليانثوث)، الكرمة (كرمة SPP)، والسراخس (Pteridium aquilinum والخملية Woodwardia). عينات رفعه وتجفيفها من الأنواع الخشبية هي أسهل لمسح وتسفر عادة أفضل الصور. ومع ذلك، فقد جعلت التحسينات الأخيرة (أي أكثر سرعة المسح الضوئي والاستقرار عينة) من POSSible لاستخدام هذه التقنية التصور على الأنسجة الخضراء (مثل أعناق) والنباتات الحية. في بعض الأحيان فإن بعض انكماش الأنسجة النباتية الخضراء رطب تسبب طمس الصور إلى وسائل لتجنب وصفها هذه القضايا. هذه التطورات الأخيرة مع HRCT تقديم رؤى جديدة واعدة في وظائف الاوعية الدموية النبات.
Introduction
ويتم نقل المياه من جذور النباتات إلى الأوراق في الأنسجة الوعائية ودعا الخشب - شبكة من خطوط الأنابيب مترابطة، والألياف، وعملية الأيض نشطة الخلايا الحية. يجب الحفاظ على وظيفة نقل الخشب مصنع لتوريد المواد الغذائية والمياه إلى أوراق لعملية التمثيل الضوئي والنمو والبقاء في نهاية المطاف. يمكن أن تتعطل النقل المائي في قنوات الخشب عندما يتم اختراق شبكة عن طريق الخشب الكائنات المسببة للأمراض. ردا على النباتات الإصابات غالبا ما تنتج هذه المواد الهلامية، واللثة، وtyloses كوسيلة لعزل انتشار العوامل المسببة للأمراض (مثل McElrone وآخرون 2008؛ 2010). يمكن الضغط الجفاف أيضا إلى الحد من نقل المياه في الخشب. كما تفقد النباتات الماء خلال الجفاف الذي طال أمده، والتوتر يبني في SAP الخشب. المياه تحت التوتر هو متبدل الاستقرار (أي في عتبة معينة التوتر يصبح التجويف كبيرة بما يكفي لأعمدة المياه الواردة في قنوات الخشب). بعد التجويف يحدث، يمكن للفقاعة الغاز (الانسداد) تشكيل وملء كوندUIT، ومنع بشكل فعال حركة المياه (Tyree وسبيري 1989)، وهي ظاهرة مشابهة لمرض الضغط (أي "ينحني") في أعماق البحار الغواصين.
على الرغم من أهمية المياه النقل الخشب مصنع لوظيفة الأمثل كما هو موضح من قبل هيئة واسعة من المؤلفات التاريخية والمعاصرة حول هذا الموضوع (Tyree وزيمرمان، 2002؛ هولبروك وآخرون، 2005)، لا تزال هناك جوانب شبكات الخشب التي لا تزال بعيدة المنال . وقد بدأت العديد من المجموعات البحثية مؤخرا باستخدام عالية الجودة الأشعة السينية التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة (HRCT) لتقييم التفاصيل الدقيقة للتشريح الخشب والأنسجة الوعائية (مثل مايو كلينيك وآخرون؛ 2010، 2008؛ Mannes وآخرون 2010؛ برودرسن وآخرون 2010. ، 2011، 2012a، ب؛ مايدا ومياكي، 2009؛ السهوب وآخرون 2004). HRCT هي تقنية تستخدم لتصور غير تدميري الميزات في الداخل من الأجسام الصلبة والحصول على معلومات رقمية على خصائص 3-D على الهيكلية. HRCTيختلف عن التقليدية الطبية مسح-CAT في قدرتها على حل تفاصيل صغيرة مثل ميكرون في الحجم، حتى بالنسبة للكائنات ذات الكثافة العالية. وقد تحسنت التطورات الحديثة في تكنولوجيا HRCT السنكروترون دقة وضوح الصورة وإشارة إلى نسبة الضوضاء حتى بما فيه الكفاية أن شبكات اتصالات سفينة النباتية وintervessel يمكن تصور، تعيين إحداثيات 3D، وتصديرها لنماذج المحاكاة الهيدروليكية. برودرسن وآخرون (2011) تقدمت مؤخرا هذه التقنية من خلال الجمع بين عمليات إعادة البناء التي تم إنشاؤها بواسطة 3D HRCT السنكروترون مع نموذج فورتران الذي يستخرج البيانات تلقائيا من الشبكة الخشب في قرار أعلى بكثير من أي وقت مضى كان ممكنا بالوسائل التشريحية التقليدية (أي تقطيع المسلسل مع مشراح والتقاط الصور مع المجهر الضوئي، على سبيل المثال زيمرمان 1971). كما تم استخدام هذا العمل لتحسين النماذج الهيدروليكية لنظام الخشب وتحديد الخصائص الفريدة للنقل (أي التدفق العكسي في بعض هاءssels خلال فترات الذروة من النتح) (لي وآخرون، في الاستعراض).
ويمكن الآن أن تستخدم السنكروترون HRCT لتصور وظيفة الخشب، القابلية للالتجويف، وقدرة النباتات على اصلاح قنوات embolized. الفشل في إعادة التدفق في قنوات embolized يقلل القدرة الهيدروليكية، والتمثيل الضوئي حدود، والنتائج في موت النباتات في الحالات القصوى (ماكدويل وآخرون 2008). يمكن للنباتات التعامل مع الصمات من خلال تحويل المياه حول انسداد قنوات الاتصال عبر حفر الوظيفية المجاورة، والتي تنمو جديدة لتحل محل الخشب القدرة الهيدروليكية المفقودة. بعض النباتات تمتلك القدرة على إصلاح فواصل الأعمدة في الماء، ولكن تفاصيل هذه العملية في الخشب تحت التوتر ظلت غير واضحة على مدى عقود. برودرسن وآخرون (2010) تصور مؤخرا وكميا عملية إعادة تعبئتها في الكرمة الحية باستخدام HRCT. كان ناجحا السفينة تعتمد على تدفق إعادة تعبئة المياه من الخلايا الحية المحيطة xylأجبرت قنوات م، حيث قطرات الماء الفردية توسعت مع مرور الوقت، والأوعية شغلها، وتفكك الغاز شرك. يتم حاليا قدرة النباتات المختلفة لإصلاح السفن للخطر والخشب آليات السيطرة على هذه الإصلاحات التي يجري التحقيق فيها.
وصف للمرفق ALS Beamline 8.3.2
وقد أجريت عملنا حتى الآن على Beamline الصلب الصغرى، التصوير المقطعي بالأشعة السينية 8.3.2 في مصدر الضوء متقدمة في مختبر لورانس بيركلي الوطني (بيركلي CA USA). توضع العينات النباتية في قفص متر الرصاص مبطنة 20 يقع من مصدر الأشعة السينية، التي تم إنشاؤها بواسطة مغناطيس فائق التوصيل تسلا 6 منحنى ثنائي القطب في مصدر الضوء المتقدم التشغيل الإلكترون خاتم تخزين الطاقة الحرجة في قدرها 11.5 كيلو. ويرد التخطيطي لمحطة النهاية في الشكل 1. والأشعة السينية يدخل القفص مع حجم 40X شعاع من ~ 4.6 ملم وتمر من خلال العينة التي يتم تركيبه على آلية المرحلة الدورية. الالمنقولة الأشعة السينية تؤثر على ماض الكريستال (اثنان المواد المستخدمة شيوعا هي LuAG أو CdWO 4) التي تحول الأشعة السينية إلى الضوء المرئي التي يتم ترحيل عبر العدسات في الصعود إلى CCD لجمع الصور. وترد الكاميرا، وماض والبصريات في مربع ضيق الضوء الذي هو على القضبان التي تسمح ليكون الأمثل المسافة عينة إلى ماض للتصوير النقيض المرحلة.
هي التي شنت جميع العينات على المسرح بقطر 10 سم الدوارة والتي بدورها هي التي شنت على مراحل الترجمة الأفقي والرأسي لتحديد المواقع العينة. ويمكن الاطلاع على عينة النباتية الحية، مع نظام الجذر التي تقام في بناء مصنع مخصص عاء حامل وأوراق الشجر الواردة في أنبوب الاكريليك، في الشكل 2. يمكن التعرض مرات نموذجية تتراوح 1-0،1 ثانية باستخدام 10-18 كيلو، وفترات الفحص وتتراوح 5-40 دقيقة اعتمادا على إعدادات الأمثل لعينة معينة. لعينات طويل القامة (نموذجي من الخشب المصنع الشبكات)، ويمكن مسح البيانات تكونمبلطة بتكرار القياس مع العينة على ارتفاعات مختلفة، والتي يتم التحكم تلقائيا، مما يتيح أقسام المسلسل سلس جنبا إلى جنب على ارتفاع الحد الأقصى لعينة 10 سم ~. أقصى عرض عينة عند التصوير في القرار ميكرومتر ~ 4.5 هو 1 سم للعينات التي هي مثالية تقريبا في اتجاه رأسي. اكتمال البيانات وتجهيز جيل باستخدام بروتوكول المذكورة أدناه. بسبب الفرق في توهين الأشعة السينية بين الهواء والماء، يمكن الحصول على تباين الصورة ممتازة في النباتات دون استخدام الحلول النموذجية النقيض من نظم CT الطبية. التجويف سفينة مليئة بالهواء يمكن تمييزها بسهولة من الأنسجة المحيطة مملوءة بالماء في النباتات المائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كتبت تفاصيل بروتوكول موضح أدناه خصيصا للعمل في beamline الضوء المتقدم 8.3.2 المصدر. قد تكون هناك حاجة للعمل تعديلات في مرافق السنكروترون أخرى. مطلوب السلامة المناسبة والتدريب للإشعاع استخدام هذه المرافق.
1. تحضير العينة للنباتات لايف
- تنمو النباتات في الأواني قطر ~ 10 سم، وضمان أن يتم توسيط كما الجذعية الرئيسية (أو جزء من المصنع ليتم فحصها) ممكن وموجه عموديا في وعاء. الأبعاد المادية للقفص صك HRCT في حدود الخفيفة المصدر المتقدم يعيش النباتات لم 1 ~ في الارتفاع. ونتيجة لذلك، يتم تنفيذ أفضل تصوير النباتات الحية على الشتلات / الشتلات نمت في الأواني الصغيرة. اعتمادا على التجربة، ويمكن استخدام أنواع مختلفة من التربة للسيطرة على رطوبة التربة (على سبيل المثال في التجارب الجفاف)، وبالنسبة لبعض النباتات مع براعم مرنة (مثل الكروم) يعد يطلق النار يمكن أن يكون بعناية تووصف للو في أنبوب الاكريليك أدناه (أنظر الشكلين 1 و 2).
- تحميل بوعاء النباتات الحية في حسب الطلب الألمنيوم وعاء حامل جامدة. ويمكن تعديل ارتفاع أعلى لوحة لاستيعاب مجموعة واسعة من مرتفعات عاء. تم تصميم الجزء العلوي من لوحة لتتماشى مع الجزء العلوي من سطح التربة، ويبرز نبات من وسط لوحة من جزئين. والغرض من هذا هو وعاء حامل لضمان عقد الجذعية النباتية ثابتا في مكانه لتقليل الاهتزاز أو الحركة العينة. التقليل من الحركة أثناء الفحص عينة أمر ضروري.
- شنت مرة واحدة في حامل، وقياس الجهد المائي الجذعية أو النتح باستخدام ورقة ضغط نمط Scholander غرفة أو مقطع على. porometer ورقة، على التوالي، للوقوف على الحالة الفسيولوجية للنبات قبل المسح
- وضع اسطوانة رقيقة الجدران الاكريليك على النبات وعلى رأسها صاحب مصنع الألمنيوم وضمان الحصول عليها في مكان مع المعجون الطين لتحقيق الاستقرار فيالعينة (الشكل 2). وستحال أي اهتزاز أو الحركة من أوراق الشجر العلوي إلى أسفل الساق وتتسبب في الأنسجة النباتية داخل المنطقة الممسوحة ضوئيا للتحرك، مما يؤدي في النهاية إلى تشويه الصورة. يتم استخدام الاسطوانة لاحتواء أوراق الشجر نبات ومنع أوراق النباتات من فرك ضد قطع أخرى من المعدات في قفص التي من شأنها أن تؤدي إلى اهتزازات أثناء الفحص. وينبغي استخدام الاغطية البلاستيكية إضافية، مناشف ورقية، والشريط لتقليل الاهتزاز وزيادة حركة أجزاء النبات (انظر المشاكل المرتبطة حركة عينة في الشكل 4). للحد من امتصاص الأشعة السينية (التي يمكن أن تقلل من جودة الصورة في وقت التعرض معين)، وينبغي أن تحتوي الاسطوانة وكذلك جدران رقيقة ممكن مع الحفاظ على صلابة كافية لأداء وظيفتها.
- إرفاق وعاء حامل مخصص للهواء والمنصة وقفله (المسمار) في مكان بين المصدر الأشعة السينية وأجهزة الاستشعار والتصوير معدات التصوير. Positiعلى الجذعية والرأسي ممكن وعلى قاعدة مركز تشاك المغناطيسي للتأكد من العينة يبقى في مجال الرؤية أثناء الدوران.
2. تحضير العينة لالطازجة والأنسجة النباتية رفعه
- يمكن مسحها المواد النباتية الطازجة والسيقان عادة أو أعناق، بعد إزالة فورية من نبات حي. يجب إذا كان القصد من التجربة هو لتصور مجمل الماء الخشب، الشبكة داخل الأوعية سيتم اجلاؤهم واستبدالها بالهواء. للقيام بذلك، قم بتركيب العينة في غرفة الضغط Scholander الأسلوب ودفع الهواء المضغوط أو النيتروجين من خلال العينة تحت ضغط منخفض (<0.05 ميجا باسكال) لحوالي 5 دقائق. سوف تختلف الأنواع في الوقت اللازم لإخلاء السفينة الشبكة. إذا كان القصد من ذلك هو تقييم مدى الانسداد في تشكيل الأنسجة النباتية الطازجة، ثم عينات من نبات المكوس باستخدام شفرة حلاقة جديدة وجعل التخفيضات تحت الماء.
- التفاف العينة في طبقة من Parafilm إلى العلاقات العامةجفاف حدث أثناء الفحص.
- تحميل عينة في ظرف الحفر مثبتة في لوحة معدنية التي هو مشدود في الهواء تحمل المرحلة. مركز وتوجيه العينة عموديا كما هو موضح أعلاه لضمان عينة يبقى في مجال الرؤية.
3. تحضير العينة لأنسجة ودي مجففة
- لأنسجة الأمثل التصور العينة وتباين الصورة، من الضروري يذوى ببطء الأنسجة الخشبية كامل العينة. قطع العينات إلى حوالي 6 سم في الطول. حدد العينات التي هي كما مستقيم ممكن في المنطقة المستهدفة والمسح الضوئي ويبلغ قطرها 1 سم ≤.
- ضع عينة الأنسجة الخشبية في فرن التجفيف في درجة حرارة منخفضة لتجف ببطء العينة دون أن تسبب أي تكسير أو تقسيم الأنسجة. هذه العملية من المرجح أن تختلف بين الأنواع والأنسجة. لودي ينبع، 12 ساعة في فرن 40 C ° عادة كافية لتوفير تباين رائع دون أن تسبب تشا كبيرةnges في الهيكل المادي من الجذع (انظر مشاكل مع التجفيف السريع تظاهروا في الشكل 3).
- في بعض الحالات من المستحسن أن يكون علامة الائتمانية ضمن العينة بحيث تشريح اللاحقة والتصور مع المجهر الإلكتروني يمكن أن تكون موجهة نحو نقطة محددة في الصورة HRCT. للقيام بذلك، يضعوا معدن أو زجاج أو سلك حبة إلى خارج الجذعية باستخدام Parafilm. طريقة أخرى هي استخدام الراتنج السيليكون (على سبيل المثال RTV-141، بلوستار سيليكونات، برونزويك الشرق، NJ) التي يمكن حقنها في قناة واحدة الخشب (انظر الأمثلة في برودرسن وآخرون 2010). تصلب مرة واحدة، وراتنج سيليكون مرئيا بوضوح في العينة وتتميز بسهولة من السفن مليئة بالهواء أخرى. استخدام هذه العلامة لتحديد مناطق محددة بدقة من العينة.
- تحميل عينة في ظرف الحفر ومركز على النحو المبين أعلاه.
4. تحضير العينة للأوراق Tissuه لاثنين Radiograms (2D) الأبعاد
- لتصور محتويات السفينة في الأوراق في شبه الوقت الحقيقي، يمكن فحص الأوراق لإنتاج صورة إشعاعية 2D، على غرار الأشعة السينية الأسنان. تحميل ورقة بين لوحين من البلاستيك الاكريليك رقيقة، وتأمين حواف مع لقطات. ثم إرفاق نموذج لنصرة نظام ما بعد حامل وموقف اللوح البصرية إلى جانب نظام التصوير ومصدر الأشعة السينية.
5. مسح العينة في القفص 8.3.2
- تقرر التكبير من شأنها أن تعمل على أفضل وجه للتطبيق الخاص بك. ALS Beamline 8.3.2 لديها القدرة على مسح مع العدسات مع تكبير من 5X، 2X، و 10x. هذه النتيجة في أحجام بكسل صورة 4.5، 2.25، وميكرومتر 0.9، على التوالي. اعتمادا على التكبير، يجب أن تكون العينة من الحجم المناسب، حيث أن مجال الرؤية يتناقص مع زيادة التكبير. لمعرفة تفاصيل اختيار الكاميرا والعدسة والصورة الناتجة المعلمات في الجدول 1.
| PCO.4000 (4008x2672) | PCO.Edge (2560x2160) (OPTIQUE بيتر) | |||
| عدسة | بكسل (ميكرومتر) | مجال الرؤية (مم) | بكسل (ميكرومتر) | مجال الرؤية (مم) |
| 10X | 0.9 | 3.6 | 0.65 (0.69) | 1.7 (1.7) |
| 5X (4X) | 1.8 | 7.2 | 1.3 (1.72) | 3.3 (4.4) |
| 2X | 4.5 | 18 | 3.25 (3.44) | 8.3 (8.8) |
| 1X | 9 | 36 | 6.5 (-) | 16.6 (-) |
الجدول 1. التفاصيل المتعلقة المتاحةالكاميرات والعدسات في ALS 8.3.2.
- تعيين الطاقة الأشعة السينية إلى 15 كيلو. وقد تبين هذا ممتاز لتوفير تباين الصورة لمعظم تطبيقات النبات (انظر برودرسن وآخرون 2010، 2011، 2012a، ب). مرات التعرض بشكل عام تعتمد على سمك وكثافة العينة (وبالتالي التكبير المستخدمة) مجموعة ما بين 100 و 1،000 ميللي ثانية. وسوف تعرض أوقات أطول (طالما لا تشبع بكسل كاشف) يؤدي عادة إلى ارتفاع إشارة إلى نسبة الضوضاء، ولكن على حساب زيادة مرات الفحص.
- اختيار طريقة الزاوي الذي يتناسب مع التطبيق الخاص بك. وتناوب 180 درجة عينات أثناء الفحص، وعدد من الصور التي التقطت أثناء الدوران يمكن أن يكون لها تأثير كبير على حجم وطول، مجموعة البيانات من الفاصل الزمني المسح الضوئي، وجودة الصورة النهائية، ولكن هناك آخذة في التناقص عموما العوائد في الجودة. يتم تنفيذ المسح نموذجية في زيادات ° 0.25، مما أسفر 721 صورة لكل المسح الضوئي. خفض incremenر إلى نتائج أفضل في 0،125 ° صور لتصور التفاصيل الدقيقة، ولكن غلة 1440 الصور وبالتالي مجموعة بيانات أكبر من ذلك بكثير (بالنسبة لمنطقة نموذجية من الفائدة، وهذا يعني ~ 10-30 غيغابايت من البيانات مقابل GB 5). ومع ذلك، تم تحسين كثير من الأحيان إشارة إلى نسبة الضوضاء ويستحق كل وقت الفحص وزيادة حجم البيانات. يمكن أن يتعرض ينبع الجافة التي من غير المرجح أن تشوه / يتقلص أثناء الفحص لفترات أطول (أصغر مقدار الزاوي) دون حساب. عندما النباتات الحية التصوير، حيث العمليات البيولوجية (مثل إصلاح الانسداد) تجري على مقاييس زمنية قصيرة، واختارت لفترات أقصر من الأفضل مسح للحد من الآثار الضارة المحتملة للإشعاع الأشعة السينية على هذا النسيج، ورغم أن هذا يأتي في الخسائر المحتملة من جودة الصورة. ويمكن تحقيق فترات أقصر مسح التصوير المقطعي باستخدام الإعداد المستمر خلالها العينة تدور باستمرار في حين يتم التقاط الصور.
- لكل المسح الضوئي، يجب أن "حقل مشرق" و "الظلام الميدان" تكون الصور correcteد. الصور هي صور مشرقة مجال دون العينة في شعاع. غالبا ما يتم جمع هذه قبل وبعد فحص العينة عن طريق ترجمة أفقيا العينة. يتم جمع الحقول المظلمة عن طريق إغلاق مصراع الأشعة السينية، هذا قياس مبلغ إشارة الكاميرا ويظهر مع أي الأشعة السينية.
6. معالجة المعلومات
- نقل 2D "الخام". TIF الصور التي كانت تصدر من الكمبيوتر الحصول على ملقم ملفات، إلى كمبيوتر معالجة البيانات. إذا كان لدى الكمبيوتر RAM كافية، يمكن نسخ البيانات إلى "القرص RAM" ما يسمى (جزء من ذاكرة الوصول العشوائي يظهر على شكل القرص الصلب على الكمبيوتر). وبهذه الطريقة البرنامج ليس من الضروري أن الوصول إلى محرك أقراص الغزل الثابت، الذي بطيء نسبيا مقارنة إلى محرك أقراص الحالة الصلبة أو ذاكرة فلاش. هذه الخطوة يقلل بشكل ملحوظ من مقدار الوقت اللازم لتجهيز مجموعات البيانات.
- يجب تحويل الصور إلى نطاق في المئة الإرسال. Beamline 8.3.2 المخصصة له باويمكن تحميل ckground التطبيع في المكونات التي تستخدم ومع يماغيج البرمجيات المتاحة مجانا أو حزم فيجي ( http://fiji.sc/ ). فإنه ينقص من التهم الظلام الصور وطبيعتها الصور عينة من الحقول مشرق لانتاج الصور التي تظهر انتقال في المئة. تحميل الصور إلى تطبيع الاخطبوط حزمة برامج ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) و "إعادة بناء" مجموعة البيانات 3D 2D الخام من ملفات TIF. باستخدام الخطوات تجهيز المعينة (تطبيع الصور، وإزالة الطوق وخلق Sinogram، وبالتوازي إعادة الإعمار شعاع). هذه العملية ينتج بعد ذلك سلسلة من عرضية TIF. (مقطعية) صور المؤلفة من "voxels" (عناصر بكسل الحجمي)، مع كل قيم س، ص، ض تنسيق وكثافة تمثل الأشعة السينية معامل الامتصاص الخطي.
7. تصور
- Visualiزي كومة من الصور في واحدة من مجموعة متنوعة من حزم البرمجيات. برنامج مجاني (مثل Drishti، http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml يمكن استخدامها) لتصور حجم أو فرد أو رزمة من الصور (على سبيل المثال أو يماغيج فيجي). ويمكن استخدام حزم برامج أخرى لرؤية 3D. فريق بحثنا يستخدم حزمة البرامج Avizo ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview )، ولكن آخرين مثل أميرة ( http://www.amira.com/ ) وVGStudioMax ( الموقع http://www. volumegraphics.com / وأيضا) المستخدمة بشكل شائع.
- تحميل قواعد البيانات في ذاكرة النظام وعرض نموذج في مستعرض الظاهري، طولية، أو توجهات شريحة شعاعي. لأن من سمات 3D للشرائح، مجموعة البيانات الافتراضية من خلال samplيمكن أن تكون استدارة ه في أي طائرة لتتلاءم مع المناطق ذات الأهمية، وهو تحسن كبير على مدى التقليدية المجهر الضوئي مسلسل (انظر أفلام من 1-3 أمثلة مفصلة).
- لتصور العينة حسب الحاجة في 3D، "الجزء" العينة باستخدام مجموعة متنوعة من إجراءات شبه الآلية واليدوية في Avizo لفصل شمعة السفينة أو غيرها من الهياكل من الأنسجة المحيطة بها. تجزئة يشير إلى تحديد الحدود بين الأشياء ذات الأهمية، وبالتالي فصل أو تجزئة منهم إلى مناطق منفصلة. يتم تنفيذ وحدات التخزين في تقديم 3D بواسطة برنامج التصور. أسلوب واحد للقيام بذلك هو جعل حجم مباشرة، حيث يفترض في كل نقطة وبلغ حجم التداول لتنبعث منها وتمتص الضوء، ويمكن تعريف كمية ولون الانبعاثات والامتصاص باستخدام "مخطط الألوان"، والإسقاط مما أدى إلى اتجاه معين هو المعروضة على الشاشة. بدلا من ذلك، يتم إنشاء والسلكي أو 3D سطح تمثل شبكة حدود مجزأة لإظهار نموذج 3D رانه هيكل الفائدة. تتكون شبكة من العناصر 3D مضلع، والعدد الإجمالي للعناصر سوف تؤثر على كل من الدقة الإنجاب هيكل وحجم ملف البيانات المرتبطة بها (أي أكثر من العناصر يؤدي إلى ارتفاع الاخلاص ولكن أكبر حجم الملف). مجموعة متنوعة من وحدات معالجة الصور متوفرة في داخل البرنامج التصور للسيطرة على مخرجات جعل حجم، وكذلك الرقابة على سطوع الصورة، وعلى النقيض، والشفافية، والحد من الضوضاء، الخ.
8. تحديد الكمية
- مرة واحدة وقد تم إنجاز تجزئة، فمن الممكن لتحديد الهدف أو هياكل محطة التغييرات الوظيفية في، حجم طول، وجود، أو عدم وجود عرض الماء والهواء، وما إلى ذلك وعلى سبيل المثال، برودرسن وآخرون (2010) تستخدم لتحديد البرامج Avizo التغيير حجم قطرات الماء داخل الأوعية الكرمة إعادة تعبئتها. تم مسحها النباتات كل 30 دقيقة على مدى أربع إلى ثماني ساعات خلق الوقت لاسوق فلسطين تسلسل السفينة إعادة تعبئتها. أعيد بناؤها في كل من مسح وتحميلها في Avizo، حيث تم قياس قطرات الفردية مع مرور الوقت وزيادة حجمها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم مسح Synchotron HRCT تنفيذها بنجاح على مجموعة واسعة من الأنسجة النباتية والأنواع باستخدام beamline 8.3.2 (الشكل 5)، وقدمت أفكارا جديدة في بنية ووظيفة الخشب المصنع في قرار لم يسبق له مثيل في 3D. قدرات التصور والتنقيب التي قدمتها اعادة البناء 3D (كما هو موضح في الأرقام 6-8؛ وأفلام 1-3) تسمح لتحديد دقيق لمكان واتجاه مع شبكات الهياكل الخشب على كل من عينات رفعه والنباتات الحية.
في بعض الحالات، قد تسبب الاهتزازات أو حركة غير مقصودة عينة تشوهات في الصور النهائية، مما يجعل عمليات الفحص غير صالحة للاستعمال (على سبيل المثال الشكل 4)، ولكن التحسينات لتقليل وقت الفحص (مع التصوير المقطعي المستمر) والتقليل من الآثار الضارة للخسائر هذه البيانات لأن الكثير ويمكن الآن أكثر بمسح أن تكتمل في beamtime محدودةالمخصصة لكل مستخدم. هذه الأوقات أقصر المسح أيضا تمكين التدابير المتكررة لتكرار واحد على مر الزمن لالتقاط ديناميات عمليات مثل الانسداد انتشار والإصلاح.
الشكل 1. التخطيطي عينة المسح من الإجراءات والإعداد داخل قفص في beamline 8.3.2 ALS العلوي الأيسر: من المتوقع أن شعاع مصدر الأشعة السينية (1) من خلال عينة (2) التي تعلق على الطاولة الهواء مع تشاك الحفر التي تدور خلال المسح الضوئي. والأشعة السينية التي تمر عبر العينة تؤثر على ماض الكريستال (4) التي fluoresces الضوء المرئي التي يتم إعادة توجيه بواسطة مرآة (5) من خلال العدسات (6) لكاميرا CCD (7) الذي يلتقط صورة رقمية. و"الخام" 2D صور الأشعة السينية (صورة العلوي الأيمن، مثلا هي نموذج الجذعية النباتية تناوب 180 درجة خلال تتحول مسح كامل في زيادة من 0.25 درجة الناتجة في 720 الصور 2D)، ويؤدي إلى كومة من الصور المستعرضة (أسفل اليمين) التي يتم استخدامها لإعادة بناء 3D. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. الصورة التي اتخذت داخل قفص من beamline 8.3.2 ALS يظهر حية، شجرة العنب بوعاء المعدة للمسح. ويرد الكرمة في أنبوب الاكريليك (1). شعاع الأشعة السينية يدخل القفص إلى اليسار (2)، ثم يمر من خلال عينة (مثل جذع شجرة العنب) (3) ويدخل ثم مربع الضوء ضيقة تحتوي على كاميرا، وماض والبصريات (مربع لا تظهر في هذه الصورة ).
"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "FO: المحتوى العرض =" 4in "/>
الشكل 3. مثال على تكسير العينة (الرمز مع الأسهم البيضاء) عندما تعرض جذر الخشبية (ينظر هنا) لتجفيف لفترة طويلة جدا و / أو في درجة حرارة عالية جدا. لتجنب هذه الأضرار والمحافظة على السلامة الهيكلية والاخلاص لبناء الأنسجة في الجفاف فيفو يتطلب بعض التجارب في وقت مبكر. شريط مقياس = 1 مم.
الشكل 4. تشوهات الصورة، كما رأينا هنا للعديد من الجذور الخشبية الصغيرة، الناتجة عن حركة العينة خلال الفترة الفحص. في هذا المثال تم مسحها عمود من الجذور الخشبية الصغيرة (كل بقعة بيضاء مشرقة هو جذر واحد) لا تزال تعلق على محطة المعيشة وانتقلت على ما يبدو أثناء الفحص والنتيجةإد في الصورة المشوهة. وللتغلب على هذه المشكلة تحتاج إلى عينات أن يستقر بشكل آمن مع الحشو إضافية داخل أنبوب الاكريليك المحيطة بالمصنع.
الشكل 5. ينبع من الصور الممسوحة ضوئيا أمثلة عرضية من لودي ريدوود الساحلية (A) و (B) أوك فالي. و1،0 مم نطاق والحانات بيضاء في كل الصور. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. إعادة الإعمار 3D لالجذعية المولدة من مسح HRCT من نصبة الخشب الأحمر الساحلي المعيشة أظهرت مع طولية وTRطائرة ansverse عرضة للخطر. معظم الخشب ينظر في هذه الصورة هو مملوءة بالماء، في حين أن هناك قنوات الهواء تعبأ في وسط الجذعية (السهم الأسود) التي نتجت عن التجويف خلال تجربة الجفاف. هذا المسح أيضا قنوات القبض في حالة التلبس انظر من cavitating قنوات وسيطة النطاق الرمادي تشكيل عصابة في منتصف المسافة تقريبا بين المركز والخارجية الجذعية (أبيض السهم).
الشكل 7. صورة من برودرسن وآخرون 2012 - قم بزرع، خلية والبيئة مما يدل على إعادة الإعمار 3D من الخشب ترتيب الأوعية الدموية في نوعين سرخس فحصها في وجهتي نظر مختلفتين على سعف الحزم الوعائية واضحة في الزرقاء في حين أن الأنسجة المحيطة بها باللون الأخضر. في Pteridium aquilinum، وبن الأوعية الدمويةهي الأمثل لdles الموصلية عالية مع العديد من اتصالات في كل من تلميح سعف (أ) وقاعدة (ج). في المقابل، Woodwardia الخملية لديه ترتيب أكثر تحفظا الأوعية الدموية مع وصلات قليلة بين حزم في الطرف سعف (ب) وقاعدة (د). الترتيبات الوعائية الناتجة تؤدي إلى معدلات عالية في التمثيل الضوئي P. aquilinum ولكن على حساب التسامح الأقل إلى الجفاف، في حين W. هو الأمثل لطول العمر الخملية سعفة مع انخفاض معدلات التمثيل الضوئي ولكن أعلى تحمل الجفاف. سعفة نصيحة والمقاطع قاعدة ما يقرب من 4 مم وعيار 9 مم في القطر، على التوالي.
الشكل 8. إعادة الإعمار 3D المتولدة من مسح HRCT من الخشب الجذعية الجوز، وهذا يساعد على صورة إثبات القدرة على استكشاف النسيج في القرار لا يصدق حيث أن هذه نوعان من الخشب قنوات المجاورة التي تشترك جدار مترابطة لكثير من طولها. هنا، وإزالة ومعالجة الصور وتمهيد رقيقة جدار الوعاء الدموي المشترك في تقديم وحدة التخزين. يتم الاحتفاظ المكان المحدد وسمك جدار الوعاء الدموي في هذه بيانات الصورة الخام، ويمكن استخدامها لدراسة الاتصال. كل من الأوعية المتصلة في هذه الصورة يكون قطرها ميكرون ~ 40.
الفيلم 1. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
فيلم 2. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov؟ V = 1 & S = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Synchotron HRCT يقدم علماء الأحياء النباتية مع أداة قوية غير مدمرة، لاستكشاف ما يدور بداخل الأوعية الدموية محطة بالتفصيل لا يصدق. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا مؤخرا لتحديد الهياكل التشريحية لم يسبق وصفه في الخشب الكرمة التي تغير تفاضلي الخشب اتصال الشبكة في مختلف أنواع العنب (وآخرون 2012b برودرسن، تحت الطبع) - هذا الاتصال يمكن أن يغير بشكل كبير من قدرة مسببات الأمراض الوعائية والصمات لنشر المدمر في جميع أنحاء شبكات الخشب. وقد كشفت عمليات الفحص الأولى الناجحة من النباتات الحية أيضا غرامة التفاصيل حجم العمليات الحيوية مثل انتشار وإصلاح الانسداد (برودرسن وآخرون 2010؛ McElrone آخرون Phytologist الجديدة 2012 196 (3) :661-665)، وساعد على توريط دور جعل الخلية الحية محددة في إصلاح الانسداد نوع القرار المكانية، التي قدمتها في HRCT ALS 8.3.2 هذا ممكنا. تفاصيل عن هذه العمليات وغيرها من اسبيCTS شبكات الخشب لا تزال بعيدة المنال، HRCT سيلعب على الأرجح دورا رئيسيا في اكتشاف استمرار لا سيما عندما يقترن غيرها من تقنيات عالية الدقة (على سبيل المثال تسليخ مجهري لقطة ليزر)، ويمكن أن تقرن مع غيرها من التقنيات المتقدمة مؤخرا التصور متقدمة لاستخدامها في بيولوجيا النبات ( على سبيل المثال لي وآخرون، 2006؛ Truernit وآخرون، 2008؛ يانكه وآخرون 2009؛. آير-Pascuzzi وآخرون 2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر S Castorani، [إيوستيس] AJ، GAMBETTA GA، Manuck CM، النسفي Z، وزيدان A. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل: وزارة الزراعة الأمريكية، بحوث الزراعية التمويل الخدمة البحثية الحالية نظام المعلومات (مشروع بحثي لا 5306-21220-004-00؛ ويدعم مصدر الضوء المتقدم من قبل مدير مكتب العلوم ومكتب الأساسية. علوم الطاقة، وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231)؛ وNIFA بحوث المحاصيل الاختصاص مبادرة منحة لAJM.
Materials
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography. Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT). New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. , (2012).
- Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). American Journal of Botany. , In Press (2012).
- McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem. Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).
- McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder. Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).
- Tyree, M., Sperry, J. Vulnerability of xylem to cavitation and embolism. Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).
- Tyree, M., Zimmermann, M. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer Verlag. Berlin. (2002).
- Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. Vascular Transport in Plants. , Elsevier. Amsterdam. (2005).
- Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography. Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).
- Mannes, D., Marone, F., et al. Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research. Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).
- Maeda, E., Miyake, H. A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa. Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).
- Steppe, K., Cnudde, V., et al. Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics. Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).
- Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). Encyclopaedia Cinematographica. , Institut für den Wissenschaftlichen Film. Gottingen, Germany. (1971).
- Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels. , In review (2013).
- McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb. New Phytologist. 178, 719-739 (2008).
- McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography. New Phytologist. , (2012).
- Lee, K., Avondo, J., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Truernit, E., Bauby, H., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).
- Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).
- Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems. , (2010).
