Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

Summary

Hochauflösung Röntgenstrahl-Computertomographie (HRCT) ist eine nicht-destruktive diagnostischen Bildgebungsverfahren, verwendet, um die Struktur und Funktion der Anlage Gefäßsystem in 3D studieren kann. Wir zeigen, wie HRCT ermöglicht Erforschung der Xylem Netzwerke über eine breite Palette von pflanzlichen Geweben und Arten.

Abstract

Hochauflösende Röntgen-Computertomographie (HRCT) ist eine nicht-destruktive diagnostischen Bildgebung mit sub-Mikrometer-Auflösungsvermögen, die jetzt verwendet wird, um die Struktur und Funktion pflanzlicher Xylem Netzwerk in drei Dimensionen (3D) zu bewerten (z. B. Brodersen et al . 2010; 2011; 2012a, b). HRCT Imaging basiert auf den gleichen Prinzipien wie medizinische CT-Systeme, sondern auch eine hohe Intensität Synchrotron Röntgenquelle führt zu einer höheren räumlichen Auflösung auf und sank Bildaufnahmezeit. Hier zeigen wir im Detail, wie Synchrotron-HRCT (durchgeführt an der Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in Kombination mit Avizo Software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) verwendet wird, um Pflanzen Xylem zu erforschen, herausgeschnittene Gewebe und lebenden Pflanzen. Diese neue Imaging-Tool ermöglicht es Benutzern, über die traditionellen statischen 2D-Licht oder Elektronenstrahlen Aufnahmen und Studium Proben mittels virtueller serieller Schnitte in jeder Ebene zu bewegen. Eine unendliche Anzahl von Scheiben in jeder Orientierung ceine an der gleichen Probe, ein Feature, das physisch unmöglich ist mit herkömmlichen Mikroskopie-Methoden hergestellt werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass HRCT sowohl krautige und holzige Pflanzen, und eine Reihe von Pflanzenteilen (dh Blätter, Blattstiele, Stängel, Stämme, Wurzeln) angewendet werden können. Hier präsentierten Zahlen dazu beitragen, sowohl eine Reihe von repräsentativen Anlage Gefäßanatomie und die Art der Ausschnitt aus HRCT Datensätzen, einschließlich Scans für Küstenmammutbaum (Sequoia sempervirens), Walnuss (Juglans spp.), Eiche (Quercus spp.) Und Ahorn extrahiert ( Acer spp.) Baumverjüngung die Sonnenblumen (Helianthus annuus), Weinreben (Vitis spp.) und Farnen (Pteridium aquilinum und Woodwardia fimbriata). Herausgeschnitten und getrocknet Proben von Gehölzen sind am einfachsten zu scannen und liefern typischerweise die besten Bilder. Allerdings haben die jüngsten Verbesserungen (dh schnellere Scans und Probenstabilisierung) machte es möglIVK diese Visualisierungstechnik auf grünem Gewebe (zB Blattstiele) und lebende Pflanzen verwenden. Anlässlich gewisse Schrumpfung des hydratisierten grünen Pflanzengewebe verursachen Bilder verschwimmen und Methoden zur Vermeidung dieser Probleme beschrieben werden. Diese jüngsten Fortschritte mit HRCT bieten vielversprechende neue Einblicke in Werk vaskuläre Funktion.

Introduction

Ein Netzwerk von miteinander verbundenen Leitungen, Fasern und Wohnen, metabolisch aktiven Zellen - Wasser wird aus pflanzlichen Wurzeln bis zu den Blättern in einer vaskulären Gewebe genannt Xylem transportiert. Transportfunktion pflanzlichen Xylem muß beibehalten werden, um Nährstoffe und Wasser, um Blätter für die Photosynthese, Wachstum, Überleben und letztlich zu liefern. Wassertransport in Xylem Leitungen können unterbrochen, wenn das Xylem Netzwerk durch pathogene Organismen beeinträchtigt wird. In Reaktion auf eine solche Infektionen Pflanzen produzieren häufig Gele, Zahnfleisch und Tylosen als Mittel zur Pathogenverbreitung Isolat (z. B. McElrone et al 2008; 2010). Trockenstress können auch einschränken, Wassertransport in Xylem. Wie Pflanzen Wasser verlieren bei längerer Trockenheit, baut Spannung in den Xylemsaft. Wasser unter Spannung metastabil ist (dh an einer bestimmten Schwelle die Spannung groß genug ist, wird Wasser Spalten in Xylem Leitungen enthaltenen kavitieren). Nach Kavitation auftritt, kann eine Gasblase (Embolie) bilden und füllen Sie die conduit, effektiv blockieren Bewegung des Wassers (Tyree und Sperry 1989), ein Phänomen, das analog zu Dekompressionskrankheit (dh "die Kurven") in Tiefseetaucher.

Trotz der Bedeutung der Xylem Wassertransport für optimales Pflanzenwachstum Funktion als von einem riesigen Körper der historischen und zeitgenössischen Literatur zu diesem Thema (Tyree & Zimmermann, 2002.; Holbrook et al, 2005) gezeigt hat, gibt es immer noch Aspekte der Xylem Netzwerke, die noch nicht greifbar . Mehrere Arbeitsgruppen haben vor kurzem damit begonnen mit Hilfe von High Resolution Röntgen-Computertomografie Mikro-Tomographie (HRCT), um feinere Details Holzanatomie und vaskulären Gewebe (z. B. Mayo et al bewerten; 2010, 2008; Mannes et al 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda und Miyake, 2009; Steppe et al 2004).. HRCT ist eine zerstörungsfreie Technik verwendet, um Merkmale in dem Inneren von festen Objekten visualisieren und um digitale Informationen über ihre 3-D-strukturellen Eigenschaften zu erhalten. HRCTunterscheidet sich von herkömmlichen medizinischen CAT-Abtastung in seiner Fähigkeit, Informationen so klein wie ein Mikrometer Größe lösen, selbst für Objekte hoher Dichte. Jüngste Fortschritte in der Technologie haben Synchrotron HRCT Bildauflösung und Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, so dass ausreichend Pflanze Gefäß Netzwerke und Gefäßtüpfeln Verbindungen visualisiert werden kann, zugeordnet 3D Koordinaten und exportiert für hydraulische Modellsimulationen. Brodersen et al. (2011) kürzlich erweiterte diese Technik durch die Kombination von 3D-Rekonstruktionen von Synchrotronstrahlung HRCT mit einem Fortran-Modell wird automatisch extrahiert Daten aus dem Xylem Netzwerk wesentlich höhere Auflösung als jemals mit traditionellen anatomischen Methoden (zB serielle Schnitte mit einem Mikrotom möglich erzeugt und Bilderfassung mit Lichtmikroskopie, z. B. Zimmermann 1971). Diese Arbeit wurde auch verwendet, um Hydraulik-Modelle des Systems zu optimieren und Xylem identifizierten einzigartigen Eigenschaften des Verkehrs (dh in gewisser Rücklauf vessels in Spitzenzeiten Transpiration) (Lee et al., in review).

Synchrotron HRCT kann nun verwendet werden, um Xylem Funktionalität, die Anfälligkeit für Kavitation, und ein Pflanzen die Fähigkeit, die embolisiert Leitungen reparieren zu visualisieren. Failure wieder herzustellen Strömung in embolisiert Leitungen reduziert hydraulische Kapazität, Grenzen Photosynthese, und die Ergebnisse in Absterben der Pflanze im Extremfall (McDowell et al. 2008). Pflanzen können mit Embolien durch die Umleitung Wasser um Blockaden über Gruben, die benachbarte funktionelle Leitungen und durch die wachsende neue Xylem verloren hydraulische Kapazität ersetzen bewältigen. Einige Pflanzen besitzen die Fähigkeit, Brüche in der Wassersäule zu reparieren, aber die Details dieses Prozesses im Xylem unter Spannung geblieben unklar Jahrzehnten. Brodersen et al. (2010) kürzlich visualisiert und quantifiziert die Nachfüllen im Live-Reben mit HRCT. Erfolgreiche Schiffes Nachfüllen war abhängig von Wasserzutritt aus lebenden Zellen rund um die xylem Leitungen, wo einzelne Wassertropfen im Laufe der Zeit erweitert, gefüllten Gefäße, und zwang die Auflösung des eingeschlossenen Gases. Die Kapazität der verschiedenen Pflanzen kompromittiert Xylemgefäße und die Mechanismen, die diese Reparaturen repariert werden derzeit untersucht.

Beschreibung der ALS Anlage Beamline 8.3.2

Unsere bisherigen Arbeiten auf dem Hard X-ray Micro-Tomographie Beamline 8.3.2 wurden an der Advanced Light Source in Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley CA USA) durchgeführt. Pflanze Proben werden in einem verbleiten hutch sich 20 m von der Röntgenquelle, durch einen 6 Tesla supraleitenden Magneten Dipol Biegung innerhalb der Advanced Light Source Elektronenspeicherring der bei einer kritischen Energie von 11,5 KeV erzeugt platziert. Eine schematische Darstellung des Endstations ist in Abbildung 1 gezeigt. Die Röntgenstrahlen geben den Stall mit einem Strahl Größe 40x ~ 4,6 mm und durch die Probe, die auf einem motorisierten Drehtisch montiert ist. Dieübertragenen Röntgenstrahlen auf einen Kristall Szintillator (zwei Materialien häufigsten verwendeten sind LuAG oder CdWO _4), die Röntgenstrahlen in sichtbares Licht, das über Linsen auf eine CCD für Bildsammelvorrichtung weitergeleitet wird umzuwandeln auftreffen. Die Kamera, Szintillator und Optik in einer lichtdichten Box, die auf Schienen, die die Probe-zu-Szintillator Entfernung um Phasenkontrast-Abbildung optimiert werden kann ist enthalten.

Alle Proben werden nach dem 10 cm Durchmesser Drehtisch, der wiederum auf horizontale und vertikale Translation Stufen zur Positionierung der Probe angebracht ist. Eine lebende Pflanze Probe, mit der Wurzel in einem speziell angefertigten Blumentopf Halter und das Laub in einer Acryl-Röhre enthaltenen montiert ist, kann in Abbildung 2 zu sehen. Typische Belichtungszeiten von 0,1 bis 1 sec mit 10-18 keV und Scan Dauern wird von 5-40 min je nach den Einstellungen für eine bestimmte Probe optimiert reichen. Für große Proben (typisch pflanzlichen Xylem Netze) können Daten-Scans werdengefliesten durch Wiederholung der Messung an der Probe in unterschiedlichen Höhen, die automatisch gesteuert wird, so dass nahtlose serielle Schnitte entlang einer maximalen Probenhöhe von ~ 10 cm. Maximale Probenbreite bei der Bildgebung bei 4,5 mm Auflösung ~ 1 cm für Proben, die nahezu perfekt in vertikaler Ausrichtung sind, ist. Datengenerierung und-Verarbeitung abgeschlossen ist mit dem Protokoll aufgelistet. Wegen des Unterschiedes in der Röntgen-Dämpfung zwischen Luft und Wasser, kann ausgezeichnete Bildkontrast in Pflanzen ohne den Einsatz von Kontrastmitteln, die typisch für medizinische CT-Systeme erhalten werden. Die luftgefüllten Gefäßlumen ist leicht von dem umgebenden Wasser gefüllten Gewebes in hydratisierter Pflanzen.

Protocol

Protokoll Details beschrieben wurden speziell für die Arbeit an der Advanced Light Source 8.3.2 Beamline geschrieben. Anpassungen können für die Arbeit an anderen Synchrotron-Anlagen erforderlich sein. Proper Sicherheit und Strahlenschutz Ausbildung ist für den Einsatz dieser Einrichtungen erforderlich.

Ein. Probenvorbereitung für lebende Pflanzen

1. Pflanzen wachsen in ~ 10 cm Durchmesser Töpfe, und sicherzustellen, dass der Haupttrieb (oder eines Teils der Pflanze zu scannenden) wie sie möglichst senkrecht ausgerichtet und im Topf zentriert. Die physikalischen Abmessungen der HRCT Instrument hutch an der Advanced Light Source Grenzen lebende Pflanzen zu ~ 1 m in der Höhe. Als Folge davon wird Bildgebung von lebenden Pflanzen am besten auf Sämlinge / Schösslinge in kleinen Töpfen gezogen durchgeführt. Je nach Experiment verschiedenen Bodentypen kann verwendet werden, um Feuchtigkeitsgehalt des Bodens (zB in der Dürre Experimente) zu steuern, und für einige Pflanzen mit flexiblen Triebe (zB Wein) mehr Triebe sorgfältig tucked in die Acryl-Röhre unten beschrieben (siehe Abbildungen 1 und 2).
2. Montieren Sie die Live-Topfpflanzen in einem maßgeschneiderten steife Aluminium-Topf-Halter. Die obere Platte höhenverstellbar, um eine Reihe von in Töpfen Höhen aufzunehmen. Die Oberseite der Platte ausgebildet ist, um mit der Oberseite der Bodenfläche, und der Pflanze steht von der Mitte der zweiteilige Platte auszurichten. Der Zweck der Übertopf soll sichergestellt die Pflanze Vorbau fest in Position gehalten wird, um Vibrationen oder Bewegungen Probe zu minimieren. Minimierung Probe Bewegung während einer Abtastung ist wesentlich.
3. Sobald in dem Halter montiert ist, messen den Schaft Wasserpotential oder Blatt mit einer Transpiration Scholander Stil Druckkammer oder einen Clip-Porometer auf Blatt jeweils um den physiologischen Zustand der Anlage vor dem Abtasten bestimmen.
4. Legen Sie eine dünnwandige Acrylzylinder über die Anlage und auf der Oberseite des Aluminiumwerk Halter und befestigen Sie sie mit Lehm putty zur Stabilisierung derProbe (Abbildung 2). Jede Vibration oder Bewegung des oberen Laub wird hinunter die Stammzellen übertragen und verursachen das Pflanzengewebe im gescannten Bereich zu bewegen, was letztendlich zu Bildverzerrungen. Der Zylinder wird verwendet, um Pflanzenblätter enthalten und verhindern Pflanzenblättern durch Reiben gegen andere Teile der Ausrüstung in den Stall, die in Schwingungen während eines Scans führen würde. Zusätzliche Plastikfolie, Papierhandtücher, und das Klebeband sollten zur weiteren Minimierung Vibration und Bewegung von Pflanzenteilen (siehe Probleme mit Probenbewegung in Abbildung 4) zugeordnet werden. Um seine x-ray absorption (was die Bildqualität bei einer bestimmten Belichtungszeit zu verringern) zu reduzieren, sollte das mit Zylinder als dünne Wände wie möglich, während eine ausreichende Steifigkeit, um seine Funktion zu erfüllen.
5. Bringen Sie die benutzerdefinierte Topflappen mit dem Luftlager Bühne und verriegeln Sie ihn (Schraube) in zwischen der Röntgenquelle und dem bildgebenden Sensor und Kamera-Ausrüstung. Positiauf dem Schaft möglichst senkrecht und in der Mitte auf Magnetspannplatte Base, um sicherzustellen, dass die Probe bleibt im Blickfeld während der Drehung.

2. Probenvorbereitung für die Frische, Herausgeschnittene Pflanzengewebekultur

1. Frisches Pflanzenmaterial, typischerweise Stängel oder Blattstiele, kann nach sofortige Entfernung von einer Live-Anlage gescannt werden. Wenn die Absicht des Experiments ist es, die Gesamtheit des Xylem Netzwerk, Wasser innerhalb der Gefäße zu visualisieren muß evakuiert und ersetzt werden mit Luft. Dazu montieren Sie die Probe in einem Scholander Stil Druckkammer und drücken Sie Druckluft oder Stickstoff durch die Probe bei niedrigem Druck (<0,05 MPa) für ca. 5 min. Arten werden in der Zeit benötigt, um das Schiff zu evakuieren Netzwerk unterscheiden. Wenn beabsichtigt ist, den Umfang der Embolie-Bildung in der frischen Pflanze Gewebe, dann verbrauchsteuerpflichtigen Proben aus der Pflanze unter Verwendung eines frischen Rasierklinge auszuwerten und die Schnitte unter Wasser.
2. Wickeln Sie die Probe in einer Schicht aus Parafilm prBei Austrocknung während des Scans.
3. Montieren der Probe in einem Drill-Spannfutter befestigt an einer Metallplatte, die in der Luftlageroberfläche Stufe verschraubt ist. Zentrum und Orientierung der Probe vertikal, wie oben, um die Probe zu gewährleisten beschrieben verbleibt im Sichtfeld.

3. Probenvorbereitung für Getrocknete Woody Tissues

1. Für eine optimale Gewebeprobe Visualisierung und Bildkontrast, ist es notwendig, die gesamte langsam dehydratisieren holzigen Gewebeprobe. Geschnitten Proben auf etwa 6 cm in der Länge. Proben auswählen, die so gerade wie möglich in der gezielten Abtastregion sind und einen Durchmesser von ≤ 1 cm.
2. Legen Sie die holzigen Gewebeprobe in einem Trockenschrank bei niedriger Temperatur langsam trocknen die Probe ohne dass Risse oder Spalten des Gewebes. Dieser Prozess dürfte sich zwischen verschiedenen Arten und Gewebe unterscheiden. Für holzigen Stielen, beträgt 12 Stunden in einem 40 ° C Ofen typischerweise ausreichend, um hervorragenden Kontrast, ohne bedeutende cha bereitzustellennges in der physikalischen Struktur des Stiels (siehe Probleme mit schneller Trocknung in 3 gezeigt).
3. In manchen Situationen ist es wünschenswert, eine treuhänderische Marker in der Probe, so dass nachfolgende Dissektion und Visualisierung mit Rasterelektronenmikroskopie ausgerichtet werden kann, um bestimmte Punkte in der HRCT Bild haben. Dazu bringt ein Metall oder Glasperlen oder ein Draht auf die Außenseite des Schaftes mit Parafilm. Eine andere Methode ist es, ein Silikonharz (zB RTV-141, Bluestar Silicones, East Brunswick, NJ), die in einem einzigen Xylem Leitung eingespritzt werden kann (siehe Beispiele in Brodersen et al 2010). Verwenden Nach Aushärtung ist der Siliconharz deutlich sichtbar in der Probe und von den anderen leicht luftgefüllten Gefäßen unterscheiden. Verwenden Sie diese Markierung, um genau zu lokalisieren bestimmten Regionen der Probe.
4. Montieren Sie die Probe in das Bohrfutter und in der Mitte, wie oben beschrieben.

4. Probenvorbereitung für Leaf Tissue für zweidimensionale (2D) Röntgenbilder

1. Um Gefäßinhalts in Blättern in der Nähe von echtzeitkritischen visualisieren, kann Blätter abgetastet, um eine 2D Radiogramms, ähnlich einem Dental-Röntgensensor zu erzeugen. Montieren Sie das Blatt zwischen zwei Platten aus dünnen Acryl-Kunststoff, und sichern Sie die Kanten mit Clips. Dann befestigen Sie den montierten Probe zu einer post-Halterung und positionieren Sie den optischen breadboard neben dem Imaging-System und Röntgenquelle.

5. Abtasten der Probe in der 8.3.2 Hutch

1. Entscheiden Sie die Vergrößerung, die am besten für Ihre Anwendung funktioniert. ALS Beamline 8.3.2 hat die Fähigkeit, mit Objektiven mit Vergrößerungen von 2x, 5x und 10x scannen. Diese resultieren in Bildpixel Größen von 4,5, 2,25 und 0,9 &mgr; m. Je nach Vergrößerung, muß die Probe der geeigneten Größe sein, wie das Sichtfeld nimmt mit zunehmender Vergrößerung. Details zur Wahl der Kamera und das Objektiv und die daraus resultierenden Bildparameter in Tabelle 1.

	PCO.4000 (4008x2672)		Pco.edge (2560x2160) (Optique Peter)
Objektiv	Pixel (um)	Sichtfeld (mm)	Pixel (um)	Sichtfeld (mm)
10x	0,9	3,6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1,8	7,2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4,5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6.5 (-)	16,6 (-)

Tabelle 1. Details zur VerfügungKameras und Objektive bei ALS 8.3.2.

2. Stellen Sie die Röntgenenergie bis 15 keV. Dies hat sich gezeigt, dass hervorragende Bildkontrast für die meisten Anwendungen bereitzustellen Pflanze (siehe Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a, b). Belichtungszeiten sind in der Regel abhängig von der Dicke und Dichte der Probe (und damit die Vergrößerung verwendet) zwischen 100 und 1000 msec. Längeren Belichtungszeiten (solange Detektorpixel nicht gesättigt) wird in der Regel zu höheren Signal-Rausch-Verhältnis führen, aber auf Kosten einer erhöhten Zykluszeiten.
3. Wählen Sie eine Winkelinkrement, die für Ihre Anwendung geeignet ist. Die Proben werden um 180 ° gedreht während eines Scans, und die Anzahl der Bilder, die während der Rotation genommen werden einen erheblichen Einfluss auf Größe des Datensatzes, die Länge der Scan-Intervall und die endgültige Bildqualität haben, aber es sind in der Regel abnehmende Qualität. Typische Scans werden bei 0,25 °-Schritten durchgeführt, wobei 721 Bildern pro Scan. Verringerung der inkret bis 0,125 ° ergibt sich eine bessere Bilder zu visualisieren feine Details, sondern Ausbeuten 1440 Bilder und dadurch eine wesentlich größere Datenmenge (bei einem typischen Bereich von Interesse, so bedeutet dies ~ 10-30 GB Daten gegenüber 5 GB). Jedoch wird das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert und oft wert erhöht sowohl die Zykluszeit und Datengröße. Dry Stämme, die wahrscheinlich zu verformen / während eines Scans schrumpfen werden können längere Intervalle (kleinere Winkelinkrement) ohne Beeinträchtigung unterzogen werden. Beim Abbilden lebende Pflanzen, in denen die biologische Prozesse (zB Embolie Reparatur) erfolgen auf kürzeren Zeitskalen, die sich für die kürzere Abtastintervalle ist bevorzugt, potentielle Wirkung der Röntgenstrahlung auf diesem begrenzen gewebespezifischen obwohl dies kommt zu einem potentiellen Verlust von Bildqualität. Kürzere Abtastintervalle geschieht mit dem Continuous-Tomographie Einstellung während der die Probe kontinuierlich rotiert, während die Bilder aufgenommen werden.
4. Für jeden Scan muss "Hellfeld" und "Dunkelfeld" Bilder sein corrected. Hellfeld Bilder sind Bilder ohne die Probe in dem Strahl. Diese werden häufig vor und nach der Abtastung der Probe durch horizontales Umsetzen der Probe gesammelt. Dunkle Felder werden durch Schließen des x-ray gesammelt Auslöser dieser gemessene den Anteil des Signals zeigt die Kamera ohne Röntgenstrahlen.

6. Data Processing

1. Übertragen die "rohen" 2D. TIF-Bilder, die aus dem Erwerb Computer an einen Dateiserver ausgeführt wurden, an eine Datenverarbeitungsanlage Computer. Wenn der Computer eine ausreichende RAM, können die Daten in einer sogenannten "RAM-Laufwerk" (ein Teil des RAM erscheint als eine Festplatte des Computers) kopiert werden. Auf diese Weise die Software nicht haben, um eine rotierende Festplatte, die vergleichsweise langsam ist im Vergleich zu einem Solid State Drive oder Flash-Speicher zugreifen. Dieser Schritt verringert die Menge an Zeit erforderlich, um Datensätze zu verarbeiten.
2. Die Bilder müssen auf eine prozentuale Durchlässigkeit Skala umgewandelt werden. Beamline 8.3.2 hat eine eigene background Normalisierung Plug-in, können heruntergeladen und mit dem frei verfügbaren Software-Pakete ImageJ oder Fidschi (verwendet werden http://fiji.sc/ ). Es zieht die dunklen Grafen von den Bildern und normalisiert die Beispielbilder von den hellen Bereichen Bilder, die prozentuale Durchlässigkeit zeigen, ergeben. Legen normalisierten Bilder in die Octopus-Software-Paket ( http://www.inct.be/en/software/octopus ) und "rekonstruieren" die 3D-Datensatz aus den 2D roh. TIF-Dateien mit den vorgesehenen Bearbeitungsschritte (Normalisieren Bilder, Ring entfernt , Sinogramm Schöpfung, Parallelstrahl Rekonstruktion). Dieser Prozess ergibt dann eine Reihe von. TIF transversalen (Querschnitt) Bilder von "Voxel" (volumetrische Pixelelemente), jede mit einem x, y, z-Koordinatenwerte und Intensitätswerte repräsentiert die x-ray linearen Absorptionskoeffizienten zusammensetzt.

7. Visualisierung

1. Visualisierungze den Stapel von Bildern in einer von einer Vielzahl von Software-Pakete. Freeware (zB Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) kann zum Volumen oder einzelne oder Stapel von Bildern (zB ImageJ oder FIJI) zu visualisieren. Andere Softwarepakete können für 3D-Visualisierung verwendet werden. Unsere Arbeitsgruppe nutzt die Avizo Softwarepaket ( http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), aber andere wie Amira ( http://www.amira.com/ ) und VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) werden ebenfalls häufig verwendet.
2. Legen Sie Datensätze in den Speicher und zeigt die Probe in virtuellen Quer-, Längs oder radiale Scheibe Orientierungen. Aufgrund der 3D-Attribute des Datensatzes, virtuelle Schnitte durch das sample gedreht werden kann in jeder Ebene, mit den Regionen von Interesse, eine deutliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen seriellen Lichtmikroskopie (siehe Filme 1-3 für detaillierte Beispiele) auszurichten.
3. Um das Beispiel zu visualisieren, wie in 3D benötigt werden, "Segment" der Probe mit der Vielzahl von semi-automatischen und manuellen Routinen in Avizo zum Gefäßlumen oder anderen Strukturen aus dem umgebenden Gewebe zu trennen. Segmentierung bezeichnet, die Begrenzungen zwischen den Objekten von Interesse, wodurch Trennen oder Segmentieren sie in getrennten Bereichen. Rendering Volumen in 3D wird durch die Visualisierungs-Software durchgeführt. Eine Methode, dies zu tun ist die direkte Volumendarstellung, wobei jeder Punkt in einem Volumen angenommen emittieren und absorbieren Licht ist, die Menge und Farbe der Emission und Absorption definiert unter Verwendung eines "Farbzuordnung" und die resultierende Projektion in einer vorgegebenen Richtung ist auf dem Bildschirm angezeigt. Alternativ wird ein Drahtgitter-oder 3D-Mesh-Oberfläche, die die segmentierte Grenzen konstruiert, um ein 3D-Modell t zeigen,Er Struktur von Interesse. Die 3D-Netz wird von polygonalen Elementen zusammengesetzt ist, und die Gesamtzahl der Elemente wird sowohl die Genauigkeit der Reproduktion Struktur und der Größe der zugehörigen Datendatei (dh mehr Elementen führt zu einer höheren Genauigkeit, aber größer Dateigröße) beeinflussen. Eine Vielzahl von Bildverarbeitungsmodulen sind innerhalb der Visualisierungs-Software verfügbar, um die Volume-Rendering-Ausgänge sowie Steuerung für Bildhelligkeit, den Kontrast, Transparenz, Rauschunterdrückung, etc. zu kontrollieren

8. Quantifizierung

1. Sobald Segmentierung erreicht worden ist, es möglich ist, die Zielpflanze Strukturen oder funktionelle Veränderungen im Volumen, Länge, Breite, Gegenwart oder Abwesenheit von Wasser, Luft, etc. Beispielsweise quantifizieren, Brodersen et al. (2010) Avizo Software verwendet, um zu quantifizieren die Volumenänderung von Wassertröpfchen innerhalb Weinrebe Nachfüllen Gefäße. Die Pflanzen wurden alle 30 Minuten über vier bis acht Stunden Erzeugen einer Zeit-la gescanntpse-Sequenz des Schiffes Nachfüllen. Jeder Scan wurde rekonstruiert und in Avizo, wo einzelne Tröpfchen über die Zeit gemessen wurden als ihr Volumen vergrößert geladen.

Representative Results

Synchotron HRCT-Scans wurden erfolgreich auf einer Vielzahl von pflanzlichen Geweben und Arten mit Beamline 8.3.2 (Abbildung 5) umgesetzt und zur Verfügung gestellt haben neue Einblicke in die Struktur und Funktion pflanzlicher Xylem in bisher unerreichter Auflösung in 3D. Die Visualisierung und Exploration Fähigkeiten, die von der 3D-Rekonstruktionen (wie in den Figuren 6-8 dargestellt, und Filme 1-3) vorgesehen ermöglichen eine präzise Bestimmung der Position und Ausrichtung der Strukturen mit den Xylem Netzverbunds herausgeschnitten Proben und in lebenden Pflanzen.

In einigen Situationen haben Probenbewegung oder unbeabsichtigten Erschütterungen Verzerrungen in den letzten Bildern verursacht, wodurch die Scans unbrauchbar (zB Abbildung 4), aber die Verbesserungen an Scan-Zeit zu verringern (bei ​​kontinuierlicher Tomographie) wurden die schädlichen Auswirkungen einer solchen Datenverlusten, weil minimiert vielen mehr Scans können nun in der begrenzten Messzeit abgeschlossen seinfür die einzelnen Benutzer. Diese kürzeren Zykluszeiten ermöglichen auch wiederholten Messungen einer einzigen Wiederholung im Laufe der Zeit die Dynamik der Prozesse wie Embolien Verbreitung und Reparatur zu erfassen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Probe Scanvorgang und Setup im Stall bei ALS Beamline 8.3.2 Oben links:. Die Röntgenquelle Träger (1) durch die Probe (2), die an der Luft Tisch mit einem Bohrfutter sich dreht angebracht projiziert während des Scannens. Die Röntgenstrahlen, die durch die Probe passieren auf einen Kristall Szintillator (4), die sichtbares Licht, das durch einen Spiegel (5) durch die Linsen (6) zu einer CCD-Kamera (7), die ein digitales Bild erfasst umgeleitet wird fluoresziert auftreffen. Die "raw" 2D-Röntgenbilder (obere rechte Bild-Beispiel ist ein Pflanzenstängel Probe um 180 ° gedreht während einer Scan bei einer Schrittweite von 0,25 ° in 720 resultierende 2D-Bilder) umgewandelt und zu einem Stapel aus quer Bilder (unten rechts), die für die 3D-Rekonstruktionen verwendet werden. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .

Abbildung 2. Bild im Inneren des Stalles der ALS Beamline 8.3.2 zeigt eine Live-, vergossen grapevine für das Scannen vorbereitet genommen. Die Rebe in einem Acryl-Rohr (1) enthalten ist. Der Röntgenstrahl tritt in den Stall nach links (2), dann durch die Probe (zB der Weinrebe Stamm) (3) und tritt dann in einen lichtdichten Kasten mit der Kamera Szintillator und Optik (Feld in diesem Bild nicht gezeigten ).

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Abbildung 3. Beispiel der Probe Risse (bezeichnet mit den weißen Pfeile), wenn eine holzige Wurzel (hier zu sehen) wurde zum Trocknen zu lange und / oder bei einer zu hohen Temperatur ausgesetzt. Um diese Schäden zu vermeiden und um die strukturelle Integrität und Treue zu Gewebestruktur beizubehalten, vivo Dehydrierung erfordert einige Tests vor der Zeit. Maßstab = 1 mm.

Abbildung 4. Bildverzerrungen, wie hier für zahlreiche kleine holzigen Wurzeln, die sich aus der Bewegung der Probe während der Abtastzeitspanne gesehen. In diesem Beispiel wird eine Spalte der kleinen holzigen Wurzeln (je heller weißer Fleck ist ein einzelnes root) noch zu einer lebenden Pflanze angebracht wurden gescannt und scheinbar bewegt während des Scan-und Ergebnised im verzerrten Bild. Um dieses Problem zu überwinden Proben müssen sicher mit zusätzlicher Polsterung werden in der Acryl-Röhre umgibt die Anlage stabilisiert.

Abbildung 5. Beispiele für Quer-Bilder von holzigen Stielen für (A) Coastal Redwood und (B) Valley Oak gescannt. Weiße Skala Bars mm in beiden Bildern 1,0. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 6. 3D-Rekonstruktion von einem Stamm von einer HRCT Scan eines lebenden Redwood Bäumchen generiert mit einer Längs-und tr angezeigtansverse Ebene ausgesetzt. meisten Xylem in diesem Bild gesehen ist Wasser gefüllt, während es Luft gefüllt Leitungen in der Mitte des Stiels (schwarzer Pfeil), die durch Kavitation während einer Dürre Experiment resultierte sind. Dieser Scan auch Leitungen in der Tat kavitierenden-see erfasst die mittleren Grauwert Leitungen bilden einen Ring etwa auf halbem Weg zwischen dem Zentrum und der Schaft außen (weißer Pfeil).

Abbildung 7. Bild aus Brodersen et al 2012 -. Pflanze, Cell & Environment Demonstration der 3D-Rekonstruktion von Xylem vaskulären Anordnung in zwei Farnarten an zwei verschiedenen Punkten auf dem frond abgetastet Gefäßbündel sichtbar sind blau, wenn das umgebende Gewebe ist grün. In Pteridium aquilinum, die vaskuläre bundles sind für hohe Leitfähigkeit mit vielen Verbindungen sowohl in der frond Spitze (a) und die Basis (c) optimiert. Im Gegensatz dazu weist Woodwardia fimbriata eine viel konservativer vaskulären Anordnung mit einigen Verbindungen zwischen Bündel im frond Spitze (b) und Base (d). Die daraus resultierenden vaskulären Vorkehrungen zu hohen photosynthetischen Preise in P. führen aquilinum aber auf Kosten der niedrigen Toleranz gegenüber Trockenheit, während W. fimbriata für wedel Langlebigkeit mit geringeren Photosyntheserate aber höhere Toleranz gegenüber Trockenheit optimiert. Frond Spitze und Basisabschnitte sind etwa 4 mm und 9 mm Durchmesser.

Abbildung 8. 3D-Rekonstruktion aus einer HRCT Scan aus Nussbaum Stamm Xylem erzeugt. Dieses Bild hilft, die Kapazitäten für die Erkundung des Gewebes zeigen, in unglaubliche Auflösung, da diese zwei benachbarten Xylem Leitungen, die eine zusammenhängende Wand für viel von ihrer Länge teilen. Hier haben die Bildverarbeitungseinheit und Glättung die dünne gemeinsame Gefäßwand im Volume-Rendering entfernt. Genaue Lage und Dicke dieser Behälterwand in den Rohbilddaten erhalten und können verwendet werden, um Konnektivität zu untersuchen. Jeder der verbundenen Gefäßen in diesem Bild haben ~ 40 um Durchmesser.

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Discussion

Synchotron HRCT bietet Pflanzenbiologen mit einem starken, nicht-destruktive Werkzeug, um das Innenleben der Anlage Gefäßsystem in unglaublichen Details zu erforschen. Diese Konnektivität drastisch verändern kann die Fähigkeit der vaskulären Krankheitserreger und Embolien zu verbreiten - Diese Technologie wurde vor kurzem um bisher nicht beschriebene anatomischen Strukturen in grapevine Xylem, die unterschiedlich verändern Xylem Netzwerkverbindung in verschiedenen Weinspezies (. Brodersen et al 2012b, in press) zu identifizieren zerstörungsfrei gesamten Xylem Netzwerken. Die ersten erfolgreichen Scans von lebenden Pflanzen haben auch feine Skala Detail von dynamischen Prozessen, wie Embolien Verbreitung und Reparatur (Brodersen et al 2010; McElrone et al 2012 New Phytologist 196 (3) :661-665) offenbart, und dazu beigetragen, die Rolle der impliziten eine bestimmte lebende Zelle Typ in Reparatur Embolie die räumliche Auflösung durch HRCT bei ALS 8.3.2 vorgesehenen dies möglich gemacht. Einzelheiten über diese Prozesse und andere aspects von Xylem Netze bleiben schwer-HRCT wird wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielen in weiteren Entdeckung besonders wenn sie mit anderen hochauflösende Techniken (zB Laser Capture Mikrodissektion) gekoppelt ist, und könnte mit anderen neu entwickelte fortschrittliche Visualisierungstechniken für den Einsatz in der Biologie der Pflanzen kombiniert werden ( z. B. Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009;. Iyer-Pascuzzi et al 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2