Summary
רזולוצית רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת גבוהה (HRCT) היא טכניקת הדמיה לאבחון לא הרסנית שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את המבנה והתפקוד של מערכת כלי דם צמח ב-3D. אנחנו מדגימים איך HRCT מאפשר חקר של רשתות העצה על פני מגוון רחב של רקמות צמח ומינים.
Abstract
רזולוצית רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת גבוהה (HRCT) היא טכניקה שאינה הרסני אבחון הדמיה עם יכולת רזולוציה תת מיקרון שנמצא כעת בשימוש על מנת להעריך את המבנה והתפקוד של רשת עצת צמח בשלושה ממדים (3D) (לדוגמא Brodersen אח' . 2010; 2011; 2012a, ב). HRCT ההדמיה מתבססת על אותם העקרונות כמו מערכות CT רפואיות, אלא תוצאות בעצמה גבוהה synchrotron רנטגן מקור ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר וירידה בזמן רכישת תמונה. הנה, אנחנו מדגימים בפירוט כיצד סינכרוטרון מבוסס HRCT (שבוצע במקור-LBNL המתקדם אור ברקלי, קליפורניה, ארה"ב) בשילוב עם תוכנת Avizo (VSG Inc, ברלינגטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) נמצא בשימוש כדי לחקור את העצה בצמח נכרת רקמות וצמחי חיים. כלי הדמיה החדשים מאפשרים למשתמשים לנוע מעבר לאור מסורתי סטטי, 2D או micrographs אלקטרונים ודגימות מחקר באמצעות חלקים סדרתיים וירטואליים בכל מטוס. מספר אינסופי של פרוסות בכל האורינטציה גלהתבצע על המדגם הזהה, תכונה שאי אפשר להשתמש בשיטות מיקרוסקופיה פיזית מסורתיות.
תוצאות מראות כי HRCT ניתן ליישם גם עשבוני ומיני צמחים וודי, ומגוון רחב של איברי צמח (עלים כלומר, פטוטרות, גבעולים, גזעים, שורשים). נתונים שהוצגו כאן לעזור להפגין גם מגוון של כלי דם האנטומיה צמח נציג והסוג של פירוט נשלף ממערכות HRCT, כולל סריקות לחוף סקויה (Sequoia sempervirens), אגוז (Juglans spp.), אלון (Quercus spp.), ומייפל ( Acer spp.) שתילי עצים לחמניות (Helianthus annuus), גפנים (תטיס spp.), ושרכים (Pteridium aquilinum וWoodwardia Fimbriata). דגימות שנכרתו והתייבשו ממינים עציים הן קלות ביותר לסריקה ובדרך כלל יניבו את התמונות הטובות ביותר. עם זאת, השיפורים האחרונים (כלומר סריקות מהירות יותר וייצוב מדגם) עשו את זה possניכר בו כלל להשתמש בטכניקת הדמיה זו על רקמות ירוקות (למשל פטוטרות) ובצמחים חיים. בהזדמנות כלשהי התכווצות של רקמות צמח ירוקה hydrated תגרום לתמונות המטושטשות ושיטות, כדי למנוע בעיות אלו מתוארים. ההתקדמות האחרונה האלה עם HRCT לספק תובנה חדשות ומבטיחות לתפקוד כלי דם צמח.
Introduction
מים מועברים משורשי צמח אל העלים ברקמת כלי דם נקראת עצה - רשת של צינורות המחוברים ביניהם, סיבים, ותאי חיים, פעילים מטבולית. תפקוד של תחבורת עצת מפעל חייב להישמר לאספקת חומרי מזון ומים לעלים לפוטוסינתזה, צמיחה וסופו של דבר הישרדות. הובלת מים בצינורות עצה יכולה להשתבש כאשר רשת העצה נפגעת על ידי אורגניזמים פתוגניים. בתגובה לצמחי זיהומים כאלה לעתים קרובות לייצר ג'לי, חניכיים וtyloses כאמצעי לבודד התפשטות הפתוגן (למשל McElrone et al 2008; 2010). מתח בצורת יכול גם להגביל הובלת מים בעצה. כמו צמחים מאבדים מים בצורה ממושכת, מתח בונה במוהל העצה. מים תחת מתח הוא metastable (כלומר בסף מסוים המתח יהיה גדול מספיק למער עמודות מים המצויים בצינורות עצה). לאחר cavitation מתרחש, בועת גז (תסחיף) יכולה ליצור ולמלא את המנצחuit, תנועה ביעילות חסימת מים (טיירי וSperry 1989), תופעה מקבילה למחלת דקומפרסיה (דהיינו "מתכופף") בצוללנים במעמקי ים.
למרות חשיבותו של הובלת מי עצה לתפקוד אופטימלי צמח כפי שמודגם על ידי גוף מכריע של ספרות הסטורית ועכשווית על נושא זה (וטיירי צימרמן, 2002;. הולברוק ואח', 2005), עדיין יש היבטים של רשתות העצה שנשארים חמקמק . מספר קבוצות מחקר החלו לאחרונה ניצול רזולוצית רנטגן ממוחשב גבוהה מייקר טומוגרפיה (HRCT) כדי להעריך פרטים קטנים של האנטומיה עץ ורקמת כלי דם (למשל מאיו ואח'; 2010, 2008; מהאנס ואח' 2010;. Brodersen et al 2010. , 2011, 2012a, ב; מאדה ויקים, 2009; הערבה et al 2004).. HRCT היא טכניקה הורסת להשתמש כדי להמחיש תכונות הפנימיות של עצמים מוצקים וכדי להשיג מידע דיגיטלי על התכונות המבניות 3-D שלהם. HRCTשונה מחתול לסריקה רפואית קונבנציונלית ביכולתה לפתור את הפרטים קטנים כמו מיקרון בגודל, גם לאובייקטים בצפיפות גבוה. התקדמות בטכנולוגית HRCT סינכרוטרון שפרה רזולוציית תמונה ויחס אות לרעש במידה מספקת כך שרשתות כלי צמחים וחיבורי intervessel יכולים להיות חזותיות, הוקצתה קואורדינטות 3D, וייצא לסימולציות מודל הידראוליות. Brodersen et al. (2011) לאחרונה התקדם בטכניקה זו על ידי שילוב של 3D שחזורים שנוצרו על ידי סינכרוטרון HRCT עם מודל פורטרן שמחלצת נתונים באופן אוטומטי מרשת העצה ברזולוציה גבוהה הרבה יותר מאשר היה אי פעם אפשרי עם שיטות מסורתיות (כלומר אנטומיים סידורי חתך עם microtome וצילום תמונה במיקרוסקופ אור, למשל 1971 צימרמן). עבודה זו שמשה גם כדי לייעל מודלים הידראוליים של מערכת העצה וזיהתה מאפיינים ייחודיים של תחבורה (זרימה הפוכה כלומר יש בחלקssels בתקופות של שיא דיות) (Lee et al., בסקירה).
Synchrotron HRCT כעת ניתן להשתמש כדי להמחיש פונקציונלי עצה, רגישות לcavitation, ויכולת של צמחים לתיקון תעלות אמבוליזציה. אי ספיקה להקים מחדש בתעלות אמבוליזציה מפחיתה את היכולת הידראולית, פוטוסינתזת גבולות, ותוצאות במות צמח במקרים קיצוניים (מקדואל et al. שנת 2008). צמחים יכולים להתמודד עם תסחיפים על ידי הטיית מים סביב חסימות באמצעות בורות תעלות המקשרות פונקציונליות סמוכות, ועל ידי גידול העצה חדשה שתחליף קיבולת הידראולית לאיבוד. צמחים מסוימים יש היכולת לתקן הפסקות בעמודות המים, אבל את הפרטים של התהליך הזה בעצה תחת מתח נשארו לא ברורים במשך עשרות שנים. Brodersen et al. (2010) ולאחרונה דמיין לכמת תהליך המילוי בגפנים חיות באמצעות HRCT. כלי מוצלח למילוי היה תלוי בזרם מים מתאי חיים המקיפים את xylem תעלות, שבו טיפי מים בודדות התרחבו לאורך זמן, כולים מלאים, ואלצו את פירוק הגז לכוד. הקיבולת של צמחים שונים לתיקון כולים פרוצים עצה ומנגנוני שליטת תיקונים אלה נחקרת כעת.
תיאור של מתקן ALS Beamline 8.3.2
העבודה שלנו עד כה נערכה על ה-X-Micro טומוגרפיה Beamline הקשיח 8.3.2 במקור האור המתקדם בלורנס ברקלי הלאומית (ברקלי קליפורניה ארה"ב). דגימות צמחים מונחות בכלוב 20 מ 'עופרת מרופדת הממוקם ממקור רנטגן, שנוצר על ידי מגנט 6 טסלה מוליכי עיקול דיפול בתוך ההפעלה המתקדמת מקור אור אלקטרוני אחסון הטבעת באנרגיה קריטית של 11.5 קאב. סכמטי של תחנת הקצה מוצג באיור 1. את קרן ה-X להיכנס לכלוב עם גודל קרן של 40X ~ 4.6 מ"מ ועוברת דרך הדגימה שהוא רכובה על במה מסתובבת ממונעת.המשודר רנטגן לפגוע בscintillator גביש (שני חומרים נפוצים הם LuAG או CdWO 4) אשר להמיר בקרן רנטגן לאור הנראה שמועבר דרך עדשות על CCD לאוסף תמונה. המצלמה, אופטיקה וscintillator כלולים בתיבה הדוקה אור שהיא על מסילה שמאפשרת את מרחק מדגם לscintillator להיות מותאם להדמיה לעומת שלב.
כל הדגימות הם רכובים על במת 10 סנטימטרי הקוטר הסיבובית אשר בתורו הוא רכובה על שלבי תרגום אופקיים ואנכיים למיצוב מדגם. מדגם צמח חי, עם מערכת השורשים רכובות בבעל מותאם אישית נבנה עציץ והעלווה הכלולה בצינור אקרילי, ניתן לראות באיור 2. זמני חשיפה אופייניים יכולים לנוע 0.1-1 שניות באמצעות 10-18 קאב, ומשך סריקה ינוע 5-40 דקות בהתאם להגדרות המותאמות למדגם מסוים. לקבלת דוגמיות גבוהה (אופייני לרשתות העצה צמחים), סריקות נתונים יכולות להיותרעפים על ידי חזרה על המדידה במדגם בגבהים שונים, הנשלט באופן אוטומטי, מה שמאפשר סעיפים סידוריים חלקים לאורך גובה דגימה מרבית של ~ 10 סנטימטר. רוחב דגימה מרבי כאשר הדמיה ברזולוציה של 4.5 מיקרומטר היא ~ 1 סנטימטר לדגימות שנמצאות כמעט מושלמים בכיוון אנכי. דור ועיבוד נתונים הושלם באמצעות הפרוטוקול המפורט להלן. בגלל ההבדל בהנחתת רנטגן בין האוויר ומים, לעומת זאת תמונה מעולה ניתן להשיג בצמחים ללא שימוש בפתרוני ניגודיות טיפוסיים של מערכות רפואיות CT. לומן כלי מלא אוויר הוא להבחין בקלות מהרקמה שמסביב מלאת מים בצמחי hydrated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרטי פרוטוקול המתוארים להלן נכתבו במיוחד עבור עבודה ב8.3.2 beamline מקור האור המתקדם. עיבודים עשויים להידרש לעבודה במתקני synchrotron אחרות. בטיחות נאותה והכשרת קרינה נדרשת עבור שימוש במתקנים אלה.
1. לדוגמא הכנה לצמחי חיים
- לגדל צמחים בעציצים בקוטר ~ 10 סנטימטר, ולהבטיח שהגזע הראשי (או חלק של הצמח לסריקה) הוא כמרכז ככל האפשר, וכיוון אנכי בסיר. את הממדים הפיסיים של מכשיר HRCT הלול בגבולות מקור האור המתקדמים לחיות צמחים ל~ 1 מ 'בגובה. כתוצאה מכך, הדמיה של צמחים חיים מבוצעת טוב ביותר בשתילים / שתילים שגודלו בסירים קטנים. בהתאם לניסוי, סוגי קרקע שונים ניתן להשתמש כדי לשלוט בתוכן לחות קרקע (למשל בניסויים בצורת), ועבור צמחים מסוימים עם יורה גמיש (לדוגמא גפנים) יורה ארוך יותר יכול להיות tu זהירותcked לתוך צינור אקריליק מתואר להלן (ראה איורי 1 ו 2).
- הר העציצים החיים במחזיק סירי מחוייט נוקשה אלומיניום. גובה הפלטה העליונה יכול להיות מותאם כדי להכיל מגוון של גבה סיר. גבי הצלחת נועד ליישר עם החלק העליון של משטח הקרקע, ובולט החוצה הצמחים ממרכז הצלחת שני חלקים. מטרתו של מחזיק הסירים היא להבטיח את גבעול הצמח בחוזקה במקום כדי למזער רעידות או תנועה לדוגמה. צמצום תנועת מדגם במהלך סריקה הוא חיוני.
- רכוב פעם אחת בנושא, מודד את פוטנציאל מים או גזע דיות באמצעות עלה קאמרי Scholander סגנון לחץ או קליפ על porometer עלה, בהתאמה, על מנת לקבוע את המצב הפיזיולוגי של הצמח, לפני הסריקה.
- הנח גליל אקריליק קירות דק על המפעל ועל גבי בעל מפעל האלומיניום ולאבטח אותו במקום בחומר שפכטל לייצובמדגם (איור 2). כל רטט או תנועה של העלווה העליונה יועבר למטה הגזע ולגרום לרקמות הצמח בתוך האזור שנסרק לזוז, סופו של דבר מוביל לעיוות תמונה. הגליל משמש למכיל עלוות צמח ולמנוע מעלי צמח מתחכך חלקים אחרים של ציוד בלול, אשר יובילו ברעידות במהלך סריקה. לעטוף נוסף פלסטיק, מגבות נייר, ויש להשתמש בקלטת נוספת למזער רעידות ותנועה של חלקי צמח (ראה בעיות הקשורות לתנועת דוגמה באיור 4). כדי להקטין את ספיגתו רנטגן (שיכול להקטין את איכות התמונה בזמן חשיפה נתונה), צילינדר המכיל צריכה כמו קירות דקים ככל האפשר, תוך שמירה על קשיחות מספיק כדי לבצע את תפקידיו.
- צרף מחזיקים סירים המותאמים אישית לבמת נושאות האוויר ולנעול אותו (בורג) למקומו בין רנטגן המקור וחיישן ההדמיה וציוד צילום. Positiעל הגזע כאנכי ככל האפשר ומרכז על בסיס צ'אק מגנטי כדי להבטיח המדגם נשאר בשדה הראייה במהלך סיבוב.
2. לדוגמא הכנה לרקמות צמח טריות, נכרתו
- חומר טרי צמח, בדרך כלל גבעולים או פטוטרות, ניתן לסרוק אחרי הרחקה מיידית ממפעל חיים. אם הכוונה של הניסוי היא לדמיין את המכלול של עצת הרשת, המים בתוך הכולים חייבים להתפנות והוחלף באוויר. לשם כך, לעלות על הדוגמא בתא לחץ סגנון Scholander ולדחוף אוויר או חנקן דחוס באמצעות המדגם בלחץ נמוך (<0.05 MPA) לכ 5 דקות. מינים יהיו שונים בזמן הנדרש לפינוי רשת כלי הדם. אם הכוונה היא להעריך את מידת היווצרות תסחיף ברקמות הצמח הטריות, לקח דגימות בלו מהצמח באמצעות סכין גילוח טרי ולעשות את הקיצוצים מתחת למים.
- עטוף את המדגם בשכבה של Parafilm ליחסי הציבורהתייבשות אירוע במהלך הסריקה.
- הר המדגם במקדח צ'אק הקבוע ללוחית מתכת שהוא מוברג בשלב נושאות האוויר. מרכז ולהתמצא המדגם אנכי, כמתואר לעיל, כדי להבטיח המדגם נשארו בשדה הראייה.
3. לדוגמא הכנה לרקמות וודי מיובשים
- אופטימלית עבור להדמית רקמות מדגם ולעומת תמונה, יש צורך לייבש את דגימת הרקמה העצית כל לאט. חותך דגימות לכ 6 סנטימטר באורך. בחר דגימות שנמצאות בקו ישר ככל האפשר באזור הסריקה הממוקדת ויש בקוטר של 1 סנטימטר ≤.
- הנח את דוגמא הרקמה העצית לתנור ייבוש בטמפרטורה נמוכה לייבוש המדגם לאט מבלי לגרום פיצוח או פיצול של הרקמה. תהליך זה עשוי להיות שונה בין מינים ורקמות. לגבעולים עציים, 12 שעות בתנור 40 ° C הן בדרך כלל מספיקה כדי לספק ניגודיות מעולה מבלי לגרום צ'ה המשמעותיתnges במבנה הפיזי של הגזע (ראה בעיות עם ייבוש מהיר הפגין באיור 3).
- במצבים מסוימים, רצוי שתהיה לי סמן אמון במדגם כזה שנתיחה והדמיה שלאחר מכן עם מיקרוסקופיית אלקטרונים יכולים להיות מכוונת לנקודות ספציפיות בתמונת HRCT. כדי לעשות זאת, להדביק מתכת או חרוז זכוכית או חוט לחלק החיצוני של הגזע באמצעות Parafilm. שיטה נוספת היא להשתמש בשרף סיליקון (למשל RTV-141, Bluestar סיליקונים, East Brunswick, NJ) שיהיה ניתן להזריק לתוך צינור עצה אחת (ראה דוגמאות בBrodersen et al 2010). הקשיח פעם, שרף סיליקון נראה בבירור במדגם ולהבחין בקלות מהכולים ממולאי אוויר האחרים. השתמש סמן זה בדיוק כדי לאתר אזורים מסוימים במדגם.
- הר המדגם בתרגיל צ'אק והמרכז, כמתואר לעיל.
4. לדוגמא הכנה לעלה Tissuדואר לשתי Radiograms הממדי (2D)
- כדי להמחיש את התוכן בכלי עלים בזמן אמת קרובה, עלים ניתן לסרוק לייצר רדיוגרמה 2D, בדומה לשיני רנטגן. הר העלה בין שתי יריעות של ניילון אקריליק דק, ולאבטח את הקצוות עם קליפים. ואז לצרף את המדגם רכוב על מערכת הפוסט בעל עמדה וקרש החיתוך האופטי לצד מערכת ההדמיה ורנטגן המקור.
5. סורק את המדגם ב8.3.2 האץ'
- החלט גדלה שתעבוד הכי טוב עבור היישום שלך. ALS Beamline 8.3.2 יש את היכולת לסרוק עם עדשות עם הגדלה של 2x, 5x, ו10x. זה גורם לגדלי תמונה הפיקסלים של 4.5, 2.25, ו 0.9 מיקרומטר, בהתאמה. בהתאם לגדלה, המדגם חייב להיות בגודל מתאים, כפי ששדה הראייה פוחת עם הגדלה הולכת וגוברת. ראה פרטים לבחירת מצלמה ועדשה ופרמטרים שהתמונה שתתקבל בטבלת 1.
| PCO.4000 (4008x2672) | PCO.Edge (2560x2160) (Optique פיטר) | |||
| עדשה | פיקסל (מיקרומטר) | שדה הראייה (מ"מ) | פיקסל (מיקרומטר) | שדה הראייה (מ"מ) |
| 10x | 0.9 | 3.6 | 0.65 (0.69) | 1.7 (1.7) |
| 5x (4x) | 1.8 | 7.2 | 1.3 (1.72) | 3.3 (4.4) |
| 2x | 4.5 | 18 | 3.25 (3.44) | 8.3 (8.8) |
| 1x | 9 | 36 | 6.5 (-) | 16.6 (-) |
לוח 1. פרטים בדבר זמיןמצלמות ועדשות בALS 8.3.2.
- הגדר את אנרגית רנטגן עד 15 קאב. זה הוכח מספק ניגוד תמונה מעולה עבור רוב יישומי צמח (ראה Brodersen et al. 2010, 2011, 2012a, ב). זמני חשיפה הם בדרך כלל תלויים בעובי והצפיפות של המדגם (ובכך ההגדלה ב) נע בין 100 ל 1000 אלפיות השניים. זמני חשיפה ארוכות יותר (כל עוד פיקסלים גלאי לא רוויים) יהיה בדרך כלל גבוהה יותר יובילו לאות לרעש, אך במחיר של זמני סריקה מוגברות.
- בחר תוספת הזוויתי מתאימה ליישום שלך. דוגמאות הסתובבו 180 מעלות במהלך סריקה, ואת מספר התמונות שצולמו במהלך הסיבוב יכול להיות השפעה משמעותית על גודלו של בסיס הנתונים, אורכו של פרק זמן הסריקה, ואיכות תמונה סופית, אבל יש בדרך כלל תשואה פוחתות באיכות. סריקות טיפוסיות מתבצעות במרווחים של 0.25 °, מניב 721 תמונות לסריקה. צמצום incremenלא ל0.125 תוצאות ° בתמונות טובות יותר להמחשת פרטים קטנים, אבל תשואות 1,440 תמונות ובכך מערכות נתונים הרבה יותר גדולות (לאזור אופייני של עניין, זה אומר ~ 10-30 GB של נתונים לעומת 5 GB). עם זאת, יחס האות לרעש היא לעתים קרובות השתפרה וגם הזמן גדל וגודל סריקת נתונים שווה. גבעולים יבשים שלא סבירים שכדי לעוות / להתכווץ במהלך סריקה יכולים להיות נתונים למרווחים ארוכים יותר (תוספת זוויתית קטנה יותר) ללא פגיעה. כאשר צמחי הדמיה חיים, שבו תהליכים ביולוגיים (למשל תיקון תסחיף) מתרחשים על סולמות זמן קצרים, בוחרים את מרווחי סריקה הקצרות יותר עדיף להגביל את ההשפעות מזיקות פוטנציאליות של קרינת רנטגן בזה רקמות למרות שזה מגיע באובדן פוטנציאלי של איכות תמונה. מרווחי סריקה קצרות יותר יכולים להיות מושגים באמצעות הגדרת טומוגרפיה הרציפה שבמהלכו המדגם ברציפות בסבב ואילו תמונות הם כבשו.
- עבור כל סריקה, "שדה בהיר" ותמונות "כהות שדה" חייבים להיות correcteד. תמונות שדה בהירות הן תמונות ללא דוגמה בקרן. אלה בדרך כלל נאספו לפני ואחרי הסריקה של המדגם על ידי תרגום המדגם אופקי. שדות אפלים נאספים על ידי סגירת רנטגן התריס-זה נמדד כמות אות המצלמה מראה ללא צילומים רנטגן.
6. עיבוד נתונים
- העבר את התמונות. TIF "גלם" 2D, אשר יוצאו מהמחשב לרכישת שרת קבצים, למחשב עיבוד נתונים. אם יש במחשב זיכרון RAM מספיק, את הנתונים ניתן להעתיק "כונן זיכרון RAM" מה שנקרא (בחלק מזכרון RAM מופיע ככונן קשיח במחשב). בדרך זו התוכנה לא צריכה לגשת לדיסק קשיח של ספינינג, שהוא איטי יחסית בהשוואה לכונן מצב מוצק או זכרון פלאש. צעד זה מפחית באופן משמעותי את כמות הזמן הנדרש לעיבוד מערכי נתונים.
- התמונות חייבות להיות מומרות להיקף העברת אחוזים. Beamline 8.3.2 בעל תואר ראשון מותאם אישיתנורמליזצית ckground תוספת שניתן להוריד ולהשתמש בו עם התוכנה הזמינה באופן חופשי חבילות ImageJ או פיג'י (http://fiji.sc/). זה מחסיר את הספירה האפלה מהתמונות ומנרמל את התמונות לדוגמה על ידי השדות הבהירים להניב תמונות שמראות שידור אחוזים. לטעון תמונות מנורמלות לחבילת תוכנת אוקטופוס (http://www.inct.be/en/software/octopus) ו" לשחזר "מערך נתוני 3D מ. את קבצי גלם 2D TIF באמצעות פעולות עיבוד הייעודי (נרמל תמונות, הסרת טבעת , יצירת Sinogram, שחזור קורה מקביל). תהליך זה אז מניב סדרה. TIF רוחבי (cross sectional) תמונות המורכבות "voxels" (אלמנטי פיקסל נפחים), כל אחד עם x, y, z קואורדינטות ועוצמת ערכים המייצגים את מקדם ספיגת יניארי רנטגן.
7. ראיה
- VisualiZE הערימה של תמונות באחד ממגוון של חבילות תוכנה. Freeware (למשל Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml) יכול לשמש כדי לחזות או כרכים בודדים או ערימות של תמונות (למשל ImageJ או פיג'י). חבילות תוכנה אחרות יכולות לשמש להדמית 3D. קבוצת המחקר שלנו משתמשת בחבילת תוכנת Avizo (http://www.vsg3d.com/avizo/overview), אבל אחרים כמו עמירה (http://www.amira.com/) וVGStudioMax (http://www. volumegraphics.com /) גם בשימוש נפוץ.
- טען מערכי נתונים לתוך זכרון מערכת ולהציג את המדגם בוירטואלי רוחבי, אורכים, או אורינטציות פרוסות רדיאליים. בגלל תכונות 3D של מערכות נתוני פרוסות, הווירטואליות דרך samplהדואר ניתן לסובב בכל מטוס להיערך עם האזורים של עניין, שיפור משמעותי לעומת אור מיקרוסקופי סידורית מסורתית (ראה סרטי 1-3 עבור דוגמאות מפורטות).
- כדי להמחיש את המדגם לפי צורך ב-3D, "מגזר" המדגם באמצעות המגוון של רוטינות חצי אוטומטיות וידניות, בAvizo להפריד לום כולים או מבנים אחרים מהרקמה הסובבת. פילוח מתייחס להגדרת גבולות בין אובייקטים של עניין, ובכך להפריד או פילוחם לאזורים נפרדים. כרכי טיוח 3D מבוצעים על ידי תוכנת ההדמיה. שיטה אחת לעשות זאת היא טיוח הנפח ישיר, שבו כל נקודה בנפח הנחה היא פולטת ובולעי אור; הכמות והצבע של פליטה ובליעה יכולות להיות מוגדרת באמצעות "מפת צבעים", וכתוצאה מכך ההשלכה בכיוון נתון היא מוצג על המסך. לחלופין, wireframe או משטח הרשת 3D מייצג את הגבולות המפולחים בנוי להראות מודל 3D של tהוא המבנה של עניין. רשת 3D מורכבת מאלמנטי מצולעים, והמספר הכולל של אלמנטים ישפיע הן את הנאמנות של שעתוק מבנה והגודל של קובץ הנתונים המשויך (כלומר, גורמים נוספים מוביל לנאמנות גבוהה יותר, אך גודל קובץ גדול יותר). מגוון רחב של מודולים עיבוד תמונה זמין בתוכנת ההדמיה כדי לשלוט ביציאות נפח הטיוח, כמו גם הבקרה לבהירות תמונה, לעומת זאת, שקיפות, הפחתת רעש, וכו '
8. קביעת כמות
- לאחר הפילוח הושג, ניתן לכמת את מבני מפעל היעד או שינויים תפקודיים בנפח, אורך, רוחב, נוכחות או עדר של מים, אוויר, וכו 'לדוגמה, Brodersen et al. (2010) השתמש בתוכנת Avizo לכמת שינוי הנפח של טיפי מים בתוך כלי גפני מילוי. צמחים נסרקו כל 30 דקות במשך ארבעה עד שמונה שעתי יצירת זמן-laרצף PSE של כלי מילוי. כל סריקה שוחזרה ונטענה לתוך Avizo, שם טיפין בודדות נמדדו לאורך הזמן כנפח שלהם גדל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סריקות Synchotron HRCT יושמו בהצלחה במגוון רחב של רקמות צמח ומינים באמצעות beamline 8.3.2 (איור 5), וספקו תובנה חדשות על המבנה והתפקוד של עצת צמח ברזולוציה חסרה תקדים ב-3D. יכולות ההדמיה וחקר הניתנות על ידי 3D השחזורים (כמוצג באיורים 6-8; וסרטי 1-3) מאפשרות קביעה מדויקת של מיקום וכיוון של מבנים עם רשתות העצה בשתי דגימות שנחתכו ובצמחים חיים.
במצבים מסוימים, תנועת דגימה או תנודות בלתי צפויות שגרמה לעיוותים בתמונות הסופיות, עיבוד הסריקות השמישות (איור לדוגמה 4), אבל את השיפורים כדי להקטין את זמן סריקה (עם טומוגרפיה הרציפה) יש למזער את ההשפעות המזיקות של הפסדי נתונים כאלה, כי רבים יותר סריקות כעת ניתן להשלים בbeamtime המוגבלמוקצה לכל משתמש. סריקת פעמים קצרות אלה גם לאפשר צעדים חוזרים ונשנים של לשכפל אחת לאורך זמן כדי ללכוד את הדינמיקה של תהליכים כמו התפשטות תסחיף ותיקון.
איור 1. סכמטי של מדגם סריקה והליך התקנה בתוך הכלוב ב-ALS beamline 8.3.2 עליונה שמאלית:. קרן רנטגן המקור (1) מוקרנת באמצעות המדגם (2) שמצורף לשולחן האוויר עם צ'אק מקדחה שמסתובב במהלך סריקה. את קרן ה-X שעוברות דרך הדגימה לפגוע בscintillator גביש (4) שמאיר אור הנראה שהוא ינותב על ידי מראה (5) דרך עדשות (6) למצלמת CCD (7) שלוכדת תמונה דיגיטלית. תמונות 2D "הגלם" x-ray (תמונה העליונה דוגמה נכונה הוא מדגם גזע צמח הסתובב 180 מעלות במהלך סריקה מלאה בתוספת של 0.25 ° כתוצאה 720 תמונות 2D) עוברת שינוי והתוצאה בערימה של תמונות רוחביות (למטה מימין) המשמשות לשחזורי 3D. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תמונה צולמה בתוך הכלוב של ALS beamline 8.3.2 מראה חי גפן, עציץ מוכן לסריקה. הגפן כלולה בצינור אקרילי (1). רנטגן הקורה נכנס לכלוב לשמאל (2), ולאחר מכן עובר דרך הדגימה (למשל גזע הגפן) (3) ואז נכנס תיבת אור חזק המכילה מצלמה, scintillator ואופטיקה (תיבה אינה מוצגת בתמונה ).
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg "fo: תוכן רוחב =" 4in "/>
איור 3. דוגמה לפיצוח לדוגמה (מסומן בחצים הלבנים) כאשר שורש עצי (ראה כאן) היה נתון לייבוש למשך זמן רב מדי ו / או בטמפרטורה גבוהה מדי. כדי למנוע ניזק זה וכדי לשמור על שלמותו ונאמנות מבנית למבנה רקמות ב התייבשות vivo דורשת כמה בדיקות מבעוד מועד. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.
איור 4. עיוותי תמונה, כפי שניתן לראות כאן לשורשים רבים קטנים עציים, נובע מתנועה של המדגם בתקופת הסריקה. בדוגמה זו עמודה של שורשים עציים קטנים (כל כתם לבן בוהק הוא שורש יחיד) עדיין מחוברים לצמח חי נסרקה וכנראה עברה במהלך הסריקה והתוצאהאד בתמונה המעוותת. כדי להתגבר על בעיה זו דגימות צריכים להיות התייצב מאובטח עם ריפוד נוסף בתוך צינור אקרילי מקיף את המפעל.
איור 5. דוגמאות לתמונות רוחביות של וודי גבעולי הסריקה () החוף רדווד ו( ב ') בעמק האלון. ברי היקף לבנים 1.0 מ"מ בשתי התמונות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 6. שיקום 3D של גזע שנוצר מסריקת HRCT של שתיל חי החוף סקויה מוצג עם אורכים וtrמטוס ansverse חשוף. רוב העצה ראתה בתמונה זו היא מלאה מים, בעוד יש תעלות מלאו אוויר במרכז הגזע (חץ שחור) שנבע מcavitation במהלך ניסוי בצורת. סריקה זו גם נתפסה תעלות במעשה cavitating-לראות את תעלות ביניים האפורים בקנה המידה שיוצרות טבעת בערך באמצע הדרך בין המרכז וגזע החיצוני (חץ לבן).
איור 7. תמונה מתוך Brodersen et al 2012 -. צמח, סלולרי ואיכות הסביבה מפגינה שיקום 3D של הסדר סקולרית עצה בשני מינים שרכים סרוקים בשתי נקודות שונות בכפת חבילות כלי דם נראות בצבע כחול ואילו רקמות שמסביב בירוק. בPteridium aquilinum, הלחמנייה וסקולריתdles מותאמים למוליכות גבוהות עם קשרים רבים, הוא בקצה הגבעול () ובסיס (ג). לעומת זאת, Woodwardia Fimbriata יש סידור כלי דם הרבה יותר שמרני עם כמה קשרים בין חבילות בכפת הקצה (ב) והבסיס (ד). מבנה כלי הדם כתוצאה מוביל לשיעורים גבוהים בפוטוסינתטיים פ aquilinum אבל על חשבון סובלנות נמוכה לבצורת, בעוד וו Fimbriata הוא מותאם לאריכות ימי זלזל בשיעורים נמוכים יותר, אך פוטוסינתטיים סובלנות בצורת גבוהה יותר. טיפ פרונד וחתכי בסיס הם כ 4 מ"מ ו 9 מ"מ בקוטר, בהתאמה.
איור 8. שיקום 3D שנוצר מסריקה של HRCT עצת גזע אגוז. תמונה זו מסייעת להפגין את היכולת לחקור את הרקמה ברזולוציה מדהימה כמו אלה הם שני צינורות עצה סמוכים שחולקים קיר קשור לחלק גדול מהאורך שלהם. הנה, עיבוד התמונה וההחלקה הסירו את דפנות כלי דם המשותפות הדקות בטיוח הנפח. מיקום ועובי מדויק של קיר הכלי הזה נשמר בנתוני תמונת הגלם וניתן להשתמש בו כדי ללמוד קישוריות. כל אחד מהכלים השלובים בתמונה זו יש ~ קוטר מיקרומטר 40.
סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Synchotron HRCT מספק ביולוגי צמח עם כלי רב עצמה, שאינו הרסני לחקור את המבנה הפנימי של כלי דם צמח בפירוט מדהים. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש לאחרונה כדי לזהות מבנים אנטומיים יתוארו בטפסים בעבר בעצת גפן דיפרנציאלי משנים את הקישוריות לרשת עצה במינים שונים גפנים (Brodersen אח' 2012b, בעיתונות.) - קישוריות זה יכול לשנות באופן דרסטי את היכולת של פתוגנים ותסחיפים בכלי דם להתפשט הרסני בכל רשתות עצה. הסריקות המוצלחות הראשונות של חי צמחים גם חשפו פרטי קנה מידה זעיר של תהליכים דינמיים כמו התפשטות תסחיף ותיקון (Brodersen et al 2010; ניו Phytologist McElrone et al 2012 196 (3) :661-665), וסייעו להפליל את התפקיד סוג תא חי ספציפי בתיקון התסחיף-הרזולוציה מרחבית מסופקת על ידי HRCT ב-ALS 8.3.2 עשה את זה אפשרי. פרטים על תהליכים אלה ואספה אחרתCTS של רשתות העצה עדיין נשאר חמקמק-HRCT צפוי למלא תפקיד מפתח בגילוי המשך במיוחד כאשר יחד עם טכניקות אחרות ברזולוציה גבוהה (למשל microdissection לכידת ליזר), ויכול להיות יחד עם טכניקות להדמיה אחרות שפותחו לאחרונה מתקדמות לשימוש בביולוגית צמח ( למשל Lee et al, 2006; Truernit et al, 2008; Jahnke et al 2009;. אייר-Pascuzzi et al 2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לS Castorani, AJ Eustis, GA גמבטה, CM Manuck, Z Nasafi, וZedan. עבודה זו מומנה על ידי: המחלקה למימון מחקר חקלאי חקלאות-שירות הנוכחי מחקר מידע המערכת בארה"ב (פרויקט מחקר לא 5306-21220-004-00; מקור האור המתקדם נתמך על ידי המנהל, משרד המדע, משרד בסיסי. מדעי אנרגיה, של משרד אנרגיה של ארה"ב תחת חוזה מס DE-AC02-05CH11231);. וNIFA מיוחד יבולי מחקר יוזמת המענק לAJM.
Materials
| See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2 |
References
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high resolution computed tomography. Plant Physiology. 154, 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., Lee, E., Choat, B., Jansen, S., Phillips, R. J., Shackel, K. A., McElrone, A. J., Matthews, M. A. Automated analysis of 3D xylem networks using high resolution computed tomography (HRCT). New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
- Brodersen, C., Roark, L., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. , (2012).
- Brodersen, C., Choat, B., Chatelet, D., Shackel, K. A., Matthews, M. A., McElrone, A. J. Conductive xylem bridges contribute differentially to radial connectivity in grapevine stems (Vitis vinifera and V. arizonica). American Journal of Botany. , In Press (2012).
- McElrone, A. J., Jackson, S., Habdas, P. Hydraulic disruption and passive migration by a bacterial pathogen in oak tree xylem. Journal of Experimental Botany. 59, 2649-2657 (2008).
- McElrone, A. J., Grant, J., Kluepfel, D. The role of ethylene-induced tyloses in canopy hydraulic failure of mature walnut trees afflicted with apoplexy disorder. Tree Physiology. 30, 761-772 (2010).
- Tyree, M., Sperry, J. Vulnerability of xylem to cavitation and embolism. Annual Review of Plant Biology. 40 (1), 19-36 (1989).
- Tyree, M., Zimmermann, M. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer Verlag. Berlin. (2002).
- Holbrook, N. M., Zwienieck, M. A. Vascular Transport in Plants. , Elsevier. Amsterdam. (2005).
- Mayo, S. C., Chen, F., Evans, F. Micron-scale 3D imaging of wood and plant microstructure using high-resolution x-ray phase-contrast microtomography. Journal of Structural Biology. 171, 182-188 (2010).
- Mannes, D., Marone, F., et al. Application areas of synchrotron radiation tomographic microscopy for wood research. Wood Science and Technology. 44, 67-84 (2010).
- Maeda, E., Miyake, H. A non-destructive tracing with an x-ray micro ct scanner of vascular bundles in the ear axes at the base of the lower level rachis-branches in japonica type rice (oryza sativa. Japanese Journal of Crop Science. 78 (3), 382-386 (2009).
- Steppe, K., Cnudde, V., et al. Use of x-ray computed microtomography for non-invasive determination of wood anatomical characteristics. Journal of Structural Biology. 148 (1), 11-21 (2004).
- Zimmermann, M. Dicotyledonous wood structure (made apparent by sequential sections). Encyclopaedia Cinematographica. , Institut für den Wissenschaftlichen Film. Gottingen, Germany. (1971).
- Lee, E. F., Brodersen, C. R., McElrone, A. J., et al. Analysis of HRCT-derived xylem network reveals reverse flow in some vessels. , In review (2013).
- McDowell, N. G., Pockman, W. T., et al. Mechanisms of plant survival and mortality during drought: why do some plants survive while others succumb. New Phytologist. 178, 719-739 (2008).
- McElrone, A. J., Brodersen, C. R., et al. Centrifuge technique consistently overestimates vulnerability to water-stress induced cavitation in grapevines as confirmed with high resolution computed tomography. New Phytologist. , (2012).
- Lee, K., Avondo, J., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Truernit, E., Bauby, H., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 1494-1503 (2008).
- Jahnke, S., Menzel, M. I., et al. Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions. The Plant Journal. 59, 634-644 (2009).
- Iyer-Pascuzzi, A. S., Symonova, O., et al. Imaging and analysis platform for automatic phenotyping and trait ranking of plant root systems. , (2010).
