Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize'a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Summary

Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) 3D bitki damar yapısını ve işlevini incelemek için kullanılabilecek bir tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir. Biz bitki dokuları ve türlerin geniş bir yelpazesinde ksilem ağlarının keşif nasıl kolaylaştırdığını YRBT göstermektedir.

Abstract

Yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı tomografi (YRBT) şimdi (örneğin Brodersen ark üç boyutlu (3D) bitki ksilem ağ yapısı ve fonksiyonu değerlendirmek için kullanılan alt-mikron çözünürlük kapasitesi olan tahribatsız tanısal görüntüleme tekniğidir . 2010; 2011; 2012a, b). YRBT görüntüleme tıbbi BT sistemleri ile aynı prensipleri, ancak daha yüksek uzaysal çözünürlüğü yüksek yoğunluklu Sinkrotron X-ışını kaynağı sonuçlarına dayanan ve görüntü alma süresi azalmıştır. Burada, Avizo yazılımı (VSG A.Ş., Burlington, ABD MA) ile birlikte YRBT (Gelişmiş Işık Kaynağı-LBNL Berkeley, CA, USA yapılan) bitki ksilem keşfetmek için nasıl kullanıldığını sinkrotron tabanlı ayrıntılı göstermek doku ve canlı bitkiler çıkarıldı. Bu yeni görüntüleme aracı, kullanıcıların geleneksel statik, 2D ışık veya elektron mikroskop ve herhangi bir düzlemde sanal seri bölümleri kullanarak çalışma örnekleri ötesine taşımak için izin verir. Herhangi bir yönelim c dilimleri sonsuz sayıdaBir aynı örnek, geleneksel mikroskop yöntemleri kullanarak fiziksel olarak imkansız bir özellik üzerinde yapılabilir.

Sonuçlar YRBT otsu ve odunsu bitki türleri ve bitki organları bir dizi (örneğin yaprak, yaprak sapı, gövde, gövdeler, kökler) hem de uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Burada sunulan rakamlar temsili bitki vasküler anatominin bir dizi ve sahil sekoya (Sequoia sempervirens), ceviz (Juglans spp.), Meşe (Quercus spp.) Ve akça (tarar dahil YRBT gerçekleştirmede, çıkarılan ayrıntı türü hem göstermeye yardımcı Acer spp.) ağaç ayçiçeği (Helianthus annuus), üzüm (Vitis spp.), eğrelti otları ve (Pteridium aquilinum ve Woodwardia fimbriata) fidan. Odunsu türler eksize ve kurutulmuş örnekleri taramak ve genellikle iyi görüntüyü elde etmek için en kolay olanlardır. Ancak, son gelişmeler (yani daha hızlı taramalar ve örnek stabilizasyonu) bunu poss yaptıkyeşil dokularda (örneğin petioles) ve yaşayan bitkiler bu görselleştirme tekniği kullanmak ible. Vesilesiyle sulu yeşil bitki dokularının bazı büzülme bu konular açıklanmıştır önlemek için bulanıklık ve yöntemleri görüntüleri neden olur. YRBT ile bu son gelişmeler bitki vasküler fonksiyon içine umut verici yeni bakış açıları sağlayacaktır.

Introduction

Birbirine bağlı kanallar, fiberler ve yaşam, metabolik olarak aktif hücrelerden oluşan bir ağ - Su bitki köklerinden ksilem denilen bir vasküler doku yapraklara taşınır. Bitki ksilem Ulaştırma işlevi fotosentez için yaprakları, büyüme ve sonuçta yaşam için besin ve su temin korunması gerekir. Ksilem ağ patojen organizmalar tarafından tehlikeye olduğunda Ksilem kanallarında Su taşıma bozulabilmektedir. Bu tür enfeksiyonların bitkiler yanıt olarak sık sık (iken, 2010 örneğin McElrone ark 2008) patojenin yayılma yalıtmak için bir araç olarak jöleler, sakızlar ve tyloses üretmek. Kuraklık stresi de ksilem su taşıma sınırlayabilirsiniz. Bitkiler uzun süreli kuraklık sırasında su kaybetmek gibi, gerginlik ksilem özsuyu oluşturur. Gerilim altında Su (yani belli bir eşikte gerginlik ksilem kanallarında bulunan su sütunları kavitasyon için yeterince büyük olur) metastabilite. Kavitasyon oluşur, sonra bir gaz kabarcığı (emboli) koşul oluşturmak ve doldurmakuit, etkili engelleme su hareketi (Tyree ve Sperry 1989), derin deniz dalgıç vurgun (yani "kıvıran") benzer bir fenomen.

Bu konuda (. Tyree & Zimmermann, 2002; Holbrook ve ark, 2005) tarihsel ve çağdaş edebiyatının bir büyük beden gösterdiği optimum bitki işlev için ksilem su taşıma önemine rağmen, halen mevcuttur ksilem ağların yönleri hala vardır . Çeşitli araştırma gruplarının son zamanlarda ince odun anatomisi ayrıntıları ve vasküler doku (örneğin Mayo ark değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü x-ışını bilgisayarlı mikro tomografi (YRBT) kullanarak başladık; 2010, 2008; Mannes ark 2010;. Brodersen ark 2010. , 2011, 2012a, b; Maeda ve Miyake, 2009; Bozkır ve ark 2004).. YRBT katı nesne iç özellikleri görselleştirmek ve 3-D yapısal özellikleri üzerine sayısal bilgi elde etmek için kullanılan bir dönüşlü bir tekniktir. YRBThatta yüksek yoğunluklu nesneler için, boyutu bir mikrona kadar küçük ayrıntıları çözmek için onun yetenek geleneksel tıbbi CAT-tarama farklıdır. Sinkrotron YRBT teknolojisindeki son gelişmeler, yeterince böylece bitkinin damar ağları ve intervessel bağlantıların görülebilmesi gürültü oranı görüntü çözünürlüğü ve sinyal geliştirilmiş 3D koordinatları atanır ve hidrolik model simülasyonları için ihraç var. Brodersen ark. (2011) son zamanlarda otomatik geleneksel anatomik şekli (seri yani bir mikrotom ile kesit ile her zamankinden mümkün olandan çok daha yüksek çözünürlükte ksilem ağ veri ayıklayan bir Fortran modeli ile sinkrotron YRBT tarafından üretilen 3D rekonstrüksiyon birleştirerek bu tekniği ileri ışık mikroskobu ile görüntü yakalama, örneğin Zimmermann 1971). Bu çalışma aynı zamanda ksilem sisteminin hidrolik modelleri optimize etmek için kullanılır ve taşıma benzersiz özellikleri (bazı ve yani ters akım tespit edilmiştirtepe terleme dönemlerinde ssels) (Lee ve ark., inceleme).

Sinkrotron YRBT şimdi ksilem işlevselliği, kavitasyon yatkınlık ve embolize kanallar onarmak için bitki yeteneğini görselleştirmek için kullanılabilir. Embolize kanallarında yeniden kurmak akışı uyulmaması hidrolik kapasitesi, sınırları fotosentez, ve aşırı durumlarda bitki ölümüne yol açar (McDowell ve ark. 2008) azaltır. Bitkiler, komşu fonksiyonel borular bağlanırken çukurları ile tıkanmalar çevresindeki su aktarma tarafından ve kayıp hidrolik kapasite yerine yeni ksilem büyüyerek embolisi ile başa çıkabilir. Bazı bitkiler su sütunları bozulmaları tamir yeteneğine sahip, ancak gerilim altında ksilem bu sürecin detayları yıllardır belirsiz kalmıştır. Brodersen ark. (2010) son zamanlarda görüntülendi ve YRBT kullanarak canlı grapevines dolum süreci sayılabilir. Dolumu Başarılı damar XYL çevredeki yaşayan hücrelerin su akını bağlıydıOnları tek tek su damlacıkları zamanla genişledi kanalları, dolu kap ve sürüklenen gaz dağılmasına zorladı. Bu onarımlar kontrol tehlikeye ksilem damarları ve mekanizmaları tamir Farklı bitkilerin kapasite şu anda araştırılmaktadır.

ALS tesis beamline 8.3.2 Açıklaması

Bugüne kadar yaptığımız çalışmalar Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı (Berkeley CA ABD) İleri Işık Source Sabit X-ray Mikro Tomografi beamline 8.3.2 üzerinde yürütülmüştür. Bitki örnekleri 11.5 KeV bir kritik enerji kısmındaki Gelişmiş Işık Kaynağı elektron deposunun halka işletim içindeki dipol 6 Tesla süperiletken bend mıknatıs tarafından üretilen x-ray kaynağı bir kurşun astarlı baraka bulunan 20 m, yerleştirilir. Uç istasyonunun şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir. X-ışınları 40x bir ışın boyutu ~ 4.6 mm hutch girin ve motorlu döner sahne üzerine monte edilmiş numune geçer.iletilen x-ışınları resim koleksiyonu için ccd üzerine lensler yoluyla geçirilen görünür ışık için x-ışınları dönüştürmek kristal sintilatör (sık kullanılan iki malzeme Luag ya CdWO ₄ olan) çarpar. Kamera, sintilatör ve optik örnek-to-sintilatör mesafe faz kontrast görüntüleme için optimize edilmesini sağlar raylar üzerinde bir ışık geçirmeyen kutusunda bulunan.

Tüm numuneler, bu da numune konumlandırma için yatay ve dikey çeviri aşamaları üzerine monte edilmiş 10 cm çapında döner sahne üzerine monte edilir. Özel yapılmış bir bitki pota tutucu ve bir akrilik tüp içinde bulunan yeşillik monte kök sistemi ile bir canlı bir bitkinin örnek, Şekil 2'de görülebilir. Tipik pozlama süreleri sn 10-18 KeV kullanılarak 0,1-1'den uzanabilir ve tarama süreleri belirli bir örnek için optimize ayarlarına bağlı olarak 5-40 dakika arasında değişmektedir. Uzun boylu numuneler için (bitki ksilem ağların tipik), veri taramaları olabilir~ 10 cm maksimum örnek yüksekliği boyunca kesintisiz seri kesitler sağlayarak, otomatik olarak kontrol edilir, farklı yüksekliklerde numune ile ölçüm tekrarlayarak döşeli. 4,5 mikron çözünürlükte görüntüleme dikey olarak neredeyse mükemmel örnekleri için ~ 1 cm maksimum örnek genişliği. Veri oluşturma ve işleme aşağıda listelenen protokolü kullanılarak tamamlanır. Çünkü hava ve su arasında x-ışını zayıflama fark, mükemmel görüntü kontrast tıbbi BT sistem tipik kontrast çözeltilerinin kullanımı olmaksızın bitki elde edilebilir. Hava dolu damar lümeni sulu bitkiler çevreleyen su dolu dokusundan kolaylıkla ayırt edilebilir.

Protocol

Aşağıda açıklanan Protokol ayrıntıları Gelişmiş Işık Kaynağı 8.3.2 beamline çalışmak için özel olarak yazılmıştır. Uyarlamalar Diğer sinkrotron tesislerinde çalışmaları için gerekli olabilir. Uygun güvenlik ve radyasyondan eğitimi bu tesislerin kullanımı için gereklidir.

1. Canlı Bitkiler için Numune Hazırlama

1. ~ 10 cm çaplı tencere bitkiler büyümek ve ana kök (veya taranacak bitki bölümü) olarak tencereye dikey mümkün ve odaklı olarak ortalanır olduğundan emin olun. Gelişmiş Işık Kaynağı limitleri YRBT enstrüman kafesi fiziksel boyutları yüksekliği ~ 1 m bitkiler yaşar. Bunun bir sonucu olarak, canlı bitkilerin görüntüleme en fideleri / küçük saksılarda yetiştirilen fidanlar gerçekleştirilir. Deney bağlı olarak, farklı toprak tipi toprak nem içeriği (kuraklık deneylerde gibi) kontrol etmek için kullanılabilir, ve esnek sürgünler (örneğin bağ) ile bazı bitkiler için daha uzun olabilir, sürgün dikkatlice tuakrilik tüp içine cked (Şekil 1 ve 2 'ye bakınız) aşağıda tanımlanmıştır.
2. Ismarlama bir rijit alüminyum tencerede tutucu canlı saksı bitkileri monte edin. Üst plaka yükseklik kap yükseklikleri aralığına uyum sağlaması için ayarlanabilir. Plakasının üst toprak yüzeyinin üst ve iki kısım plaka merkezine bitki çıkıntı ile hizalamak için tasarlanmıştır. Pota tutucu amacı bitki kök titreşim veya örnek hareket aza indirmek için sıkıca tutulur sağlamaktır. Tarama sırasında örnek hareket aza indirmek önemlidir.
3. Bir kez tutucuya monte edilmiş, bir Scholander tarzı basınç odası veya klipsli Tarama öncesinde bitkinin fizyolojik durumunu belirlemek için sırasıyla yaprak porometer,. Kullanılarak kök su potansiyeli veya yaprak transpirasyon ölçmek
4. Bitki üzerinde ve alüminyum fabrikasının sahibinin üstüne ince duvarlı akrilik silindiri yerleştirin ve stabilize etmek için kil macun ile yerine sabitleyinörnek (Şekil 2). Üst yeşillik Herhangi titreşim veya hareketinin kök aşağı iletilen ve taranan alanda bitki doku sonuçta görüntü bozulmasına yol açan, hareket etmesine neden olacaktır. Silindir Bitki yaprakları içeren bir tarama sırasında titreşimler neden olacaktır kafesi ekipman diğer parçaları sürtünmekten bitki yaprakları önlemek için kullanılır. Ek plastik wrap, kağıt havlu ve bant daha (Şekil 4 örnek hareketiyle ilişkili sorunlar bakınız) bitki parçaları titreşim ve hareketleri en aza indirmek için kullanılmalıdır. Işlevi gerçekleştirmek için yeterli sertliğe sürdürürken x-ışını soğurma (belirli bir pozlama zamanda görüntü kalitesini düşürebilir olan) azaltmak için, içeren silindir mümkün olduğunca ince duvarlar gibi olmalıdır.
5. Hava yataklı aşamasına özel pota tutucu takın ve x-ray kaynağı ve görüntü sensörü ve kamera ekipmanları arasında yer içine (vida) kilitleyin. Positiörnek rotasyon esnasında görüş alanında kalmasını sağlamak için manyetik ayna tabanı mevcuttur ve merkezi olarak dikey gövde üzerinde.

2. Taze, Eksize Bitki Doku için Numune Hazırlama

1. Taze bitki materyali, genellikle sapları veya sapı, canlı bir bitkiden derhal kaldırılmasından sonra taranabilir. Deneyin amacı damarları içinde ksilem ağ, su tüm görselleştirmek için ise tahliye olur ve hava ile değiştirilmesi gerekir. Bunu yapmak için, bir Scholander tarzı basınç odasında numune monte ve yaklaşık 5 dakika boyunca düşük basınç (<0.05 MPa) örneklem yoluyla basınçlı hava veya azot itin. Türlere damar ağı boşaltılması için gerekli zaman da farklı olacaktır. Niyet taze bir jilet kullanarak bitki ardından taze bitki dokusunda emboli oluşumu ölçüde, tüketim örnekleri değerlendirmek ve su altında kesim yapmak demektir.
2. Pr Parafilm bir tabakadaki örnek sarıntarama sırasında olay kurutulma.
3. Hava yataklı aşamasında içine vidalanan bir metal plakaya sabitlenmiş bir matkap-chuck içinde örnek monte edin. Merkezi yönlendirmek ve dikey olarak örnek sağlamak için yukarıda tarif edilen örnek görüş alanı içinde kalır.

3. Kurutulmuş Woody Dokular için Numune Hazırlama

1. Optimal doku örneği görüntüleme ve görüntü kontrastı için, yavaş yavaş Tüm odunsu doku örneği kurutmak için gereklidir. Yaklaşık uzunluğu 6 cm örnekleri kesin. Hedeflenmiş tarama bölgesi olarak düz mümkün numunelerde seçin ve ≤ 1 cm çapındadır.
2. Yavaş yavaş dokusunun herhangi bir çatlama ya da bölme neden olmadan örnek kurutmak için düşük bir sıcaklıkta bir kurutma fırını içine odunsu doku numunesi yerleştirin. Bu süreç türleri ve dokular arasındaki farklılık muhtemeldir. Odunsu saplar için, 40 ° C fırın içinde 12 saat, genellikle önemli cha neden olmadan mükemmel kontrast sağlamak için yeterlidirkök fiziksel yapısında nges (Şekil 3'te gösterilmiştir hızlı kuruma ile ilgili sorunları görmek).
3. Bazı durumlarda, taramalı elektron mikroskobu ile daha sonraki disseksiyon ve görüntüleme YRBT görüntü belirli noktalara yönelik olabilir; bu numune içinde bir itibari işaretleyici sahip olmak arzu edilmektedir. Bunu yapmak için, tutturmak bir metal veya cam boncuk veya Parafilm kullanarak kök dışına tel. Başka bir yöntem, bir silikon reçinesi (örneğin, RTV-141, Bluestar'ı silikonlar, Edison, NJ) (Brodersen ve diğerleri, 2010 yılında bkz. örnekler), tek bir ksilem kanal içine enjekte edilebilir. Kullanılmasıdır Bir kere sertleşti, silikon reçine örnek açıkça görülebilen ve kolayca diğer hava dolu gemiler ayırt olduğunu. Tam örnek belirli bölgelerine bulmak için bu işaretleyici.
4. Yukarıda tarif edildiği gibi mandren ve merkezi örnek monte edin.

4. Yaprak Tissu için Numune Hazırlamaİki Boyutlu (2D) Röntgen için e

1. Neredeyse gerçek zamanlı olarak yapraklarda damar içeriğini görselleştirmek için, yapraklar bir diş röntgen benzer bir 2D grafisi, üretmek için taranabilir. Ince akrilik plastik iki yaprak arasında yaprak takın ve klipleri ile kenarları sabitleyin. Sonra bir post-tutucu sistem ve pozisyon görüntüleme sistemi ve x-ışını kaynağının yanında optik breadboard için monte örneği ekleyin.

5. 8.3.2 Hutch Örnek Tarama

1. Uygulamanız için en iyi çalışacak büyütme karar verin. ALS beamline 8.3.2 2x, 5x ve 10x büyütme ile lensler ile taramak için yeteneğine sahiptir. Sırasıyla görüntü piksel 4,5 boyutları, 2,25 ve 0,9 mikron, bu sonuç. Görüş alanında artan büyütme ile azaldıkça büyütme bağlı, örnek, uygun büyüklükte olmalıdır. Kamera ve lens seçimi için ayrıntıları ve Tablo 1'de çıkan görüntü parametrelerini bakın.

	PCO.4000 (4008x2672)		PCO.Edge (2560x2160) (Optique Peter)
Lens	piksel (mikron)	görüş alanı (mm)	piksel (mikron)	görüş alanı (mm)
10x	0.9	3.6	0.65 (0.69)	1.7 (1.7)
5x (4x)	1.8	7.2	1.3 (1.72)	3.3 (4.4)
2x	4.5	18	3.25 (3.44)	8.3 (8.8)
1x	9	36	6,5 (-)	16.6 (-)

Mevcut ilişkin Tablo 1. Ayrıntılarıkameralar ve ALS 8.3.2 de lensler.

2. X-ışını enerjisi 15 keV ayarlayın. Bu (Brodersen ve ark. 2010, 2011, 2012a, b bakınız) bir çok bitki uygulamaları için mükemmel bir görüntü kontrast sağlamak için gösterilmiştir. Pozlama kez genel olarak 100 ile 1000 milisaniye arasında numunenin kalınlığı ve yoğunluğu (ve dolayısıyla büyütme kullanılan) aralığına bağlıdır. Uzun pozlama süreleri (sürece dedektör piksel doymuş değil gibi) genellikle gürültü oranı yüksek sinyal yol, ancak artan kez tarama pahasına olacaktır.
3. Uygulamanız için uygun olan bir açısal artış seçin. Numuneler bir tarama sırasında 180 ° döndürülür ve dönüşü sırasında çekilen görüntü sayısı tarama aralığının dataset, uzunluk, ve nihai görüntü kalitesi boyutu üzerinde önemli bir etkisi olabilir, ancak genellikle kalite döner bir azalma söz konusu. Tipik taramalarda tarama başına 721 görüntüler elde 0.25 ° aralıklarla yapılmaktadır. Artımsal Azalanince ayrıntıları görselleştirmek için daha iyi görüntüler 0.125 ° sonuçlarına t, ama böylece verimi 1.440 görüntüler ve çok daha büyük bir veri kümesi (faiz tipik bir bölge için, bu demektir ~ verilerin 10-30 GB vs 5 GB). Ancak, gürültü oranı sinyal çoğu geliştirilmiş ve artan tarama süresi ve veri boyutu hem değer alır. Tarama sırasında deforme / küçültmek için olası Kuru sapları zarar vermeden uzun aralıklarla (küçük açısal artış) tabi olabilir. Biyolojik prosesler (örneğin emboli onarım) kısa zaman ölçeklerinde gerçekleşecek görüntüleme canlı bitkiler, daha kısa tarama aralıkları yürüttüğünü zaman bu x-ışını radyasyon potansiyel yıkıcı etkilerini sınırlamak amacıyla tercih edilir doku rağmen bu bir potansiyel kaybı geliyor görüntü kalitesi. Daha kısa aralıklarla tarama görüntüleri yakalanan sırasında numune sürekli döner bu süre boyunca sürekli Tomografi ayarı kullanılarak elde edilebilir.
4. Her bir tarama için, "parlak alan" ve "karanlık alan" görüntüler correcte olmalıdırd. Aydınlık alan görüntüler ışın örnek olmadan görüntüleri vardır. Bunlar genellikle yatay olarak örnek çevirerek numune tarama önce ve sonra toplanır. Koyu alanlar bu enstantene kameraya x-ışınları ile gösterir sinyal miktarını ölçülen x-ışını kapatarak toplanır.

6. Veri İşleme

1. Bir veri işleme bilgisayar satın bilgisayardan dosya sunucusuna ihraç edildi "ham" 2D. TIF görüntülerini, aktarın. Bilgisayar yeterli RAM varsa, verileri bir sözde "RAM Drive" (RAM bir kısmı bilgisayarda bir sabit sürücü olarak görünür) kopyalanabilir. Bu şekilde yazılımın bir katı hal sürücü veya flash bellek ile karşılaştırıldığında nispeten yavaş bir dönen sabit disk, erişmek zorunda değildir. Bu adım önemli veri setlerini işlemek için gereken süreyi azaltır.
2. Görüntüleri bir yüzde iletim ölçekli dönüştürülmesi gerekir. Beamline 8.3.2 özel bir ba varckground normalleşme plug-in serbestçe kullanılabilir yazılım paketleri ImageJ veya Fiji (ile indirilebilir ve kullanılabilir http://fiji.sc/ ). Bu görüntülerden karanlık sayıları çıkarır ve yüzde iletim göstermek görüntüleri elde etmek için parlak alanlar tarafından örnek resimler normalleştirir. Ahtapot yazılım paketi (içine normalize görüntüleri yükleyin http://www.inct.be/en/software/octopus ) ve (Ring kaldırılması görüntüleri Normale belirlenen işlem adımları kullanarak 2D ham. TIF dosyalarını 3D dataset "yeniden" , Sinogram oluşturma, Paralel ışın rekonstrüksiyon). Bu süreç daha sonra. TIF enine (kesit) "vokseller" (hacimsel piksel elemanları), x-ışını doğrusal absorpsiyon katsayısı temsil eden bir x, y, z koordinat ve yoğunluk değerleri ile her oluşan görüntüleri bir dizi verir.

7. Görüntüleme

1. Visualiyazılım paketleri çeşitli biri görüntülerin yığın ze. SORULAR (örn. Drishti, http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml ) birimler ya da bireysel veya görüntü yığınlarının (örneğin ImageJ veya FIJI) görselleştirmek için kullanılabilir. Diğer yazılım paketleri 3D görselleştirilmesi için de kullanılabilir. Bizim araştırma grubu Avizo yazılım paketi (kullanır http://www.vsg3d.com/avizo/overview ), ancak böyle Amira (diğerleri gibi http://www.amira.com/ ) ve VGStudioMax ( http://www. volumegraphics.com / ) da yaygın olarak kullanılmaktadır.
2. Sistem belleğine veri setleri yükleyin ve boyuna sanal enine, veya radyal dilim yönlerde örnek görüntüler. Çünkü dataset, sanal dilim 3D özelliklerinin sampl yoluylae ilgi bölgeleri, geleneksel seri ışık mikroskobu (ayrıntılı örnekler için 1-3 Filmler bakın) üzerinde önemli bir gelişme ile hizalamak için herhangi bir düzlemde döndürülebilir.
3. 3D gerektiği gibi örnek görselleştirmek için, "segment" çevreleyen dokudan Lümen ya da diğer yapıların ayırmak için Avizo yarı-otomatik ve manuel rutinleri kullanarak çeşitli örnek. Segmentasyon nedenle ayrılması veya ayrı bölgede içine segmentlere, ilgi nesneler arasındaki sınırları tanımlayan ifade eder. 3D Rendering hacimleri görselleştirme yazılım tarafından yapılır. Bunu yapmak için bir yöntem, bir hacim içinde her bir nokta ışık yayma ve emme varsayılmıştır doğrudan ses işleme olur; emisyon ve emilim miktarı ve renk belirli bir yönde bir "renk haritası", ve sonuçta ortaya çıkan projeksiyon kullanılarak tanımlanır edilebilir ekranda görüntülenir. Alternatif olarak, parçalı sınırları temsil eden bir tel kafes veya 3D mesh yüzey t 3D modeli göstermek için inşa edilmiştirilgi o yapısı. 3D mesh poligonal öğelerden oluşur ve elemanlarının toplam sayısı yapısı üreme sadakat ve ilişkili veri dosyasının boyutu (daha fazla eleman yani yüksek sadakat ancak daha büyük dosya boyutuna yol açar) hem de etkileyecektir. Görüntü işleme modülleri çeşitli görüntü parlaklığı, kontrastı, şeffaflık, gürültü azaltma, vb volume rendering çıkışların yanı sıra denetim kontrol görselleştirme yazılımı içinde mevcuttur

8. Niceleme

1. Segment sağlandıktan sonra, bu örneğin, su, hava, vb hacim, uzunluk, genişlik varlığında veya yokluğunda, hedef bitki yapıları ya da işlevsel değişiklikler ölçmek mümkündür, Brodersen ve diğ. (2010) ölçmek için kullanılan yazılım Avizo dedikodu doldurma damarlarının içine su damlacıkları hacmi değişimi. Bitkiler bir zaman-la oluşturarak dört ile sekiz saat boyunca her 30 dakikada tarandıGeminin pse dizisi dolumu. Her tarama hacimleri arttıkça bireysel damlacıklar zamanla ölçüldü Avizo, içine yeniden ve yüklendi.

Representative Results

Synchotron YRBT taramaları başarıyla bitki doku ve beamline 8.3.2 (Şekil 5) kullanarak türlerin geniş bir yelpazede üzerinde uygulanan edilmiştir ve 3D görülmemiş çözünürlükte bitkinin ksilem yapısı ve fonksiyonu yeni bir anlayış getirmiştir. 3D rekonstrüksiyon tarafından sağlanan görselleştirme ve keşif yetenekleri (Şekiller 6-8 gösterildiği; 1-3 ve Filmler) eksize örnekleri hem ksilem ağlarla yapıların konumu ve yönelimi kesin olarak belirlenmesi için ve yaşayan bitkilerde sağlar.

Bazı durumlarda, örnek bir hareket veya istenmeyen titreşimleri kullanılamaz taramaları (Şekil 4) render final görüntüleri bozulmalara neden olmuş, ancak tarama zamanı azaltmak için iyileştirmeler (sürekli tomografi ile) çünkü bu tür veri kayıplarının zararlı etkileri minimize birçok Daha taramaları artık sınırlı beamtime tamamlanabilirHer kullanıcı için tahsis. Bu kısa tarama süreleri de zaman içinde tek bir çoğaltmak tekrarlayan önlemler emboli yayılmasını ve onarım gibi süreçlerin dinamiklerini yakalamak için etkinleştirin.

Şekil 1. Örnek şematik ALS beamline 8.3.2 de prosedürü ve baraka içindeki kurulum tarama Üst sol:. X-ray kaynağı ışın (1) döner bir mandren ile hava tabloya eklenir örnek (2) aracılığıyla yansıtılır Tarama sırasında. Örnek geçmesine x-ışınları bir dijital görüntü yakalayan bir ccd kamera (7) lensler (6) ile bir ayna (5) tarafından yönlendirilir görünür ışık fluoresces kristal sintilatör (4) çarpar. "Ham" 2D x-ray görüntüler (üst görüntü örneği sağ bir bitki kök örnek sırasında 180 ° döndürülmüş olduğunu 720 2D görüntüler elde 0.25 °) bir artışla tam tarama dönüştürdü ve 3D rekonstrüksiyon için kullanılan transvers görüntüler (sağ alt) bir yığın sonuç vardır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Görüntü tarama için hazırlanan canlı, saksı dedikodu gösteren ALS beamline 8.3.2 ve kafesi içine alınır. Sarmaşık akrilik tüpü (1) yer almaktadır. X-ışını (2) sola barakası girer, sonra örnek (asma kök gibi) (3) geçer ve sonra bir ışık geçirmeyen kamera içeren kutu, sintilatör ve optikler (kutusunda bu görüntü gösterilmiyor girer ).

"Fo: src =" / "fo: content-width =" files/ftp_upload/50162/50162fig3highres.jpg 4in "/>
Şekil 3,. Örnek çatlaması (beyaz oklar ile gösterilen) gömlek bir örneği bir odunsu kök (burada görüldüğü gibi) çok yüksek bir sıcaklıkta uzun süre için ve / veya kurutma tabi tutuldu ve zaman. Bu hasar görmesini önlemek için ve doku yapısının yapısal bütünlüğünü korumak için ve bağlılık vivo dehidratasyon vaktinden bazı test gerektirir. Ölçek bar = 1 mm.

Şekil 4. Gibi çok sayıda küçük odunsu kökler, tarama döneminde örnek hareketi sonucu için buraya görülme Görüntü çarpıtmalar. Bu örnekte hala yaşayan bitki bağlı küçük odunsu kökler (her parlak beyaz nokta tek bir kök) bir sütun tarama ve sonuç sırasında taranan ve görünüşte taşındıbozuk görüntü ed. Bu sorunu aşmak için örnekler güvenli bir şekilde bitki çevreleyen akrilik boru içine ek dolgu malzemesi ile stabilize edilmesi gerekir.

Şekil 5,. Odunsu enine görüntü örnekleri (A) Kıyı Redwood ve (B) Valley Oak için taranır kaynaklanıyor. Beyaz ölçekli barlar hem görüntülerde mm 1.0 uygulanır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 6. Yaşayan kıyı sekoya fidanı bir YRBT tarama oluşturulan bir kök 3D rekonstrüksiyon uzunlamasına ve tr ile gösteriliransverse uçağı maruz. kuraklık deney sırasında kavitasyon kaynaklanan kök (siyah ok) merkezinde hava dolu kanallar varken bu resimde görülen ksilem çoğu, su dolu. Bu tarama, aynı zamanda Kavitasyonlu-bkz eyleminde kanallar yakalanan yarım merkezi ve kök dış (beyaz ok) arasındaki yaklaşık bir halka oluşturan orta gri ölçekli kanallar.

Şekil 7. Brodersen ark 2012 yılından itibaren Görüntü -. Çevreleyen doku yeşil ise yaprak üzerinde iki farklı noktada taranan iki eğrelti türler ksilem vasküler düzenleme 3D rekonstrüksiyon gösteren Bitki Hücre ve Çevre Vasküler demetleri mavi görünür. Pteridium aquilinum, vasküler topuzdles yaprak ucu (a) ve taban (c) her ikisi de çok sayıda bağlantılı yüksek iletkenlik için optimize edilmiştir. Buna karşılık, Woodwardia fimbriata yaprak uç (b) ve taban (d) 'de demetleri arasında az bir bağlantı ile çok daha tutucu damar düzenleme vardır. Çıkan vasküler düzenlemeler P. yüksek fotosentez oranlarına yol aquilinum ama düşük hoşgörü pahasına kuraklık iken W. fimbriata düşük fotosentetik oranları ancak daha yüksek kuraklık toleransı ile yaprak uzun ömür için optimize edilmiştir. Frond ucu ve ayak kısımlarının yaklaşık çapı 4 mm ve 9 mm, sırasıyla.

Şekil 8. 3D rekonstrüksiyon ceviz kök ksilem bir YRBT tarama oluşturulur. Bu görüntü dokusu keşfetmek için kapasitesini göstermek için yardımcı olur Bu boylarının çok bir birbirine duvarı paylaşan iki komşu Ksilem kanallarında olduğu gibi inanılmaz çözünürlükte. Burada, görüntü işleme ve düzeltme volume rendering içinde ince paylaşılan damar duvarı kaldırdık. Bu damar duvarının tam yeri ve kalınlık ham görüntü verisi içinde muhafaza edilir ve bağlantı incelemek için kullanılabilir. Bu resimde bağlı damar her biri ile 40 mikron çapa sahiptir.

Film 1. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 2. filmi görmek için buraya tıklayın .

Film 3.x/asset/supinfo/PCE_2524_sm_MovieS2.mov? v = 1 & s = 0f7e030bb72d2057d5a891215e375093e27e1102 "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın.

Discussion

Synchotron YRBT inanılmaz ayrıntılı bitki damar iç işleyişini keşfetmek için güçlü, tahribatsız aracı ile bitki biyologlar sağlar. Bu bağlantı ölçüde yaymak vasküler patojenler ve emboli yeteneğini değiştirebilir - Bu teknoloji, farklı açılardan farklı asma türlerinin (. Basınında Brodersen ark 2012b,) olarak ksilem ağ bağlantısı değiştirmek dedikodu ksilem önceden tanımlanmamış anatomik yapıları tanımlamak için son zamanlarda kullanılmaya başlanmıştır yıkıcı ksilem ağlarda. Yaşayan bitkilerin ilk başarılı taramalar da emboli yayılmasını ve onarım (Brodersen ark 2010; McElrone ark 2012 Yeni Phytologist 196 (3) :661-665) gibi dinamik süreçlerin ince ölçekli detay ortaya koydular ve rolü bulaştırmak için yardım ALS 8.3.2 de YRBT tarafından sağlanan emboli-uzamsal çözünürlük tamir belirli bir canlı hücre tipi bu mümkün kıldı. Bu süreçler ve diğer Aspe hakkında ÖzellikleriKsilem ağların cts hala sürüncemede-YRBT olasılıkla diğer yüksek çözünürlük teknikleri (örn. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon) ile eşleştirilmiş, özellikle sürekli keşif kilit rol oynayacak kalır ve (bitki biyolojisi kullanılmak üzere diğer yeni geliştirilen gelişmiş görselleştirme teknikleri ile eşleştirilmiş olabilir örneğin, Lee et al, 2006; Truernit ve diğerleri, 2008; Jahnke ve ark 2009;. Iyer-Pascuzzi ve diğerleri 2010).

Materials

See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2