Summary
Молекулярного пучка связана с перестраиваемой вакуумного ультрафиолета фотоионизации масс-спектрометра на синхротроне предоставляет удобный инструмент для исследования электронной структуры изолированного газовой фазы молекул и кластеров. Протон механизмы передачи в димеры оснований ДНК были выяснены с этой техникой.
Abstract
Перестраиваемые мягкой ионизации связана с масс-спектроскопия является мощным методом для исследования изолированных молекул, комплексов и кластеров и их спектроскопии и динамики 1-4. Фундаментальные исследования процессов фотоионизации биомолекул предоставить информацию об электронной структуре этих систем. Кроме определения энергии ионизации и другие свойства биомолекул в газовой фазе не являются тривиальными, и эти опыты обеспечивают платформу для создания этих данных. Мы разработали метод теплового испарения в сочетании с сверхзвуковых молекулярных пучков, что обеспечивает мягкий способ транспортировки этих видов в газовой фазе. Разумное сочетание источника газа и температуры позволяет образование димеров и более кластеров оснований ДНК. В центре внимания данной работы о влиянии нековалентных взаимодействий, т. е. водородные связи, укладки, и электростатическими взаимодействиями, с энергией ионизации иперенос протона отдельных биомолекул, их комплексов и на микро-гидратации воды на 1, 5-9.
Мы провели экспериментальное и теоретическое характеристика динамики фотоионизации в газовой фазе урацила и 1,3-dimethyluracil димеры с использованием молекулярных пучков в сочетании с синхротронного излучения на Beamline химической динамики расположены в 10 Advanced Light Source и экспериментальные детали визуализируются здесь. Это позволило нам наблюдать за перенос протона в 1,3-dimethyluracil димеры, системы с пи укладки геометрия и без водородных связей 1. Молекулярные пучки обеспечивают очень удобный и эффективный способ изолировать образца интерес с экологической возмущения которые в свою очередь позволяет точно сравнению с расчеты электронной структуры 11, 12. По настройке энергия фотона из синхротрона, эффективности фотоионизации (PIE) кривая может быть построена который информирует нас о катионныйэлектронных состояний. Эти значения могут быть по сравнению с теоретическими моделями и расчетами и, в свою очередь, подробно объяснить, электронной структуры и динамики исследованных видов 1, 3.
Protocol
1. Примеры Загрузка
- Снимите заднюю фланцев и разобрать 3/8 "трубки из нержавеющей сопла из аппарата (см. Рисунок 1 и Рисунок 2) и убедитесь, что она чистая и 100 мм отверстие ясно (это можно сделать, глядя на источник света через его). Для чистки, заполнения трубы с ~ 1 мл этанола и кустарников внутри с помощью ватного советы. Также можно разместить сопла в ультразвуковую ванну, наполненную водой с мылом или этаноле в течение 20 мин. Затем сухим сжатым воздухом.
- С помощью небольшой, чистый шпатель, место около 250 мг образца в передней части сопла, рядом с отверстием, но не блокирует его. Хороший способ избежать отверстия от того, чтобы их является размещение небольшой шар из алюминиевой фольги или стеклянной ваты в передней части отверстие, а затем добавить образца порошка. Используйте ватный наконечник, чтобы нажать на образец в пробирку, чтобы убедиться, что он находится в передней 25 мм трубки. Это передняя часть будет состоять из нагретогозоны.
- Снова насадки на аппарат осторожно, чтобы избежать перемещения образца порошком внутри. Затем приложите птичья клетка адаптера (см. Рисунок 2), блок нагревателя и термопары (см. Рисунок 3).
- Перед закрытием вакуумной камере, измерить расстояние от поверхности фланца до кончика сопла, чтобы быть 22,5 дюйма, это позволит 0,5 дюйма между соплом и скиммер.
- Когда вакуумная камера закрыта, проверьте картридж нагревателя и термопары соединения, чтобы убедиться, что они хорошо связан с проходными разъемами.
- Убедитесь, что вход газа-носителя клапан закрыт.
- Закройте клапан вентиляции (если она используется).
- Медленно начинаем насосной камеры с использованием чернового насосы (4 клапанами), и, когда давление в камере <1 Торр, начать турбомолекулярные насосов (5 насосов).
- Когда давление в камере <10 -6 Торр, применять напряжение в ионной оптикиНа момент полета масс-спектрометр, а микроканальной пластины детектора (напряжение на последнем должен быть включен постепенно) (см. рисунок 1 для различных напряжений).
- Откройте затвор VUV чтобы фотонного пучка в камере.
- Откройте входной клапан газа-носителя и установите регулятор давления на поддержку 460 (это вакуумный регулятор, измерения в отрицательной шкале от 0 до -760 мм.рт.ст., следовательно, при установке до 460 она будет регулировать давление в линии до 300 мм рт.ст.) .
- В этих условиях давление в камерах источник и масс-спектрометра должны быть ~ 1 х 10 -6 Торр и ~ 1 х 10 -6 Торр, соответственно.
2. Приобретение Масс-спектр
- Начало быстрая карта (номер модели P7889, 100 пс / БИН) программное обеспечение на компьютер и запустить в фоновом режиме.
- Откройте приобретение Labview данные программы: "Общая Interface.vi" * (рис. 4)
(* Это программное обеспечение и другие коды Labview были разработаны в beamline и доступны делиться ни по стоимости от соответствующих автора)
- На закладке ALS управления в программном обеспечении Labview, установить энергия фотона в нужную длину волны.
- На вкладке масштабирования, установить количество единиц времени, чтобы быть вместе сегментирования (обычно 32), диапазон (число контейнеров) и зачисток (число масс-спектров добавил друг на друга, чтобы сформировать окончательный масс-спектра), то Нажмите Принять, так что эти значения будут сохранены и использованы.
- Затем нажмите кнопку получить данные, чтобы начать сбор данных. При приобретении закончился, масс-спектре появится на экране.
- Сохранить масс-спектр, нажав на кнопку Сохранить. (Оси Х полученного спектра соответствует ионной время полета в 100 единиц пс)
- На закладке ALS Scan (рис. 5) в программном обеспечении Labview, можно получить данные при настройке одной из beamline двигателей. В этом случае, выберите двигателя "Mono T3 энергии" настроиться на различных энергий фотона (ОИ внутри синхротрона будет двигаться автоматически в соответствии с желаемой длины волны). Установить энергии фотонов в нужное значение (в эВ).
- Введите начальную и конечную энергию (в эВ), а также размер шага.
- Не входите в число зачисток - это будут обновляться автоматически по значению, введенному в пункте 2.4.
- Нажмите Читать ток от K486 читать фототок измеряется фотодиодом.
- Далее, нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сканирование. Вам будет предложено выбрать имя файла, где будут храниться данные в конце пробега.
- В первой колонке в кон файла данныхTain номер ячейки (Bin #) и должны быть преобразованы в единицы массы 13. Типичные значения: Вес = 0,6 + 1xE-3 (Bin #) + 5xe-7 (Bin #) ^ 2 (более точную массу калибровки можно сделать с помощью известных смеси газов или даже воздуха в помещении, т.е. главным образом O 2, N 2 и H 2 O смеси и установки времени своего прибытия в полином второго порядка)
- Сохраните файл данных с первого столбца преобразуется в массу.
- Для построения кривой PIE, самый простой способ состоит в использовании вторую программу Labview называется «ALS энергии scan.vi", которая предназначена для анализа данных сканирования и производить пироги.
4. Построение кривых эффективности фотоионизации (PIE)
- Как отмечалось выше, анализ может быть сделано с помощью "ALS энергии scan.vi" (см. Рисунок 6), однако мы также будем здесь описывать шаги, необходимые для анализа данных и без него.
- При запуске программы вам будет предложено выбрать файл containinг данные. Это файл, сохраненный на шаге 3.7 и содержат массу в первом столбце и рассчитывает ионов при различных энергиях фотонов в следующей колонны. Отметим, что первый и второй строки в файле указывают на энергию фотона и фототока данных в этом столбце, соответственно.
- В верхней панели есть 2D графика данных, перемещения красной горизонтальных маркера выбирает масс-спектров в определенной энергией фотона, который будет отображаться в нижней панели.
- Следующий шаг заключается в интеграции ионов пунктам удельная масса каждого фотона в энергию, вычитания фонового сигнала. В нижней панели двумя вертикальными красными маркерами должны быть установлены вокруг масса пика должны быть интегрированы в то время как два синих маркеров вокруг соседнего региона нет данных, которые могут служить в качестве справочного значения. Программа будет представлена комплексная данных минус фона в панели справа.
- Чтобы представить истинную кривую PIE надо исправить ионов рассчитывает в тот или иной поток фотоновт каждый шаг. Это делается автоматически с помощью программного обеспечения. Если вы решите пропустить эту коррекцию, нажмите кнопку, чтобы выключить кнопку текущего поправки к правой верхней панели. Если вы решили сделать этот шаг вручную, квантовой эффективности фотодиодов на энергию фотона должна быть рассмотрена, а также (получено с фотодиода производителя и доступны через соответствующий автора), см. формулу 1. В противном случае, все это делается автоматически с помощью программного обеспечения.
- Нажмите кнопку сохранить спектра в нижнем правом углу, чтобы сохранить исправленный PIE кривой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 7 показан типичный масс-спектр сверхзвукового расширения 1,3-dimethyluracil пары (А) и PIE кривых трех основных характеристик (мономера при м / з 140, протонирована мономера в т / г 141, и 1 ,3-dimethyluracil димера в м / з 280), как извлечь из VUV сканирования от 8 эВ и 10 эВ (B). Серая тень стандартное отклонение от трех последовательных сканирований.
Рисунок 1. Схема экспериментальной установки с напряжением показано на рисунке. (1) Microchannel детектор пластиной, (2) зеркала рефлектора, (3) Молекулярная области Beam, (4) ионная оптика для экстракции.
Рисунок 2.
Рисунок 3. Нагреватель блока с соплом, отопление картридж и термопары.
Рисунок 4. Графический интерфейс пользователя программы сбора данных. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Графический интерфейс пользователя данных переменного токаquisition программа для сканирования эффективности фотоионизации. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 6. Графический интерфейс пользователя программы анализа данных. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 7. Спектр масс и эффективности фотоионизации кривой для 1,3-dimethyluracil молекулярного пучка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мономеры и димеры образуются в сверхзвуковой струе расширение которых приводит к молекулярного пучка. Небольшой образец ДНК база находится в тепловых источников испарения и нагревают до генерировать достаточное давление пара. Аргон несет паров через 100 мкм отверстие и проходит 2 мм Скиммер для производства холодного молекулярного пучка 14. Кроме того, эффузивных источника пучка может быть использован, в котором образец помещают в нагретую духовку прикреплены к отпугиватель пластины (ионная оптика) масс-спектрометра.
Мы используем свет вакуумного ультрафиолета (7.4-25 эВ), мягко ионизируют молекулы одного фотона ионизация, этот метод сводит к минимуму фрагментацию и вторичных процессов и не имеет себе равных по традиционным методикам ионизации использованием электронных схем воздействия. Ионы образуются в области взаимодействия Wiley-McLaren 13 рефлектрон время-пролетной масс-спектрометр, где они в конечном итоге обнаружены утраМОИК канал пластины. На выходе детектора подается на предварительный усилитель и карты multiscaler в персональный компьютер, где данные сохраняются для последующего анализа. Квази-непрерывного излучения поступает из ондулятора расположен на синхротроне (дополнительный источник света), а затем проходит через газовый фильтр, где высшие гармоники света будут удалены и рассеяны через 3 м монохроматор, чтобы обеспечить максимальным разрешением 5 мэВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эксперименты проводились на Beamline химической динамики на дополнительный источник света, Lawrence Berkeley National Laboratory и при поддержке Управления науки, Управлением основной энергии наук, из Министерства энергетики США по контракту № DE-AC02-05CH11231, через Отдел химических наук.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Uracil | Sigma | U0750 | |
1,3-Dimethyluracil | Aldrich | 349801 |
References
- Golan, A. Ionization of dimethyluracil dimers leads to facile proton transfer in the absence of hydrogen bonds. Nat. Chem. 4, 323-329 (2012).
- Belau, L. Vacuum-Ultraviolet Photoionization Studies of the Microhydration of DNA Bases (Guanine, Cytosine, Adenine, and Thymine). The Journal of Physical Chemistry A. 111, 7562-7568 (2007).
- Golan, A., Ahmed, M. Ionization of Water Clusters Mediated by Exciton Energy Transfer from Argon Clusters. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3, 458-462 (2012).
- Nicolas, C. Vacuum Ultraviolet Photoionization of C3. Journal of the American Chemical Society. 128, 220-226 (2005).
- Kamarchik, E. Spectroscopic signatures of proton transfer dynamics in the water dimer cation. Journal of Chemical Physics. 132, (2010).
- Khistyaev, K. The effect of microhydration on ionization energies of thymine. Faraday Discussions. 150, 313-330 (2011).
- Bravaya, K. B. The effect of pi-stacking, H-bonding, and electrostatic interactions on the ionization energies of nucleic acid bases: adenine-adenine, thymine-thymine and adenine-thymine dimers. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 2292-2307 (2010).
- Kostko, O. Ionization of cytosine monomer and dimer studied by VUV photoionization and electronic structure calculations. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 2860-2872 (2010).
- Bravaya, K. B. Electronic Structure and Spectroscopy of Nucleic Acid Bases: Ionization Energies, Ionization-Induced Structural Changes, and Photoelectron Spectra. Journal of Physical Chemistry A. 114, 12305-12317 (2010).
- Leone, S. R., Ahmed, M., Wilson, K. R. Chemical dynamics, molecular energetics, and kinetics at the synchrotron. Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 6564-6578 (2010).
- Scoles, G., Bassi, D., Buck, U. Atomic and Molecular Beam Methods. 1, (1988).
- Pauly, H. Atom, Molecule and Cluster Beams I. , Springer-Verlag. Berlin. (2000).
- Wiley, W. C., McLaren, I. H. Time-of-Flight Mass Spectrometer with Improved Resolution. Review of Scientific Instruments. 26, 1150-1157 (1955).
- Levy, D. H. The Spectroscopy of Very Cold Gases. Science. 214, 263-269 (1981).