Spettrometria di massa molecolare Larghezza Con Tunable Ultraviolet vuoto (VUV) Luce di Sincrotrone

Summary

Un fascio molecolare accoppiato ad sintonizzabile spettrometro ultravioletto di massa fotoionizzazione vuoto ad un sincrotrone fornisce uno strumento comodo per esplorare la struttura elettronica di molecole isolate in fase gas e cluster. Meccanismi di trasferimento di protoni in dimeri di basi del DNA sono stati chiariti con questa tecnica.

Abstract

Tunable ionizzazione morbida accoppiata a spettrometria di massa è un metodo efficace per studiare molecole isolate, complessi e cluster e la loro spettroscopia e dinamica ^1-4. Studi fondamentali processi di fotoionizzazione biomolecole fornire informazioni sulla struttura elettronica di questi sistemi. Inoltre, determinazioni di energie di ionizzazione e altre proprietà delle biomolecole in fase gassosa non sono banali, e questi esperimenti di fornire una piattaforma per generare questi dati. Abbiamo sviluppato una tecnica di vaporizzazione termica accoppiata con fasci molecolari supersonici che fornisce un modo gentile per il trasporto di queste specie nella fase gassosa. Giudiziosa combinazione di gas sorgente e temperatura consente la formazione di dimeri e superiore raggruppamenti di basi del DNA. L'obiettivo di questo lavoro particolare sugli effetti di interazioni non covalenti, cioè, legame a idrogeno, impilabili, e le interazioni elettrostatiche, le energie di ionizzazione etrasferimento di protoni di biomolecole individuali, e loro complessi upon micro-idratazione acqua ^{1, 5-9.}

Abbiamo effettuato la caratterizzazione sperimentale e teorica delle dinamiche fotoionizzazione del gas in fase uracile e 1,3-dimethyluracil dimeri con fasci molecolari accoppiati con luce di sincrotrone presso la linea di luce chimica Dynamics ¹⁰ situato alla Fonte Advanced Light e tutti i dati sperimentali sono visualizzati qui. Questo ci ha permesso di osservare il trasferimento di protoni in 1,3-dimethyluracil dimeri, un sistema con pi impilamento geometria e senza legami idrogeno ^1. Fasci molecolari forniscono un modo molto comodo ed efficiente per isolare il campione di interesse da perturbazioni ambientali che a loro volta permettono confronto accurato con calcoli di struttura elettronica ^{11, 12.} Con messa a punto l'energia del fotone dal sincrotrone, un rendimento fotoionizzazione (PIE) curva può essere tracciata che ci informa sul cationicostati elettronici. Questi valori possono essere confrontati con i modelli teorici e calcoli e, a sua volta, spiegare in dettaglio la struttura elettronica e la dinamica delle specie esaminate ^{1, 3.}

Protocol

1. Esempio di caricamento

1. Rimuovere la flangia posteriore e smontare il 3/8 "tubo inox ugello dal dispositivo (vedere la Figura 1 e Figura 2) e assicurarsi che sia pulito e il 100 orifizio mm è chiaro (Questo può essere fatto, cercando in una fonte di luce attraverso it). Per la pulizia, riempire il tubo con ~ 1 ml di etanolo e strofinare l'interno con punte di cotone. In alternativa, inserire l'ugello in un bagno ad ultrasuoni riempito con acqua e sapone o etanolo per circa 20 minuti. Quindi asciugare con aria compressa.
2. Usando un piccolo, pulito spatola, posto circa 250 mg di campione nella parte anteriore dell'ugello, vicino all'orifizio ma non bloccante. Un buon metodo per evitare di ottenere l'orifizio è bloccato da mettere una piccola sfera di alluminio o lana di vetro davanti dell'orifizio e quindi aggiungere la polvere campione. Utilizzare una punta di cotone per spingere il campione nella provetta per assicurarsi che sia nella parte anteriore 25 mm dal tubo. Questa parte anteriore comprenderà l'riscaldatazona.
3. Ricollegare l'ugello per l'apparecchio con attenzione per evitare di spostare la polvere campione all'interno. Quindi collegare l'adattatore gabbia (vedi figura 2), blocco riscaldatore e termocoppia (vedere la figura 3).
4. Prima di chiudere la camera a vuoto, misurare la distanza dalla superficie della flangia alla punta dell'ugello di essere 22,5 pollici; questo permetterà 0,5 pollici tra l'ugello e il skimmer.
5. Quando la camera a vuoto è chiuso, verificare la cartuccia di riscaldamento e collegamenti della termocoppia per assicurarsi che siano ben collegati ai feed-attraverso connettori.
6. Assicurarsi che la valvola del gas vettore di ingresso è chiusa.
7. Chiudere la valvola di sfiato (se usata).
8. Lentamente iniziare a pompare la camera con le pompe rotative di valvole (4), e quando la pressione nella camera è <1 torr, avviare le pompe turbomolecolari (5 pompe).
9. Quando la pressione nella camera è <10 ^-6 torr, le tensioni applicate alle ottiche ionedel tempo di volo spettrometro di massa, e la micro-canale rilevatore piastra (la tensione su quest'ultimo deve essere acceso gradualmente) (vedere Figura 1 per tensioni diverse).
10. Aprire l'otturatore VUV per consentire al fascio di fotoni nella camera.
11. Aprire la valvola del gas vettore di ingresso e impostare il regolatore di pressione al supporto 460 (questo è un regolatore di vuoto, in una scala di misura negativi da 0 a -760 torr, quindi quando impostato a 460 si regola la pressione nella linea a 300 torr) .
12. In queste condizioni la pressione nelle camere di spettrometro di origine e di massa deve essere ~ 1 x 10 ^-6 torr e ~ 1 x 10 ^-6 torr, rispettivamente.

2. Acquisizione di uno spettro di massa

1. Avviare la scheda FAST (numero di modello P7889, 100 ps / bin) software sul computer e farlo funzionare in background.
2. Aprire l'acquisizione Labview dati del programma: "Generale Interface.vi" * (Figura 4)

(* Questo software e gli altri codici Labview sono stati sviluppati in linea di luce e sono disponibili a condividere senza alcun costo da parte dell'autore corrispondente)

3. Utilizzando la scheda di controllo ALS nel software Labview, impostare l'energia del fotone di lunghezza d'onda desiderata.
4. Nella scheda scaler, impostare il numero di unità di tempo da binned insieme (tipicamente 32), il campo (numero di contenitori) e scansioni (il numero di spettri di massa aggiunto uno sopra l'altro per formare lo spettro di massa finale), poi Fare clic su Accetta, in modo che questi valori vengono memorizzati e utilizzati.
5. Quindi, fare clic su Dati per iniziare l'acquisizione dei dati. Quando l'acquisizione è terminata, lo spettro di massa apparirà sullo schermo.
6. Salvare lo spettro di massa, fare clic sul pulsante Salva. (L'asse X dello spettro ottenuto corrisponde al tempo di volo di ioni in unità di 100 ps)

tle "> 3. Acquisizione di una curva di efficienza fotoionizzazione (PIE)

1. Utilizzo della scheda ALS Scan (figura 5) nel software Labview, è possibile acquisire dati durante l'accordatura uno dei motori beamline. In questo caso, selezionare l'opzione "energia T3 Mono" motore di sintonizzarsi su diverse energie dei fotoni (L'ondulatore all'interno del sincrotrone si sposterà automaticamente in funzione della lunghezza d'onda desiderata). Impostare l'energia del fotone al valore desiderato (in eV).
2. Inserire l'inizio e le energie di stop (in eV), così come le dimensioni Step.
3. Non immettere il numero di passate - questo verrà aggiornato automaticamente in base al valore immesso al punto 2.4.
4. Istruzioni Leggi corrente da K486 a leggere la fotocorrente misurata dal fotodiodo.
5. Quindi, fare clic su Start per avviare la scansione. Ti verrà richiesto di scegliere un nome di file in cui i dati saranno conservati presso la fine della corsa.
6. La prima colonna del file di dati conmantenere il numero di bin (Bin #) e devono essere convertiti in unità di massa ^13. Valori tipici sono: Massa = 0,6 + 1XE-3 (Bin #) + 5XE-7 (Bin #) ^ 2 (A calibrazione massa più precisa può essere fatto utilizzando una miscela di gas noto o anche camera aria cioè principalmente O _2, N ₂ e H ₂ O e la miscela di montare il loro tempo di arrivo di un polinomio del secondo ordine)
7. Salvare il file di dati con la prima colonna convertito in massa.
8. Per tracciare una curva di Torta, un modo semplice è quello di utilizzare un secondo programma Labview chiamato "SLA scan.vi energia", che ha lo scopo di analizzare i dati di scansione e produrre PIE.

4. Tracciare una curva di efficienza fotoionizzazione (PIE)

1. Come notato sopra, l'analisi può essere eseguita utilizzando il "ALS energia scan.vi" programma (vedere Figura 6), tuttavia si descriveranno anche qui i passi necessari per analizzare i dati senza.
2. Quando si avvia il programma vi verrà chiesto di selezionare il file di containing i dati. Questo è il file salvato nel passaggio 3.7 e contengono masse conti prima colonna e ioni a diverse energie dei fotoni nelle colonne successive. Si noti che le righe prima e la seconda nel file indica l'energia del fotone e fotocorrente dei dati di quella colonna, rispettivamente.
3. Nel pannello superiore è un grafico 2D dei dati, spostando il marcatore rosso orizzontale seleziona un spettri di massa ad una energia specifica fotone da visualizzare nel pannello inferiore.
4. Il passo successivo è quello di integrare i conteggi di ioni di una massa specifica a ciascun fotone di energia mentre sottraendo il segnale di fondo. Nel riquadro in basso i due marcatori verticali rosse deve essere impostato intorno al picco di massa da integrare mentre i due marcatori blu intorno una regione vicina, senza dati che possono servire come valore di fondo. Il software presenterà i dati integrati meno lo sfondo nel pannello a destra.
5. Presentare una vera curva PIE bisogna correggere i conteggi di ioni per il flusso di fotoni variando unt ogni passo. Questo viene fatto automaticamente dal software. Se si sceglie di ignorare questa correzione, fare clic per disattivare il pulsante di correzione attuale a destra del pannello superiore. Se si sceglie di fare questa operazione manualmente, l'efficienza quantica del fotodiodo per energia del fotone deve essere considerata come bene (da parte del produttore fotodiodo e disponibile tramite l'autore corrispondente), si veda l'equazione 1. Altrimenti, questo è tutto fatto automaticamente dal software.

6. Fai clic su salva spettro nell'angolo in basso a destra per salvare la curva Torta corretto.

Representative Results

La figura 7 mostra un tipico spettro di massa della espansione supersonica di 1,3-dimethyluracil vapori (A) e le curve PIE dei tre principali caratteristiche (il monomero a m / z 140, monomero protonata a m / z 141, e il 1 ,3-dimethyluracil dimero a m / z 280) come estratto da una scansione VUV tra 8 eV e 10 eV (B). L'ombra grigia è la deviazione standard da tre scansioni consecutive.

Figura 1. Schema dell'apparato sperimentale con tensioni indicate. (1) rilevatore di placca a microcanali, (2) Specchio Riflettore, (3) regione Molecular Beam, (4) ottiche di ioni per l'estrazione.

Figura 2.

Figura 3. Riscaldatore blocco con l'ugello, cartuccia di riscaldamento e termocoppia.

Figura 4. Interfaccia utente grafica del programma di acquisizione dati. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 5. Interfaccia utente grafica di dati acquisizione programma per le scansioni di efficienza fotoionizzazione. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6. Interfaccia utente grafica del programma di analisi dei dati. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 7. Uno spettro di massa ed efficienza curva fotoionizzazione per 1,3-dimethyluracil fascio molecolare.

Discussion

I monomeri e dimeri sono generati in una espansione getto supersonico che dà luogo ad un fascio molecolare. Un piccolo campione di DNA della base è posto in una sorgente di vaporizzazione termica e riscaldato a generare sufficiente pressione di vapore. Argon gas trasporta i vapori attraverso un orifizio 100 pm e passa un 2 skimmer mm per produrre un fascio molecolare a freddo ^14. In alternativa, una sorgente di fascio effusive possono essere utilizzati, dove il campione viene posto in un forno riscaldato attaccato alla piastra repeller (ottica ionica) dello spettrometro di massa.

Usiamo luce ultravioletta vuoto (7,4-25 eV) per ionizzare le molecole dolcemente per ionizzazione singolo fotone, questo metodo riduce al minimo la frammentazione e processi secondari ed è ineguagliata da tecniche di ionizzazione tradizionali che utilizzano schemi di impatto elettronico. Gli ioni vengono prodotti nella zona di interazione di un Wiley-McLaren ¹³ reflectron Time-of-Flight Mass Spectrometer dove vengono poi rilevati da amICRO canale piatto. L'uscita del rivelatore è alimentato in un pre-amplificatore e una scheda multiscaler in un personal computer dove i dati vengono salvati per ulteriori analisi. La quasi continua radiazione proveniente da un ondulatore trova al sincrotrone (Advanced Light Source), quindi passa attraverso un filtro gas dove vengono rimossi armoniche superiori della luce e disperso tramite un monocromatore m 3 per fornire una risoluzione massima di 5 MeV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Uracil	Sigma	U0750
1,3-Dimethyluracil	Aldrich	349801