Summary
Door het combineren van methoden voor RNA whole mount
Abstract
Marine kraakbeenvissen worden gewaardeerd diermodellen voor biomedisch en genoomonderzoek studies zoals ze zijn de meest primitieve gewervelde dieren adaptieve immuniteit hebben en hebben unieke mechanismen voor osmoregulatie 1-3. Als de meest primitieve levende jawed-gewervelde dieren met gepaarde aanhangsels, kraakbeenvissen zijn een evolutionair belangrijk model, met name voor studies in de evolutie en ontwikkeling. Marine kraakbeenvissen zijn ook gebruikt voor aquatische toxicologie en stressfysiologie bestuderen in relatie tot klimaatverandering 4. Aldus wordt de ontwikkeling en aanpassing van methoden die nodig te vergemakkelijken en het gebruik van deze primitieve vertebraten uitbreiden meerdere biologische disciplines. Hier presenteer ik de succesvolle aanpassing van RNA whole mount in situ hybridisatie en histologische technieken om genexpressie en histologie in kraakbeenvissen bestuderen.
Monitoring genexpressie is een kenmerk instrument van ontwikkelingsstoornissen biologists is en veel gebruikte onderzoeken ontwikkelingsprocessen 5. RNA whole mount in situ hybridisatie kan voor de visualisatie en lokalisatie van specifieke gentranscripten in weefsels van het ontwikkelende embryo. Het expressiepatroon van de boodschap van een gen kan inzicht geven in wat ontwikkelingsprocessen en mobiele beslissingen over het lot van een gen kan besturen. Door vergelijking van het expressiepatroon van een gen in verschillende ontwikkelingsstadia, wordt inzicht verkregen in hoe de rol van een gen tijdens de ontwikkeling verandert.
Terwijl whole mount in situ is een middel te lokaliseren genexpressie weefsel histologische technieken voor het identificeren van gedifferentieerde celtypen en weefsels. Histologische kleuringen hebben uiteenlopende functies. Algemene vlekken worden gebruikt om celmorfologie te markeren, bijvoorbeeld hematoxyline en eosine kleuring algemeen kernen en het cytoplasma, respectievelijk. Andere vlekken kunnen markeren specifieke celtypes. Bijvoorbeeld, de alcianblauw vlek die in dit document is een veel gebruikte kationische vlek mucosaccharides identificeren. Kleuring van het spijsverteringskanaal met alcianblauw kunnen identificeren van de verdeling van slijmbekercellen die mucosaccharides produceren. Variaties in mucosaccharide bestanddelen op korte peptiden onderscheiden slijmbekercellen naar werking in het spijsverteringskanaal 6. Door het gebruik van RNA ganse berg in situ 's en histochemische methoden tegelijkertijd, kan cel beslissingen over het lot worden gekoppeld aan gen-specifieke expressie.
Hoewel RNA in situ 's en histochemie worden op grote schaal gebruikt door onderzoekers, hun aanpassing en gebruik op volle zee kraakbeenvissen ontmoet beperkt en gevarieerd succes. Hier presenteer ik protocollen ontwikkeld voor kraakbeenvissen en gebruikt op een regelmatige basis in mijn laboratorium. Hoewel verdere modificatie van het RNA in situ 's hybridisatiewerkwijze kan nodig aan verschillende soorten protocollen beschreven provide een sterk uitgangspunt voor onderzoekers willen het gebruik van mariene kraakbeenvissen aan te passen aan hun wetenschappelijke vragen.
Protocol
I. RNA Hele Mount in situ hybridisatie in Marine kraakbeenvissen
1. Embryo Fixatie en voorbereiding
- Skate embryo's kunnen worden opgevoerd op basis van Ballard 7. Optimale fasen voor detectie van genexpressie afhankelijk van het weefsel van belang. Om genexpressie te volgen in de skate spijsverteringskanaal, stadia 27 tot 30 zijn optimaal 7.
- Ontleden embryo's in PBS, het scheiden van de embryo's van de dooierzak.
- Fix in 30 ml vers gevormde 4% paraformaldehyde (PFA) in een 50 ml conische buis bij 4 ° C onder voorzichtig schudden. Fix voor 24 uur.
- Wassen embryo in PBT, tweemaal gedurende 15 minuten draaien bij kamertemperatuur. All oplossing recepten voor RNA whole mount in situ 's opgenomen (tabel 1).
- Uitdrogen embryo door wassen in een methanol serie van 25%, 50% en 75% methanol: PBT rocking bij kamertemperatuur. De duur van het wassen afhankelijk van het stadium van de embryo. Voor pre-neurulation gefaseerde embryo, 5 min elke wasbeurt in de methanol reeks voldoende. Voor embryo's ouder dan stage 30, kunnen wassingen duren tot 30 minuten. Om te bepalen of embryo's worden voldoende doorgedrongen en gewend aan elke wasbeurt, rechtop houdt u de buis in je hand. Indien de embryo naar de bodem van de buis, dan klaar voor de volgende wasbeurt. Indien de embryo drijven naar de top van de oplossing, verandert de oplossing en herhalen dat bepaalde dehydratatiestap.
- Was tweemaal in 100% methanol gedurende 10 min zachtjes schudden.
- Eenmaal gedehydrateerd tot 100% methanol moet embryo worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste 24 uur alvorens de protocol. Embryo's zijn succesvol opgeslagen bij -20 ° C en gebruikt voor RNA whole mounts tot 1 jaar.
2. Synthese van RNA Probe
- Genereer een lineaire fragment van het gen waarvan de expressie u wilt detecteren. Dit kan worden gedaan door PCR amplificatie of lineariseren een plasmide met genenvan belang. Te versterken door PCR, primers kiezen die bindingsplaatsen flankeren het gen in te voegen en te behouden RNA polymerase bindingsplaatsen in het geamplificeerde gebied. Voor algemeen gebruikte plasmiden zoals pBS of pGEM, M15 forward en reverse primers zijn ideaal. Alternatief lineariseren een plasmide door digestie 15 pi van QIAGEN miniprep DNA met een enzym dat knipt op het 5'-uiteinde van het gen. Gel extraheren en zuiveren met behulp van de juiste QIAquick kit.
- Reverse transcriberen de RNA probe met 8 pi lineaire plasmide of 100 ng PCR-product als een matrijs met een geschikte RNA polymerase (zie tabel 2 voor transcriptiereactie).
- Incubeer reverse transcriptie reactie gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Om de reactiesnelheid te bevestigen run 1 pi van de transcriptie reactie op een 1% agarose / TAE gel. Run gel bij 100 mVolts totdat de kleurstof is alleen nog maar in de gel. Een enkele prominente band moet zichtbaar zijn. De lineaire DNA template fragment kan vaag zichtbaar op een hoger moleculairelar gewicht.
- Voeg 1 pl RNAse-vrij DNAse I bij de transcriptiereactie en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Neerslaan, voeg 100 ul TE pH 8, 10 pi 4 M LiCl, 300 pl 100% EtOH en incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 60 minuten of overnacht.
- Spin gedurende 10 min in een microfuge 4 ° C bij 14.000 rpm.
- Was de pellet met 70% EtOH en de lucht drogen.
- Resuspendeer RNA probe in 20 pl dH 2 O. Voeg 80 ul hybridisatiebuffer (hybridisatiebuffer worden voorverwarmd tot 70 ° C). De probe kan worden opgeslagen in 80% hybridisatiebuffer enkele maanden bij -20 ° C of meer bij -80 ° C.
3. Embryo Voorbehandeling en hybridisatie
- Verwijderen embryo opgeslagen in 100% methanol bij -20 ° C. Voor jongere embryo's gaat u naar stap (3.2). Voor latere geënsceneerde embryo's (stadium 29/30 <) kunt u een epidermis laag die is 'opgetild' uit het lichaam van het embryo te zien. Onder de microscoop, zorgvuldig dissect van de epidermale laag naar sonde penetratie te maximaliseren.
- Plaats embryo's in een schone glazen scintillatieflesjes. Rehydrateren de embryo reverse methanol series hierboven beschreven: (75%, 50%, 25% methanol: PBT) door tuimelen voorzichtig elke oplossing gedurende 5-30 min elk bij kamertemperatuur. Compleet rehydratie met twee wasbeurten van PBT gedurende 10 minuten elk, zachtjes wiegen.
- Om pigment, bleekmiddel embryo verwijderen met 6% waterstofperoxide in PBT gedurende 1 uur bij kamertemperatuur schommelen.
- Verwijderen waterstofperoxide door driemaal wassen in PBT (schommelen bij kamertemperatuur, 10 min elk).
- Behandel embryo met proteinase K om voor penetratie van probe hybridisatie in. De hoeveelheid proteinase K en de duur van de behandeling is afhankelijk van de gewenste weefsel te onderzoeken en de leeftijd van de embryo. Meer oppervlakkige weefsel en jongere embryo's vereisen kortere en minder proteinase K, terwijl de diepere weefsels en ouder embryo's vereisen een hogere concentratie en langere behandeling time volledig doorlaatbaar voor de embryo probe hybridisatie. Bijvoorbeeld Shh detecteren in de darm van endoderm toneel 29 skate embryo, 30 ug / ml proteinase K / PBT gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Snel spoelen embryo's in PBT weg te wassen proteïnase K.
- Om proteinase K, postfix embryo deactiveren met 4% PFA, 0,2% glutaaraldehyde in PBT gedurende 20 min voorzichtig schommelen.
- Was tweemaal gedurende 10 minuten met PBT.
- Voor pre-hybridisatie, voeg 2-3 ml voorverwarmde hybridisatieoplossing aan het embryo, net genoeg om ze te bedekken. Rock voorzichtig in een verwarmd waterbad bij 70 ° C gedurende 1 uur.
- Om hybridisatieoplossing Verwarm RNA probe te bereiden tot 70 ° C gedurende 10 min en afkoelen op ijs. Verdun 15-20 pl RNA probe tot 2 ml verse voorverwarmde hybridisatieoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0 pg / ml. Verwijder pre-Hybe en voeg verdunde RNA-probe om embryo's. Embryo's moeten gewoon worden gedekt door oplossing, eendd meer hybridisatieoplossing indien nodig. Strak veilige deksel van scintillatieflesje. Hybridiseren door tuimelen voorzichtig in een verwarmd waterbad bij 70 ° C geroerd.
4. Bericht Hybridisatie Wast en Antilichaam Hybridisatie
- Verwijder hybridisatie-oplossing met sonde uit embryo's en plaats in een frisse scintillatieflesje of Eppendorf buis. De probe kan worden opgeslagen bij -20 ° C en opnieuw in de toekomst. Voor post-hybridisatie wasbeurten, plaats embryo's in een Netwell zitten in een 6-well weefselkweek plaat.
- Was drie keer voor elke 30 min in voorverwarmde Oplossing 1, slingeren bij 70 ° C.
- Was drie keer voor elke 30 min in voorverwarmde Oplossing 2, slingeren bij 70 ° C.
- Was 3 keer gedurende 5 min elk in TBST, schommelen bij kamertemperatuur.
- Pre-blok met 10% hitte-geïnactiveerd serum schapen in TBST gedurende 1 uur schommelen bij kamertemperatuur.
- Transfer embryo's van Netwell een nieuwe glazen scintillatieflesje. Voeg anti-DIGFab fragmenten (1:5000) in 1% hitte-geïnactiveerd serum schapen / TBST de embryo's. Rock overnacht bij 4 ° C.
5. Bericht Antilichaam Hybridisatie Wast
- Verwijder antilichaam en gooi deze weg. Plaats embryo's terug in Netwell voor wasbeurten.
- Was 3 keer gedurende 5 minuten elk in TBST, rocken bij kamertemperatuur
- Wassen minstens 6 keer gedurende 1 uur elk schommelen bij kamertemperatuur.
- Was 's nachts in TBST, rocken bij 4 ° C. Als de post antilichaam wasbeurten helpen bezuinigen op achtergrondkleuring, het maximaliseren van het aantal en de duur van de wasbeurten de voorkeur. Embryo's routinematig gewassen in TBST bij 4 ° C, over het weekend.
6. Detectie van Probe
- Make up verse NTMT oplossing en filteren steriliseren.
- Gooi TBST wasoplossing en plaats embryo's in een schoon glas scintillatieflesje. Wassen embryo 3 maal in vers NTMT gedurende 10 min. elk bij kamertemperatuur schudden.
- Verwijder NTMT wassen en voeg reactiemengselvan 1 x NBT / BCIP 1 x in NTMT. Aangezien deze reagentia zijn lichtgevoelig betrekking scintillatievat in folie en rock bij kamertemperatuur.
- Monitor kleurreactie elke 15 min tot gewenste genexpressie duidelijk zichtbaar. Sterke probes kunnen zo weinig als 10 minuten te ontwikkelen. Zwakke probes kunnen 1-2 uur. Laat niet reactie te lang duren of achtergrondkleuring zal beginnen te verschijnen (het hele embryo begint te draaien een saaie paarse of bruine kleur).
- 2 keer wassen gedurende 10 min. elk in PBT bij kamertemperatuur schudden.
- Postfix embryo in 4% paraformaldehyde, 0,1% glutaaraldehyde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Embryo's store onbeperkt in fixatief bij 4 ° C.
- Visualiseer embryo's met een dissectie stereomicroscoop. Om een lichtblauwe achtergrond voor foto's, plaats embryo's in een schotel met pre-geharde 1% agarose / PBS te produceren.
7. Representatieve resultaten voor I. RNA Hele Mount in situ hybridisatie in mariene kraakbeenvissen
RNA whole mount in situ 's afbeelden expressie van Sonic hedgehog (Shh) en in Hoxa13 skate embryo worden getoond in Figuur 1. Expressie van Shh in hogere vertebraten wordt gevonden in de notochorda en darmen endoderm en deze expressie wordt bewaard in de schaats (figuur 1a) 8,9. Marine kraakbeenvissen een unieke methode osmoregulatie de rectale klier gebruikt zouten te scheiden. Hoxa13 expressie hoog in ontwikkelingslanden rectale klier (figuur 1b) 10. Hoxa13 genproduct rol patroonvorming van de rectale klier onbekend blijft.
II. Paraffine Inbedding en snijden Elasmobranch Tissue
1. Oogst en bereiding van Tissue
- Ontleden gewenste weefsel-en lossen in 10% formaline gedurende 24-48 uur, schommelen bij kamertemperatuur. 4% paraformaldehyde (PFA) kan ook gebruikt worden als fixeermiddel(Zie Discussie).
- Wassen fixeermiddel door wassen in PBS, 3 keer 30 min elk. Afhankelijk van de grootte van het weefsel, kan wastijden worden verminderd tot 10 min of verhoogd tot 1 uur.
- Uitdrogen embryo door wassen in een ethanol serie van 25%, 50% en 75% ethanol: PBS rocking bij kamertemperatuur. Nogmaals, de tijd voor elke wasbeurt afhankelijk van de grootte van het weefsel. Voor 0,5 cm3 weefsel, incubeer elke wasbeurt 15 minuten. Verhoog de tijd voor grotere stukken. Indien langdurige opslag van weefsel gewenst is, was nog twee keer in 75% ethanol en bewaar -20 ° C gedurende maximaal een jaar. Anders gaat u verder met de volgende stap.
- Verder drogen door wassen 3 maal in 100% ethanol gedurende 15 minuten elk, schommelen.
2. Paraffine Inbedding en Snijden
- Verduidelijk weefsel door het wassen 2 keer in xyleen gedurende 5 min elk in glazen scintillatieflesjes met schroefdop deksels. Xyleen zal maken het weefsel bros, dus niet meer dan een totaal van 10 minuten voor washes. Het weefsel moet kijken doorschijnend als je houd het tegen het licht. Als het weefsel nog zeer opaak na twee wasbeurten, doen een extra wassen in xyleen gedurende 5 minuten en vervolgens doorgaan met protocol. Alleen omgaan met xyleen in een zuurkast met handschoenen.
- Verwijder xyleen en vul de scintillatieflesje 2/3 vol met gesmolten paraffine. Incubeer in een 60 ° C oven gedurende 30 minuten. Bij het opzetten paraffine in de injectieflacon, zul je de paraffine stolt langs de zijkanten van de flacon. Plaats het flesje in de oven en laat de paraffine opnieuw oplossen enkele minuten. Neem het flesje uit de oven en geven de oplossing snel werveling te mengen en vervangen oven voor verdere incubatie.
- Repeat paraffine incubaties twee keer gedurende 30 minuten.
- Twee keer Incubeer in paraffine voor een uur per stuk. Wijzig paraffine een laatste keer en incubeer overnacht in het 60 ° C oven.
- De volgende dag plaats het weefsel in een verwarmde kamer paraffinebad en plaats onder vacuüm gedurende 2-3 uur. Dit zal infiltratie van paraffine in het weefsel en verwijder eventuele luchtbellen. Voor sommige soorten dunne weefsel kan een vacuüm stap niet vereist, maar het is noodzakelijk voor hele embryo en maagdarmkanaal en andere organen luminale compartimenten.
- Na vacuüm-vergemakkelijkt infiltratie van weefsel, plaats weefsel in een metalen mal met gesmolten paraffine, en laat afkoelen op een ijs plaat. Reactie op ijs of bij 4 ° C gedurende de nacht voordat u het weefsel uit de matrijs te verwijderen. Paraffineblokken van weefsel kan onbeperkt worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Plaats paraffineblok op een microtoom en snijd 8 urn secties. De preparaten moeten worden geïntroduceerd op een waterbad verwarmd tot 48 ° C en gemonteerd op glas Superfrost * Plus dia's.
- Droge dia overnacht in een 37 ° C oven.
- Store secties bij 4 ° C tot gebruik.
III. Alcian Blauw / Nuclear Fast Red Stain van Elasmobranch Tissue
1. Alcian Blue Stain voor mucinen
- Plaats de glaasjes met secties naar boven op een dia warmer. Smelt 45 minuten.
- Plaats de glaasjes in een houder. Alle daaruit voortvloeiende oplossingen zijn opgenomen in kuipen in een zuurkast. Dia's worden gewassen door deze van de ene bad met een oplossing naar de andere. Zorg ervoor dat de oplossing niveaus in de baden de dia's dekt; de weefsels op de dia's worden volledig ondergedompeld zijn. Los paraffine door wassen slides 2 keer in xyleen gedurende 5 minuten elk.
- Wassen dia tweemaal met 100% ethanol gedurende 1 min elk.
- Rehydrateren slides in een ethanol serie (75%, 50%, 25% ethanol) wassen in elke oplossing gedurende 1 minuut. Wassen in dH 2 O 1 minuut.
- Vlek in Alcian Blue, pH 2,5 gedurende 15 minuten.
- Ontwikkel vlek door het wassen in stromend leidingwater gedurende 3 minuten. Dompel een keer in dH 2 O.
- Tegenkleuring in Nuclear Fast Red tegenkleuring gedurende 10 min.
- Was in stromend leidingwater gedurende 3 minuten en duik in dH 2 O een keer.
- Onttrekkingdrate in een ethanol serie (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) gedurende 20 dips elk of 1 min elk. 2 keer wassen in xyleen gedurende 5 minuten elk. Monteer met DPX montage medium en dekglaasjes. Laat afdekmedium te drogen en uitharden voor 48 uur in de zuurkast voor het manipuleren van dia's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorbeelden van alcianblauw kleuring in verschillende regio's van de L. erinacea spijsverteringskanaal worden getoond in Figuur 2. Acid mucine bevattende globlet cellen zijn duidelijk zichtbaar door de alcianblauw vlek in het spijsverteringskanaal. De verdeling van zure mucinen verschilt in de verschillende regio's van het spijsverteringskanaal, waardoor als gevolg van verschillen in functie. Zure mucinen zijn dun geproduceerd in de darm en cloaca spiraal, terwijl een hoge concentratie van zure mucinen worden gedetecteerd in de distale darm (vergelijk figuur 2a en 2c met 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Filter-steriliseren in Nalgene-type weefselkweek filterunits. | |
| 20 x SSC, pH 4,5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M NaCitrate | |
| Breng de pH met citroenzuur. | |
| Hybridisatieoplossing | 50% formamide |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% Chaps | |
| 100 mg / ml heparine | |
| Aliquot en bij -20 ° C gedurende maximaal een jaar. | |
| Proteinase K | 10 mg / ml voorraadoplossing |
| 20 ul aliquots van 0,5 pi Eppendorf-achtige buizen en sla op bij -20 ° C. | |
| Oplossing 1 | 50% formamide |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Bewaren bij -20 ° C | |
| Oplossing # 2 | 50% formamide |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Bewaren bij -20 ° C | |
| Schapen serum | Inactiveren door verwarming tot 55 ° C gedurende 1 uur en bewaar in monsters bij -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Voeg water toe tot 1 L | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Maak ongeveer 100 ml vers voor u en filter. | |
| 200 x NBT voorraad | 50 mg / ml NBT in 70% dimethyl formamide |
| Store in -20 ° C in 1 ml porties. | |
| 200 x BVIE voorraad | 25 mg / ml BCIP in water |
| Store in -20 ° C in 1 ml porties. |
Tabel 1. RNA ganse berg in situ oplossingen.
| Gelineariseerd plasmide | 8 pl |
| 10 x transcriptiebuffer | 4 pi |
| DIG-UTP nucleotide mix | 2 pi |
| RNAse inhibitor | 0,5 pl |
| RNApolymerase (SP6, T7 of T3) | 1 pi |
| RNAse-vrij steriele H 2 0 | 4,5 pl |
| Totaal volume | 20 pi |
Tabel 2. Transcriptiereactie om RNA probe genereren.
Figuur 1. Shh en Hoxa13 expressie in Leucoraja erinacea embryo's gevisualiseerd door RNA whole mount in situ hybridisatie. (A) Shh expressie wordt gedetecteerd in een stadium 29 embryo skate. (A) Hogere vergroting van (a) toont Shh expressie in de notochord (pijlpunten) en darm endoderm (pijlen). (b) Hoxa13 expression is gelokaliseerd in de rectale klier (pijl) van een stage 29 embryo skate (b) ontleed spijsverteringskanaal van de embryo in (b) toont de specificiteit van expressie transcript Hoxa13 de rectale klier e, endoderm,.. n, notochorda ;. rg, rectale klier Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Verdeling van zure mucine producerende slijmbekercellen in de skate spijsverteringskanaal. (A, c) Laag aantal zure mucine producerende bekercellen worden gedetecteerd door de alcianblauw vlek in de spiraal darm en cloaca respectievelijk (pijlen). (B)Het distale darm bevat een hogere dichtheid van zure mucine slijmbekercellen (pijlen). In alle panelen, kernen zijn duidelijk zichtbaar door de nucleaire snelle rode vlek. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde protocollen zijn klassieke methoden voor monitoring van genexpressie en identificeren gedifferentieerde celtypes, en zijn aangepast voor toepassing op schepen kraakbeenvissen. Verdere modificaties van deze protocollen kunnen nodig zijn om aan verschillende soorten kraakbeenvissen.
De meest voorkomende bezorgdheid over RNA whole mount in situ 's is het risico op besmetting RNase en daardoor de afbraak van de RNA probe en endogene berichten. Twee aspecten moeten worden overwogen: de synthese van de riboprobe en de hybridisatie aan embryonale berichten, en algemene technieken voor het omgaan met RNA. In het algemeen kan verontreiniging met ribonucleases worden vermeden door gebruik van plasticware ongeopende verpakking, en eerder gebruikt glaswerk. Als er nieuwe glaswerk niet beschikbaar is, behandelen alle glaswerk met RNase-AWAY (VWR # 17810 tot 491). Wast zijn gedaan door voorzichtig afgieten oplossingen door middel van een geperforeerde lepel en het toevoegen van verse oplossing aan de flacon.Als alternatief kunnen kleine embryo of organen / weefsels worden in een Netwell die past in een 6-well weefselkweekplaat. Het weefsel kan worden verplaatst van een oplossing van de volgende door eenvoudig de Netwell van ene naar de volgende. Dit voorkomt het verlies van weefsel door gieten, en bewaart ook de architectuur van het weefsel. Meer suggesties voor het behandelen en voorkomen van RNA RNase besmetting vindt in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, en op verschillende farmaceutische websites, waaronder Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generatie van de RNA-probe en voorbehandeling en hybridisatie van embryo's zijn het meest kwetsbaar stappen om besmetting door ribonucleasen. Antisense-RNA-probes die inheemse mRNA-transcript te vullen worden gesynthetiseerd door in vitro reverse transcriptie in de presence van digoxigenine-UTP. In het kort worden cDNA plasmiden gelineariseerd met een unieke restrictie-enzym wiens locatie ligt aan het 5 'uiteinde van het gen. Dit zorgt voor de RNA polymerase af te vallen aan het einde van het gen. Kies een RNA polymerase door het identificeren van RNA polymerase promoter in het plasmide net 3 'van het stopcodon. Hoewel T3 en T7 RNA polymerase worden vaak gebruikt voor pBluescript, SP6 is de keuze voor genen gesubkloneerd in de richting pGEM plasmiden. Naast RNase inhibitor wordt DEPC-behandeld water in de transcriptiereactie en zuivering van de probe. Hybridisatieoplossing en stappen met PBT in de voorbehandeling van embryo's worden gemaakt, met DEPC water. Om DEPC traktatie water, voeg 1 ml DEPC tot 1 liter water in een grote kolf en meng goed. Laat een nacht in een kap en autoclaveren de volgende dag. Oplossingen zoals 10 x PBS en SSC kunnen ook worden gemaakt met DEPC behandeld water. Na hybridisatie met de riboprobe het gebruik van RNase-vrij, zodatsingen en dergelijke voorzorgsmaatregelen niet meer nodig.
Bijkomende variabelen overwogen de concentratie en de proteinase K behandeling, die de penetratie van de sonde kunnen beïnvloeden. Een zorgvuldige titratie van de proteinase K voorraad wordt aanbevolen de behandeling te optimaliseren voor verschillende embryonale stadia. De hier beschreven protocol is routinematig en met succes gebruikt embryo stadia 20-31 volgens Ballard 7. Voor embryo's die nog erg jong zijn of weefsel dat is bijzonder "sticky", kan het wasmiddel Tween-20 worden vervangen door Triton-X. Daarnaast kunnen genspecifieke wijzigingen in het protocol noodzakelijk zijn, afhankelijk van de hoeveelheden van transcript. Om achtergrond te verminderen, heeft 10% dimethylformamide werd routinematig toegevoegd aan de ontwikkeling oplossing (NTMT) door verschillende groepen 12.
In tegenstelling tot de gevoelige aard van RNA in situ 's, de vreugde van histologie is dathet is snel en mooi waterdicht! Enige variabiliteit in kleuring waarschijnlijk door onvoldoende fixatie. Opdat weefsel volledig vastgesteld, wordt aanbevolen dat grote weefsels (zoals het spijsverteringskanaal van een volwassen dier) worden opgesplitst in kleinere stukken en verse Fixatief vervangen elke 10 uur gedurende een 48 uur periode. Het kan nodig zijn om te optimaliseren voor fixatie, zowel onder en boven gefixeerde weefsels leiden tot een slechte of onregelmatige kleuring snijden. Bovendien hebben verschillende histochemische vlekken werken optimaal met verschillende fixatieven. Zo is het goed bewerken van het fixeermiddel volgens de histochemische kleuring gebruikte 13. 4% paraformaldehyde wordt aanbevolen bij de vaststelling van weke delen organen of jonge embryo's. Voor oudere embryo's of hele dieren, 10% formaline voorkeur. Zodra weefsel paraffine ingebed en in coupes, kan gebruikt worden voor meerdere doeleinden, waaronder RNA in situ s. Dit maakt oplossing van genexpressie op de mobiele level. Als alternatief kan delen worden gekleurd met verschillende histochemische vlekken op gedifferentieerde celtypen te identificeren.
De alcianblauw en nucleaire snelle rode vlekken is met succes uitgevoerd in de skate (Leucoraja erinacea), hondshaai (Squalas acanthias), slijmprikken (Myxine glutinosa) en lamprei (Petromyzon marinus), (niet gepubliceerde resultaten) 10,14. Naast de alcianblauw pH 2,5 vlek hier beschreven wijziging van de pH van de oplossing alcianblauw verschillende mucosaccharides (ie sialo-versus sulfomucins) 13 onderscheiden. Verschillende mucosaccharide bestanddelen kunnen onderscheiden slijmbekercellen door functie en lokalisatie binnen het spijsverteringskanaal 15,16. Alcianblauw vlek in het spijsverteringskanaal is gebruikt om aandoeningen zoals Barrett's slokdarm diagnosticeren en kleuring van beta-cel granules 17,18 verbeteren.
Summairmary, histochemie en RNA whole mount in situ is wanneer samen gebruikt kan leiden tot een beter begrip van het verband tussen waar een gen tot expressie tijdens de ontwikkeling en de resulterende gedifferentieerde celtype. Expressie van posterior Hox genen is gekoppeld aan de specificatie van zuur mucine slijmbekercellen in de ontwikkeling spijsverteringskanaal 10,19. Here I een voorbeeld van de expressie van Shh en Hox gen samen met de aanwezigheid van zuur mucine producerende slijmbekercellen in de L. erinacea spijsverteringskanaal. Deze technieken kunnen op grote schaal worden toegepast op verschillende soorten kraakbeenvissen, verschillende ontwikkelingsstadia patronen genen en verschillende histologische kleuringen. De voortzetting van de toepassing en aanpassing van technieken om mariene kraakbeenvissen is belangrijk om gelijke tred te houden met de brede gebruik van deze dieren voor biomedisch onderzoek modellen in de fysiologie, endocrinologie, toxicologie en genomics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ik heb niets te onthullen.
Acknowledgments
Ik wil de vele studenten die hebben gewerkt in mijn laboratorium en heeft bijgedragen aan de evolutie van deze protocollen bedanken. NAT heeft ontvangen steun van de Skidmore-EU-Netwerk, een project opgezet met een NSF betaalde voorschot subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
