Summary
Durch die Kombination von Methoden zur RNA whole mount
Abstract
Marine-Elasmobranchien sind Tiermodelle für die biomedizinische und genomische Studien bewertet, wie sie die primitivsten Wirbeltiere adaptive Immunität und haben einzigartige Mechanismen zur Osmoregulation 1-3 sind. Da die primitivsten lebenden jawed-Wirbeltiere mit gepaart Anhängsel sind Elasmobranchien ein evolutionär wichtiges Modell, vor allem für Studien in der Evolution und Entwicklung. Marine-Elasmobranchien sind auch verwendet worden, um aquatische Toxikologie und Streßphysiologie im Verhältnis zum Klimawandel 4 studieren. So wird die Entwicklung und Anpassung von Methoden benötigt, um zu erleichtern und erweitern den Einsatz dieser primitiven Wirbeltieren zu mehreren biologischen Disziplinen. Hier präsentiere ich die erfolgreiche Anpassung der RNA whole mount in situ Hybridisierung und histologische Techniken, um die Genexpression und Histologie in Elasmobranchien studieren.
Monitoring der Genexpression ist ein Markenzeichen Tool von Entwicklungsstörungen biologists, und häufig verwendet, um zu untersuchen Entwicklungsprozesse 5. RNA whole mount in situ Hybridisierung ermöglicht die Visualisierung und Lokalisierung von spezifischen Gen-Transkripte in Geweben des sich entwickelnden Embryo. Das Expressionsmuster eines Genes kann die Nachricht Einblick in Entwicklungsprozessen und Zellschicksals Entscheidungen ein Gen kann zu steuern. Durch den Vergleich der Expression eines Gens in verschiedenen Entwicklungsstadien, können Einblick in die Rolle eines Gens Veränderungen während der Entwicklung gewonnen werden.
Während whole mount in situ "s stellt ein Mittel zum Lokalisieren von Gewebe Genexpression erlauben histologische Techniken zur Identifizierung der differenzierten Zelltypen und Geweben. Histologischen Färbungen haben unterschiedliche Funktionen. Allgemeine Flecken verwendet werden, um die Zellmorphologie zu markieren, z. B. Hämatoxylin und Eosin für allgemeine Färbung der Kerne und Cytoplasma sind. Andere Flecken markieren bestimmte ZelleTypen. Zum Beispiel die Alcianblau in dieser Veroffentlichung Fleck ist eine weit verbreitete kationische Fleck auf mucosaccharides identifizieren. Färbung des Verdauungstraktes mit Alcianblau identifizieren kann die Verteilung der Becherzellen, die mucosaccharides produzieren. Variationen in mucosaccharide Bestandteile auf kurze Peptide unterscheiden Becherzellen nach der Funktion im Verdauungstrakt 6. Durch die Verwendung von RNA whole mount in situ 's und histochemische Methoden gleichzeitig kann das Schicksal der Zelle Entscheidungen Gen-Expression verknüpft werden.
Obwohl RNA in situ 's und Histochemie weit von den Forschern verwendet werden, haben ihre Anpassung und Nutzung in marine Elasmobranchien begrenzt und abwechslungsreiche Erfolg. Hier präsentiere ich Protokolle für Elasmobranchien entwickelt und regelmäßig in meinem Labor. Obwohl weitere Modifikation der RNA in situ 's Hybridisierungsverfahren erforderlich sein, um an verschiedene Arten angepasst werden, die beschriebenen Protokolle hier S.rovide ein guter Ausgangspunkt für die Forscher, die die Nutzung der Meeresressourcen Elasmobranchien ihre wissenschaftliche Untersuchungen anzupassen.
Protocol
I. RNA Whole mount in situ Hybridisierung in Marine Elasmobranchs
Ein. Embryo Fixation und Vorbereitung
- Skate Embryonen können nach Ballard 7 ausgetragen. Optimale Stufen zur Detektion der Genexpression hängt vom Gewebe von Interesse. Um die Genexpression in der skate Verdauungstrakt verfolgen, Stufen 27-30 sind optimal 7.
- Dissect Embryonen in PBS, die Trennung der Embryonen aus dem Dottersack.
- Fix in 30 ml frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd (PFA) in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. Fix für 24 Stunden.
- Waschen Embryonen in PBT, zweimal für 15 min, Rotieren bei Raumtemperatur. Alle Lösung Rezepte für RNA whole mount in situ 's enthalten (Tabelle 1).
- Dehydratisieren Embryonen durch Waschen in einem Methanol Serie von 25%, 50% und 75% Methanol: PBT Schaukelstuhl bei Raumtemperatur. Die Dauer der Wäschen abhängig vom Stadium der Embryonen. Für Pre-neurulation inszeniert Embryonen, 5 min von jeder Wäsche in der Methanol-Serie aus. Bei Embryonen älter als Stufe 30 können Wäschen bis zu 30 min. Um festzustellen, ob Embryonen ausreichend durchdrungen und akklimatisiert jeder Wäsche, halten Sie die Tube aufrecht in der Hand. Wenn die Embryonen auf den Boden des Röhrchens sinken, dann sind Sie bereit für den nächsten Waschgang. Wenn die Embryonen auf der Oberseite der Lösung schwimmen, ändern Sie die Lösung und wiederholen, dass insbesondere Dehydratisierungsschritt.
- Zweimal waschen in 100% Methanol für 10 min sanft schaukelnden.
- Sobald dehydratisiert zu 100% Methanol, sollte Embryonen bei -20 ° C für mindestens 24 Std. werden, bevor mit dem Protokoll gespeichert. Embryonen wurden erfolgreich bei -20 ° C gelagert und für RNA ganze Halterungen für bis zu 1 Jahr.
2. Synthese von RNA-Sonde
- Generieren Sie ein lineares Fragment des Gens, dessen Ausdruck, den Sie erfassen möchten. Dies kann entweder durch PCR-Amplifikation durchgeführt werden oder Linearisieren eines Plasmids mit dem Genvon Interesse. Durch PCR zu amplifizieren, wählen Primer, deren Bindungsstellen flankieren das Gen einzufügen und zu halten RNA-Polymerase-Bindungsstellen in der amplifizierten Region. Für häufig verwendete Plasmide wie PBS oder pGEM, M15 Vorwärts und Rückwärtsprimer sind ideal. Alternativ linearisieren ein Plasmid durch Verdau 15 ul QIAGEN Miniprep-DNA mit einem Enzym, das am 5'-Ende des Gens spaltet. Gel extrahieren und zu reinigen mit dem entsprechenden QIAquick Kit.
- Reverse Transkription der RNA-Sonde unter Verwendung von 8 ul lineares Plasmid oder 100 ng PCR-Produkt als eine Matrize unter Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase (siehe Tabelle 2 für die Transkription Reaktion).
- Inkubieren reverse Transkriptionsreaktion für 2 Stunden bei 37 ° C.
- Zur Reaktion bestätigen, führen 1 ul der Transkriptionsreaktion auf einem 1% Agarose / TAE-Gel. Führen Gel bei 100 mVolt bis der Farbstoff hat gerade in das Gel laufen. Ein einziger prominenter Band sollte sichtbar sein. Die linearen DNA-Fragment kann Vorlage schwach sichtbar auf einer höheren molekularenlar Gewicht.
- Fügen Sie 1 ul RNAse-freier DNAse I der Transkription und bei 37 ° C für 15 min.
- Zur Fällung wird mit 100 ul TE pH 8, 10 ul 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH und inkubieren bei -20 ° C für mindestens 60 min oder über Nacht.
- Spin für 10 min in einem 4 ° C Mikrozentrifuge bei 14.000 Umdrehungen pro Minute.
- Waschen Pellet mit 70% EtOH und an der Luft trocknen.
- Resuspendieren RNA-Sonde in 20 ul dH 2 O. Fügen Sie 80 ul Hybridisierungspuffer (Hybridisierungspuffer auf 70 ° C vorgewärmt werden). Die Sonde kann in 80% Hybridisierungspuffer für mehrere Monate bei -20 ° C oder mehr werden bei -80 ° C.
3. Embryo Vorbehandlung und Hybridisierung
- Entfernen Embryonen in 100% Methanol von -20 ° C gelagert Für jüngere Embryonen mit Schritt (3,2) fort. Für spätere inszeniert Embryonen (Stufe 29/30 <) können Sie eine Epidermis-Schicht, die "aufgehoben" wurde aus dem Körper des Embryos zu sehen. Unter dem Mikroskop sorgfältig dissect Sie die Epidermis zur Sonde Eindringen zu maximieren.
- Ort Embryonen in sauberen Glasszintillationsröhrchen. Rehydratisieren die Embryonen in umgekehrter Reihe Methanol oben beschrieben: (75%, 50%, 25% Methanol: PBT) durch Schaukeln sanft jede Lösung für 5-30 min jeweils bei Raumtemperatur. Vollständige Rehydratisierung mit zwei Wäschen PBT für jeweils 10 Minuten, sanft schaukeln.
- Um jegliche Pigment, Bleichmittel Embryonen mit 6% igem Wasserstoffperoxid in PBT für 1 Stunde bei Raumtemperatur, schaukelnd zu entfernen.
- Entfernen Wasserstoffperoxid durch dreimaliges Waschen in PBT, (Schütteln bei Raumtemperatur, 10 min jeweils).
- Gönnen Embryonen mit Proteinase K, um das Eindringen der Sonde während der Hybridisierung zu ermöglichen. Die Menge der Proteinase K und die Dauer der Behandlung richtet sich nach der gewünschten Gewebe zu untersuchen, und das Alter des Embryos. Weitere oberflächlichen Gewebe und jüngere Embryonen erfordern kürzere und weniger Proteinase K, während tieferen Gewebe aufwärts Embryonen eine höhere Konzentration und längere Behandlungszeiten verlangen time voll permeabilisieren Embryo für Sondenhybridisierung. Um beispielsweise im Darm detektieren Endoderm der Stufe 29 Rollschuh Embryonen Shh, 30 ug / ml Proteinase K / PBT für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.
- Schnell spülen Embryonen in PBT abzuwaschen Proteinase K.
- Proteinase K, postfix Embryonen mit 4% PFA, 0,2% Glutaraldehyd in PBT für 20 min, sanft schaukelnden deaktivieren.
- Waschen Sie zweimal für 10 min mit PBT.
- Für die Vor-Hybridisierung, 2-3 ml vorgewärmte Hybridisierungslösung mit den Embryonen, gerade genug, um sie zu decken. Schaukeln sanft in einem beheizten Wasserbad bei 70 ° C für 1 Stunde.
- Um Hybridisierungslösung vorheizen RNA-Sonde bis 70 vorzubereiten ° C für 10 min und kühl auf Eis. Verdünnen von 15 bis 20 ul RNA-Sonde zu 2 ml frischem vorgewärmten Hybridisierungslösung, um eine Endkonzentration von 0,5-1,0 ug / ml zu erhalten. Entfernen Sie vor Hybe und fügen verdünnten RNA Sonde an Embryonen. Embryonen nur durch Lösung abgedeckt werden, einedd mehr Hybridisierungslösung, wenn nötig. Dicht sichere Deckel Szintillationsfläschchen. Hybridisieren durch Schaukeln sanft in einem beheizten Wasserbad bei 70 ° C über Nacht.
4. Beitrag Hybridisierung Wash und Antikörper-Hybridisierung
- Entfernen Hybridisierungslösung mit Sonde von Embryonen und in ein frisches Szintillationsfläschchen oder Eppendorf-Röhrchen. Die Sonde kann bei -20 ° C gelagert werden und erneut in die Zukunft. Für Posthybridisierung Wäschen erfolgt Embryonen in einem Netwell in einer 6-Well-Gewebekulturplatte sitzt.
- Waschen Sie 3-mal für jeweils 30 min in vorgewärmten Lösung # 1, Schütteln bei 70 ° C.
- Waschen Sie 3-mal für jeweils 30 min in vorgewärmten Lösung # 2, Schütteln bei 70 ° C.
- Waschen Sie 3-mal für jeweils 5 min in TBST, Schütteln bei Raumtemperatur.
- Vorblock mit 10% Hitze-inaktiviertes Schafserum in TBST für 1 Stunde, Schütteln bei Raumtemperatur.
- Übertragen Embryonen aus Netwell zu einem frischen Glasszintillationsröhrchen. Fügen Sie Anti-DIGFab-Fragmente (1:5000) in 1% Hitze-inaktiviertes Schafserum / TBST der Embryonen. Schaukeln über Nacht bei 4 ° C.
5. Beitrag Antikörper Hybridisierung Wäscht
- Entfernen Antikörper und zu verwerfen. Ort Embryonen zurück in Netwell für Wäschen.
- Waschen Sie 3-mal für jeweils 5 min in TBST, Schaukeln bei Raumtemperatur
- Waschen Sie mindestens 6 mal für 1 Stunde jeden, Schütteln bei Raumtemperatur.
- Waschen über Nacht in TBST, schaukelte bei 4 ° C. Da die Post Antikörper wäscht sich auf Hintergrundfärbung geschnitten helfen, die Maximierung der Anzahl und Dauer der Wäschen ist vorzuziehen. Embryonen werden routinemäßig in TBST bei 4 ° C gewaschen, über das Wochenende.
6. Detektion von Probe
- Make-up frische NTMT Lösung und filtern zu sterilisieren.
- Entsorgen TBST Waschlösung und Ort Embryonen in einem sauberen Glasszintillationsröhrchen. Waschen Embryonen 3 mal in frischem NTMT für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, Schaukeln.
- Entfernen NTMT waschen und fügen Reaktionsmixvon 1 x NBT / BCIP in 1 x NTMT. Da diese Reaktanten lichtempfindlich sind, decken Szintillationsfläschchen in Folie und Rock bei Raumtemperatur.
- Überwachen Farbreaktion alle 15 min, bis die gewünschte Genexpression ist deutlich sichtbar. Starke Sonden können so wenig wie 10 min zu entwickeln. Schwache Sonden kann 1-2 Stunden. Lassen Sie sich nicht Reaktion zu lange oder Hintergrundfärbung beginnt zu erscheinen (die ganze Embryo beginnt ein dumpfes violett oder braun verfärben) gehen.
- Waschen Sie 2 Mal für jeweils 10 Minuten in PBT bei Raumtemperatur rocking.
- Postfix Embryonen in 4% Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Embryonen können store auf unbestimmte Zeit in Fixativ werden bei 4 ° C.
- Visualisieren Embryonen mit einem Seziertisch Stereomikroskop. Um einen hellblauen Hintergrund für Bilder, Ort Embryonen in einer Schüssel mit vorvergütet 1% Agarose / PBS produzieren.
7. Repräsentative Ergebnisse für I. RNA Whole Mount in situ Hybridisierung in marine Elasmobranchien
RNA whole mount in situ 's Darstellung Ausdruck der Sonic Hedgehog (Shh) und HOXA13 in skate Embryonen sind in Abbildung 1 dargestellt. Expression von Shh bei höheren Wirbeltieren in der Chorda und Darm Endoderm gefunden und dieser Ausdruck Muster in der Skate (Abbildung 1a) 8,9 konserviert. Marine-Elasmobranchien haben eine einzigartige Methode der Osmoregulation, die rektale Verschraubung verwendet, um sezernieren Salze. HOXA13 Ausdruck ist hoch in den Entwicklungsländern rektale Verschraubung (Abbildung 1b) 10. HOXA13 Genprodukt Rolle im Strukturieren der rektalen Drüse unbekannt bleibt.
II. Paraffin Einbetten und Schneiden Elasmobranch Tissue
Ein. Ernte und Herstellung von Tissue
- Dissect gewünschten Gewebe und fixieren in 10% Formalin für 24-48 h Schütteln bei Raumtemperatur. 4% Paraformaldehyd (PFA) kann auch als Fixiermittel verwendet werden(Siehe Diskussion).
- Auswaschen Fixiermittelpartikel durch Waschen in PBS, 3 mal für jeweils 30 min. Je nach Größe des Gewebes, kann Waschzeiten bis 10 min verringert oder erhöht werden, um 1 Stunde.
- Dehydratisieren Embryonen durch Waschen in einem Ethanol Serie von 25%, 50% und 75% Ethanol: PBS Schaukelstuhl bei Raumtemperatur. Auch hier wird die Zeit für jeden Waschvorgang von der Größe des Gewebes ab. Für 0,5 cm 3 Gewebe, inkubieren jedem Waschen für 15 min. Erhöhen Zeit für größere Stücke. Wenn die Langzeitlagerung von Gewebe erwünscht ist, waschen zusätzlich zwei mal mit 75% Ethanol und Laden in -20 ° C für bis zu einem Jahr. Andernfalls mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Durch Waschen 3 mal in 100% Ethanol für je 15 min, Schaukeln entwässern.
2. Paraffin Einbetten und Schneiden
- Klären Gewebe durch Waschen 2 mal in Xylol für jeweils 5 min in Glasszintillationsröhrchen mit Schraubverschluss Deckel. Xylol machen wird das Gewebe spröde, so dass nicht mehr als insgesamt 10 Minuten für warhes. Das Gewebe sollte aussehen transluzenten, wenn Sie es halten, um ein Licht. Wenn das Gewebe noch sehr undurchsichtig nach den zwei Wäschen, machen eine zusätzliche Wäsche in Xylol für 5 min und fahren Sie dann mit dem Protokoll. Fassen Xylol in einem Abzug mit Handschuhen.
- Entfernen Xylol und füllen Sie das Szintillationsfläschchen 2/3 voll mit geschmolzenem Paraffin. Inkubieren in einem 60 ° C Ofen für 30 min. Beim Aufsetzen Paraffin in das Fläschchen, werden Sie feststellen, das Paraffin an den Seiten des Fläschchens zu festigen. Stellen Sie die Durchstechflasche in den Ofen und lassen Sie das Paraffin für ein paar Minuten wieder aufzulösen. Nehmen Sie die Durchstechflasche aus dem Ofen und geben Sie die Lösung eine schnelle Wirbel zu mischen und im Ofen für den Rest der Inkubation ersetzen.
- Wiederholen Paraffin Inkubationen noch zweimal für 30 min.
- Inkubieren in Paraffin zweimal für jeweils eine Stunde. Ändern Paraffin ein letztes Mal und über Nacht im 60 ° C heißen Ofen.
- Am folgenden Tag, legen das Gewebe in einem beheizten Paraffinbad Kammer und unter Vakuum für 2-3 h. Dies wird die Infiltration von Paraffin in das Gewebe erleichtern und entfernen Sie alle Luftblasen. Für einige Arten von dünnen Gewebe, kann ein Vakuum Schritt nicht erforderlich, aber es ist nötig für ganze Embryonen oder Verdauungstraktes und anderer Organe mit luminalen Kompartimenten.
- Nach der Infiltration von Gewebe, die Gewebeschnitte in einer Metallform mit geschmolzenem Paraffin und kühlen auf einer Eisplatte Vakuum erleichtert. Lassen Sie auf Eis oder bei 4 ° C über Nacht, bevor Sie versuchen, um das Gewebe aus der Form zu entfernen. Paraffin-Blöcke von Gewebe kann unbegrenzt bei 4 ° C gelagert werden
- Ort Paraffinblock auf einem Mikrotom und geschnitten 8 &mgr; m-Schnitte. Die Schnitte werden auf einem Wasserbad erhitzt, um 48 ° C schwebte und montiert auf Glas Superfrost * Plus Dias.
- Dry Objektträger über Nacht in einem 37 ° C Ofen.
- Laden Abschnitten bei 4 ° C bis zum Gebrauch.
III. Alcianblau / Nuclear Fast Red von Elasmobranch Tissue Stain
Ein. Alcianblau für Mucine Stain
- Die Objektträger mit den Abschnitten nach oben auf einer Folie wärmer. Melt für 45 min.
- Objektträger in einem Objektträgerhalter. Alle daraus resultierenden Lösungen werden in Wannen in einer Abzugshaube enthalten. Objektträger werden durch Übertragung von einer Wanne mit einer Lösung zur anderen gewaschen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung Ebenen in den Wannen der Folien bedeckt; das Gewebe auf den Folien sind vollständig untergetaucht. Lösen Paraffin durch Waschen Dias 2 mal in Xylol für jeweils 5 min.
- Objektträger zweimal Waschen mit 100% Ethanol für 1 Minute jeweils.
- Rehydratisieren Folien in einem Ethanol-Reihe (75%, 50%, 25% Ethanol) Waschen in jeder Lösung für 1 min. Waschen in dH 2 O für 1 min.
- Färben in Alcianblau-Lösung, pH 2,5 für 15 min.
- Entwickeln Flecken durch Waschen unter fließendem Leitungswasser für 3 min. Tauchen Sie einmal in dH 2 O.
- Gegenfärbung in Nuclear Fast Red Counterstain Lösung für 10 min.
- Waschen in fließendem Leitungswasser für 3 min und tauchen in dH 2 O einmal.
- Dehyhydrat in einem Ethanol-Serie (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) für 20 eintaucht jeder oder jeweils 1 min. Waschen Sie 2 mal in Xylol für jeweils 5 min. Eindecken mit DPX Eindeckmedium und Deckgläschen. Lassen Eindeckmedium trocknen und aushärten für 48 Stunden in der Abzugshaube vor Manipulation Dias.
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Representative Results
Beispiele Alcianblaufärbung in verschiedenen Regionen des L. erinacea Verdauungstraktes sind in Abbildung 2 dargestellt. Mucin enthaltenden Säure globlet Zellen sind deutlich sichtbar durch den Alcianblau färben gesamten Verdauungstrakt. Die Verteilung der Säure Mucinen unterscheidet sich in den verschiedenen Regionen des Verdauungstraktes und reflektiert damit Unterschiede in der Funktion. Sauren Mucine sind spärlich in der Spirale Darm und Kloake hergestellt, während eine hohe Konzentration an Säure in der distalen Mucinen Darm (vergleiche Abbildung 2a und 2c mit 2b) erkannt werden.
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| In Nalgene-Typ Gewebekultur Filtereinheiten Filter sterilisieren. | |
| 20 x SSC, pH 4,5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M Natriumcitrat | |
| Den pH-Wert mit Zitronensäure. | |
| Hybridisierungslösung | 50% Formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% Chaps | |
| 100 mg / ml Heparin | |
| Aliquotieren und bei -20 ° C für bis zu einem Jahr. | |
| Proteinase K | 10 mg / ml Stammlösung |
| 20 ul Aliquots in 0,5 ul Eppendorf-wie Rohre und bei -20 ° C. | |
| Lösung # 1 | 50% Formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Lagerung bei -20 ° C | |
| Lösung # 2 | 50% Formamid |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Lagerung bei -20 ° C | |
| Schafserum | Inaktivierung durch Erhitzen auf 55 ° C für 1 Stunde und speichern in Aliquots bei -20 ° C. |
| 10 x TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Fügen Sie Wasser auf 1 l | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgCl 2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Machen ca. 100 ml frisch vor Gebrauch und Filter. | |
| 200 x NBT Lager | 50 mg / ml NBT in 70% Dimethylformamid |
| Store in -20 ° C in 1 ml Aliquots. | |
| 200 x BCIP Lager | 25 mg / ml BCIP in Wasser |
| Store in -20 ° C in 1 ml Aliquots. |
Tabelle 1. RNA whole mount in situ-Lösungen.
| Linearisierten Plasmids | 8 ul |
| 10 x Transkriptionspuffer | 4 ul |
| DIG-UTP Nukleotid-Mix | 2 ul |
| RNAse-Inhibitor | 0,5 ul |
| RNAPolymerase (SP6, T3 oder T7) | 1 ul |
| RNAse-free sterilem H 2 0 | 4,5 ul |
| Gesamtvolumen | 20 ul |
Tabelle 2. Transkriptionsreaktion, um RNA-Sonde zu erzeugen.
Abbildung 1. Shh und HOXA13 Expression in Leucoraja erinacea Embryonen visualisiert durch RNA whole mount in situ Hybridisierung. (A) Shh Expression wird in einer Stufe 29 Rollschuh Embryo detektiert. (A ') Eine stärkere Vergrößerung von (a) zeigt, Shh-Expression in der Chorda (Pfeilspitzen) und gut Endoderm (Pfeile). (b) HOXA13 expression wird an die rektale Drüse (Pfeil) einer Stufe 29 Rollschuh Embryos lokalisiert (b ') Dissected Verdauungstraktes aus dem Embryo in (b) zeigt die Spezifität HOXA13 Transkriptexpression an die rektale Drüse e, Endoderm;.. n, Notochord ;. rg, rektale Drüse Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Verteilung von sauren Muzin-produzierenden Becherzellen der Rollschuh in Verdauungstrakt. (A, c) Niedrige Zahlen von sauren Muzin-produzierenden Becherzellen werden durch das Phthalocyaninblau in der Spirale Darm und Kloake Flecken, bzw. (Pfeile) detektiert. (B)Das distale Darm enthält eine höhere Dichte von sauren Mucin Becherzellen (Pfeile). In allen Panels sind Kerne deutlich sichtbar durch die Kernechtrot Fleck. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Die Protokolle vorgestellt werden sind klassische Methoden zur Überwachung der Genexpression und Identifizierung differenzierte Zelltypen und wurden für den Einsatz in marinen Elasmobranchien angepasst. Weitere Modifikationen dieser Protokolle erforderlich sein, um an verschiedene Arten Knorpelfischarten anzupassen.
Die häufigste Besorgnis hinsichtlich RNA whole mount in situ "s die Gefahr der Kontamination RNase und dadurch die Degradation der RNA-Sonde und endogenen Nachrichten. Zwei Aspekte müssen berücksichtigt werden: die Synthese des Ribosonde und seine Hybridisierung an embryonalen Nachrichten und allgemeinen Techniken für den Umgang mit RNA. Im Allgemeinen kann eine Kontamination durch Ribonukleasen durch Kunststoffprodukte aus ungeöffneten Behältern vermieden werden, und bisher ungenutzte Glaswaren. Wenn neue Gläser nicht verfügbar ist, behandeln alle Gläser mit RNase-AWAY (VWR # 17810-491). Wäschen durch vorsichtiges Abgießen Lösungen durch eine perforierte Löffel und Zugabe von frischem Lösung für das Fläschchen getan.Alternativ können sehr kleine Embryonen oder Organe / Gewebe, die in einer Netwell in eine 6-Loch-Gewebekulturschale passt abgegeben werden. Das Gewebe kann von einer Lösung zur nächsten durch einfaches Anheben des Netwell von einer Vertiefung zur nächsten bewegt werden. Dies verhindert den Verlust von jedem Gewebe durch Gießen, und bewahrt auch die Architektur des Gewebes. Weitere Vorschläge für den Umgang mit RNA und verhindert RNase Kontamination in Molecular Cloning gefunden werden; A Laboratory Manual, und auf mehrere pharmazeutische Websites, darunter Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Erzeugung des RNA-Sonde und Vorbehandlung und Hybridisierung der Embryonen sind die schwächsten Schritte, um eine Kontamination durch Ribonukleasen. Antisense-RNA-Sonden, die nativen mRNA-Transkript ergänzen werden durch in vitro reverse Transkription in der synthetisierten prEsence von Digoxigenin-UTP. Kurz gesagt werden cDNA Plasmide mit einer einzigartigen Restriktionsenzym dessen Seite ist am 5'-Ende des Gens befindet linearisiert. Dies ermöglicht die RNA-Polymerase zu fallen am Ende des Gens. Wähle eine RNA-Polymerase durch Identifizieren der RNA-Polymerase-Promotor in dem Plasmid, nur 3 'zu dem Stopcodon. Während T3 und T7-RNA-Polymerasen oft für pBluescript verwendet werden, ist die Wahl für SP6 Gene in die Plasmide pGEM direktionale subkloniert. Neben RNase-Inhibitor, ist DEPC-behandeltes Wasser in die Transkriptionsreaktion und Reinigung von der Sonde verwendet wird. Hybridisierungslösung und Schritte unter Verwendung PBT in der Vorbehandlung von Embryonen sollten alle mit DEPC-Wasser hergestellt werden. Um DEPC behandeln Wasser, 1 ml DEPC auf 1 l Wasser in einem großen Kolben und gut mischen. Lassen Sie über Nacht in einer Kapuze und autoklavieren am nächsten Tag. Lösungen wie 10 x PBS und SSC kann auch mit DEPC behandeltes Wasser herzustellen. Nach Hybridisierung mit der Ribosonde, die Verwendung von RNase-frei, soLösungen und ähnliche Vorsichtsmaßnahmen sind nicht mehr notwendig.
Zusätzliche Variablen erwägenswert sind die Konzentration und die Länge der Proteinase K-Behandlung, die das Eindringen der Sonde beeinflussen können. Eine sorgfältige Titration der Proteinase K Aktie wird empfohlen, die Behandlung für verschiedene Embryonalstadien optimieren. Das hier beschriebene Protokoll wurde routinemäßig und erfolgreich mit Embryonen in den Stadien 20 verwendet - 31 nach Ballard 7. Für Embryonen, die sehr jung oder für die Gewebe, die besonders "klebrig" ist, kann das Detergens Tween-20 mit Triton-X ersetzt werden. Zusätzlich kann genspezifischen Modifikationen an der Protokoll benötigt je nach Fülle der Transkript werden. In den Hintergrund zu reduzieren, hat 10% Dimethylformamid routinemäßig zur Entwicklung Lösung (NTMT) von mehreren Gruppen 12 hinzugefügt.
Im Gegensatz zu der sensiblen Natur der RNA in situ 's, ist die Freude der Histologie, dasses ist schnell und ziemlich narrensicher! Jede Variabilität Färbung ist wahrscheinlich aufgrund unzureichender Fixierung. Um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig fixiert ist, empfiehlt es sich, daß sehr große Geweben (wie etwa den Verdauungstrakt eines erwachsenen Tier) in kleinere Stücke und frische Fixierlösung seziert ersetzt werden alle 10 Stunden über einen 48-Stunden-Zeitraum. Es kann erforderlich sein, die Bedingungen für die Fixierung zu optimieren, können beide unter und über fixierten Geweben in armen Sektionieren oder ungleichmäßige Färbung führen. Darüber hinaus arbeiten verschiedene histochemische Färbungen optimal mit unterschiedlichen Fixiermitteln. Somit ist es wert, Modifizieren der Fixiermittelzusammensetzung gemäß der histochemische Färbung verwendet 13. 4% Paraformaldehyd wird empfohlen bei der Festsetzung Weichteilorganen oder junge Embryonen. Für ältere Embryonen oder ganze Tiere, 10% Formalin bevorzugt. Sobald Gewebe in Paraffin eingebettet und geschnitten, kann sie für verschiedene Zwecke verwendet werden, einschließlich in situ RNA 's. Dies ermöglicht für die Auflösung der Genexpression auf zellulärer level. Alternativ können Abschnitte mit unterschiedlichen histochemische Färbungen gefärbt werden, um differenzierte Zelltypen zu identifizieren.
Die Alcianblau und Kernechtrot Färbung wurde erfolgreich in der Skate (Leucoraja erinacea), Dornhai (Squalas acanthias), Inger (Myxine glutinosa) und Neunauge (Petromyzon marinus), (unveröffentlichte Ergebnisse) 10,14 durchgeführt. Neben der Alcianblau pH 2,5 hier beschriebene Beize, Modifizieren des pH-Werts der Lösung kann Alcianblau verschiedenen mucosaccharides (dh Sialo-versus sulfomucins) 13 unterscheiden. Verschiedene mucosaccharide Bestandteile können Becherzellen von Funktion und Lokalisation unterscheiden innerhalb des Verdauungstraktes 15,16. Alcianblau im Verdauungstrakt Fleck wurde verwendet, um Zustände wie Barrett-Ösophagus zu diagnostizieren und Färbung von pankreatischen beta-Zellen-Granulat 17,18 verbessern.
Zusammengefasstmary, Histochemie und RNA whole mount in situ 's wenn sie zusammen verwendet werden, um ein besseres Verständnis des Zusammenhangs zwischen denen ein Gen während der Entwicklung und der daraus resultierenden differenzierten Zelltyp exprimiert führen. Expression von Genen hat posterioren Hox der Spezifikation einer Säure Mucin Becherzellen der Entwicklung Verdauungstrakt 10,19 Verbindung gebracht worden. Here I stellen ein Beispiel für die Expression von Shh und einem Hox Gens zusammen mit der Anwesenheit von Säure Muzin-produzierenden Becherzellen im L. erinacea Verdauungstrakt. Diese Techniken lassen sich allgemein auf verschiedene Arten Elasmobranchien, verschiedenen Entwicklungsstadien Strukturieren Gene und verschiedenen histologischen Färbungen angewendet werden. Die fortgesetzte Anwendung und Anpassung von Techniken, um marine Elasmobranchien ist wichtig, um mit der breiten Verwendung dieser Tiere für die biomedizinische Forschung Modelle in Physiologie, Endokrinologie, Toxikologie und Genomik zu halten.
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Disclosures
Ich habe nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Ich möchte die vielen Studenten, die in meinem Labor gearbeitet haben und dazu beigetragen, die Entwicklung dieser Protokolle danken. NAT wird unterstützt von der Skidmore-Union Network, ein Projekt mit einem NSF Voraus bezahlt Gewährung eingeräumt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
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