Summary
Genom att kombinera metoder för RNA hela montering
Abstract
Marina Elasmobranchii värderas djurmodeller för biomedicinska och genomiska studier eftersom de är de mest primitiva ryggradsdjuren att ha adaptiv immunitet och har unika mekanismer för osmoregulation 1-3. Eftersom de mest primitiva levande käkförsedda-ryggradsdjur med parade bihang, Elasmobranchii är en evolutionärt viktig modell, särskilt för studier i evolution och utveckling. Marina Elasmobranchii har också använts för att studera Aquatic Toxicology och stress fysiologi i relation till klimatförändringarna 4. Således är utveckling och anpassning av metoder för att underlätta och öka användningen av dessa primitiva ryggradsdjur till flera biologiska discipliner. Här presenterar jag den framgångsrika anpassningen av RNA hela montera in situ hybridisering och histologiska tekniker för att studera genuttryck och cell histologi i Elasmobranchii.
Övervakning genuttryck är ett kännetecken verktyg för utvecklings Biologists, och är allmänt används för att undersöka utvecklingsprocesser 5. RNA hela montera in situ hybridisering möjliggör visualisering och lokalisering av specifika gentranskript i vävnader i embryot. Uttrycksmönstret av en gen budskap kan ge insikt i vad utvecklingsprocesser och cell beslut öde en gen kan styra. Genom att jämföra uttrycksmönstret av en gen i olika utvecklingsstadier, kan insikt vinnas i hur rollen av en gen ändras under utveckling.
Medan hela montera in situ är ett medel för att lokalisera genuttryck till vävnad, histologiska tekniker tillåter för identifiering av differentierade celltyper och vävnader. Histologiska fläckar har olika funktioner. Allmänna fläckar används för att markera cellmorfologi, t.ex. hematoxylin och eosin för allmän färgning av kärnor och cytoplasma, resp. Andra fläckar kan lyfta specifik celltyper. Till exempel färga Alcian blå redovisas i denna uppsats är en allmänt använd katjonisk färg för att identifiera mucosaccharides. Färgning av mag-tarmkanalen med Alcian blue kan identifiera fördelningen av bägarceller som producerar mucosaccharides. Variationer i mucosaccharide beståndsdelar på korta peptider skiljer gobletceller per funktion i mag-tarmkanalen 6. Genom att använda RNA hela mount in situ 's och histokemiska metoder samtidigt kan cellöde beslut kopplas till gen-uttryck.
Även RNA in situ 's och histokemi används flitigt av forskare, har sin anpassning och användning i marina Elasmobranchii träffade begränsad och varierande framgång. Här presenterar jag protokoll som utvecklats för Elasmobranchii och används regelbundet i mitt laboratorium. Även om ytterligare modifiering av RNA in situ s hybridiseringsmetod kan behövas för att anpassa sig till olika arter beskrivna protokollen här provide en bra utgångspunkt för forskare som vill anpassa användningen av marina Elasmobranchii till sina vetenskapliga undersökningar.
Protocol
I. RNA Hela berget in situ hybridisering i Marine Elasmobranchii
1. Embryo Fixering och beredning
- Skate embryon kan stegvis enligt Ballard 7. Optimala stegen för detektering av genuttryck beror på vävnaden av intresse. För att spåra genuttryck i skate tarmkanalen, stegen är 27-30 optimala 7.
- Dissekera embryon i PBS, separera embryon från gulesäcken.
- Fix i 30 ml nyligen gjort 4% paraformaldehyd (PFA) i en 50 ml koniskt rör vid 4 ° C med försiktig skakning. Fix för 24 timmar.
- Tvätta embryon i PBT, två gånger under 15 min, roterar vid rumstemperatur. Alla lösning recept för RNA hela mount på plats är ingår (tabell 1).
- Dehydratisera embryon genom tvättning i en metanol serie av 25%, 50% och 75% metanol: PBT gungning vid rumstemperatur. Varaktigheten av tvättningarna beror på stadiet av embryona. För pre-neurulation iscensatt embryon är 5 min på varje tvätt i metanol serien tillräcklig. För embryon äldre än steg 30, kan tvättar pågå upp till 30 minuter. För att avgöra om embryon är tillräckligt penetrerad och acklimatiserad till varje tvätt, hålla röret upprätt i handen. Om embryona sjunka till botten av röret, så är du redo för nästa tvätt. Om embryona flyter till toppen av lösningen, ändrar lösningen och upprepa just dehydratiseringssteg.
- Tvätta två gånger i 100% metanol under 10 minuter försiktigt gunga.
- När uttorkad till 100% metanol, bör embryon förvaras vid -20 ° C under minst 24 timmar innan du fortsätter med protokollet. Embryon har framgångsrikt lagras vid -20 ° C och användes för RNA hela monteringar i upp till 1 år.
2. Syntes av RNA-sond
- Skapa ett linjärt fragment av genen vars uttryck som du vill upptäcka. Detta kan göras antingen genom PCR-amplifiering eller linjärisering en plasmid med genenav intresse. Att amplifiera genom PCR, väljer primrar vars bindande ställen flankerar genen in och behålla RNA-polymeras bindningsställen i den amplifierade regionen. För vanliga plasmider såsom PBS eller pGEM, M15 framåt och omvänd primer är idealiska. Alternativt, linjärisera en plasmid genom digerering 15 il QIAGEN miniprep-DNA med ett enzym som klyver vid 5-änden av genen. Gel extrahera och rena med hjälp av lämplig QIAquick kit.
- Omvänt transkribera RNA-proben med användning av 8 ^ il av linjär plasmid eller 100 ng PCR-produkt som en mall med användning av lämpligt RNA-polymeras (se tabell 2 för transkriptionsreaktion).
- Inkubera omvänd transkriptionsreaktion under 2 h vid 37 ° C.
- För att bekräfta reaktion, kör 1 ul av transkriptionsreaktionen på en 1% agaros / TAE-gel. Kör gelen vid 100 mVolts tills färgen har bara köra in i gelén. Ett enda framträdande band ska synas. Den linjära DNA-mall fragment kan vara svagt synligt vid en högre molecunande vikt.
- Tillsätt 1 pl RNas-fritt DNas I till transkriptionsreaktionen och inkubera vid 37 ° C under 15 minuter.
- Att utfällas, tillsätt 100 pl TE pH 8, 10 | il 4 M LiCl, 300 pl 100% EtOH och inkubera vid -20 ° C i åtminstone 60 minuter eller över natten.
- Spinn under 10 min i en 4 ° C mikrofug vid 14.000 rpm.
- Tvätta pelleten med 70% EtOH och lufttorka.
- Återsuspendera RNA-prob i 20 pl dH 2 O. Lägg 80 il hybridiseringsbuffert (hybridiseringsbuffert bör förvärmas till 70 ° C). Sonden kan lagras i 80% hybridiseringsbuffert under flera månader vid -20 ° C eller längre vid -80 ° C.
3. Embryo Förbehandling och hybridisering
- Avlägsna embryon lagrade i 100% metanol från -20 ° C. För yngre embryon fortsätta med steg (3,2). För senare iscensatt embryon (etapp 29/30 <) kan du se en epidermis lager som har "lyft" av kroppen av embryot. Under mikroskop, noggrant dissect bort epidermala lagret för att maximera sond penetration.
- Placera embryon i rena glasflaskor scintillation. Rehydrera embryona i omvänd metanol serien beskrivits ovan: (75%, 50%, 25% metanol: PBT) genom att gunga försiktigt varje lösning för 5-30 min vardera vid rumstemperatur. Komplett rehydrering med två tvättar av PBT för 10 minuter vardera, försiktigt gungande.
- För att undanröja alla pigment, blekmedel embryon med 6% väteperoxid i PBT under 1 timme vid rumstemperatur, gunga.
- Avlägsna väteperoxid genom tvättning tre gånger i PBT (rocking vid rumstemperatur, 10 min vardera).
- Behandla embryon med proteinas K för att tillåta penetrering av proben under hybridisering. Mängden av proteinas K och varaktigheten av behandlingen beror på den vävnad som du vill granska och ålder av embryot. Mer ytlig vävnad och yngre embryon kräver kortare och mindre proteinas K, medan djupare vävnader och äldre embryon kräver en högre koncentration och längre behandling time till fullo permeabilisera embryot för probhybridisering. Till exempel, för att detektera Shh i tarmen endoderm av steg 29 skridskoenheter embryon, är 30 pg / ml av proteinas K / PBT inkuberades under 20 min vid rumstemperatur.
- Snabbt skölj embryon i PBT att tvätta bort proteinas K.
- För att avaktivera proteinas K, postfix embryon med 4% PFA, 0,2% glutaraldehyd i PBT under 20 min, att skaka.
- Tvätta två gånger i 10 min med PBT.
- För före hybridisering, tillsätt 2-3 ml förvärmd hybridiseringslösning till embryon, precis tillräckligt för att täcka dem. Rock försiktigt i ett upphettat vattenbad vid 70 ° C under 1 timme.
- För att bereda hybridiseringslösning, förvärma RNA-prob till 70 ° C under 10 minuter och kyl på is. Späd 15-20 il RNA-prob till 2 ml färsk förvärmd hybridiserings-lösning, för att erhålla en slutlig koncentration av 0,5-1,0 ng / ml. Avlägsna före Hybe och lägga utspädd RNA-prob för embryon. Embryon skall bara omfattas av lösning, endd mer hybridiseringslösning vid behov. Tätt säker lock scintillationsampull. Hybridisera genom gunga försiktigt i ett upphettat vattenbad vid 70 ° C över natten.
4. Post Hybridiserings tvättar och antikropp Hybridiserings
- Ta hybridiseringslösningen med sond från embryon och lägg i en färsk scintillationsampull eller Eppendorf-rör. Sonden kan lagras vid -20 ° C och återanvändas i framtiden. För efter hybridisering tvättar, placera embryon i ett Netwell sitter i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Tvätta 3 gånger under 30 min vardera i förvärmd lösning # 1, gungande vid 70 ° C.
- Tvätta 3 gånger under 30 min vardera i förvärmd lösning # 2, gungande vid 70 ° C.
- Tvätta 3 gånger under 5 minuter vardera i TBST, rocking vid rumstemperatur.
- Pre-blocket med 10% värmeinaktiverat fårserum i TBST under 1 timme, gungande vid rumstemperatur.
- Överför embryon från Netwell till ett färskt glas scintillationsflaska. Lägg anti-DIGFab-fragment (1:5000) i 1% värmeinaktiverat fårserum / TBST till embryon. Rock natten vid 4 ° C.
5. Inlägg Antikropp Hybridisering Tvättar
- Avlägsna antikropp och kasta. Placera embryon tillbaka till Netwell för tvättar.
- Tvätta 3 gånger under 5 minuter vardera i TBST, gungande vid rumstemperatur
- Tvätta minst 6 gånger under 1 timme vardera, gunga vid rumstemperatur.
- Tvätta natten i TBST, gungande vid 4 ° C. Som inlägget antikroppar tvättar bidra till att minska bakgrundsfärgning, maximera antalet och varaktigheten av tvättar är att föredra. Embryon rutinmässigt tvättas i TBST vid 4 ° C, över veckoslutet.
6. Detektion av sond
- Make up färsk NTMT lösning och filtrera sterilisera.
- Kasta lösning TBST tvätt och embryon plats i en ren glasscintillationsbehållare. Tvätta embryon 3 gånger i färsk NTMT för 10 minuter vardera vid rumstemperatur, gunga.
- Avlägsna NTMT tvätta och lägga reaktionsblandningen1 x NBT / 1 x BCIP i NTMT. Eftersom dessa reaktanter är ljuskänsliga, omfatta scintillationsflaska i folie och berg vid rumstemperatur.
- Övervaka färgreaktion varje 15 min tills önskad genuttryck syns tydligt. Starka sonder kan ta så lite som 10 minuter att utvecklas. Svaga prober kan ta 1-2 timmar. Låt inte reaktionen gå för länge eller bakgrundsfärgning börjar synas (hela embryot börjar vända en tråkig lila eller brun färg).
- Tvätta 2 gånger under 10 minuter vardera i PBT vid rumstemperatur, gunga.
- Postfix embryon i 4% paraformaldehyd, 0,1% glutaraldehyd under 1 timme vid rumstemperatur. Embryon kan lagras på obestämd tid i fixativ vid 4 ° C.
- Visualisera embryon med ett dissektionsmikroskop stereomikroskop. För att producera en ljusblå bakgrund för bilder, embryon placera i en skål med Färdigvärmebehandlat 1% agaros / PBS.
7. Representativa resultat för I. RNA Hela berget in situ hybridisering i marina Elasmobranchii
RNA hela montera in situ är föreställande uttryck av Sonic hedgehog (Shh) och Hoxa13 i skridsko embryon visas i figur 1. Uttryck av Shh i högre ryggradsdjur finns i notokorden och tarm endoderm och detta uttryck mönster bevaras i skridskon (Figur 1a) 8,9. Marina Elasmobranchii har en unik metod för osmoregulation som använder rektal körtel att utsöndra salter. Hoxa13 uttryck är hög i utvecklingsländerna rektal körtel (Figur 1b) 10. Hoxa13 genprodukten roll i mönstring den rektala körteln förblir okänd.
II. Paraffininbäddning och Sektionering Elasmobranchii Tissue
1. Skörd och framställning av vävnad
- Dissekera önskad vävnad och fixa i 10% formalin för 24-48 timmar, gunga vid rumstemperatur. 4% paraformaldehyd (PFA) kan också användas som ett fixativ(Se Diskussion).
- Tvätta ur fixativ genom tvättning i PBS, 3 gånger under 30 min vardera. Beroende på storleken av vävnaden, kan tvätt gånger minskas till 10 minuter eller ökas till 1 timme.
- Dehydratisera embryon genom tvättning i en serie av etanol om 25%, 50% och 75% etanol: PBS gungning vid rumstemperatur. Återigen, kommer tiden för varje tvätt beror på storleken av vävnaden. För 0,5 cm 3 vävnad, inkubera varje tvätt under 15 min. Öka tid för större bitar. Om långtidslagring av vävnad önskas, tvätta ytterligare två gånger i 75% etanol och lagra i -20 ° C i upp till ett år. Annars går du vidare till nästa steg.
- Ytterligare dehydratisera genom tvättning 3 gånger i 100% etanol under 15 minuter vardera, gunga.
2. Paraffininbäddning och Sektionering
- Klargör vävnad genom att tvätta 2 gånger i xylen under 5 min vardera i glasflaskor scintillation med lock skruvlock. Xylen kommer att göra vävnaden skör, så inte överstiga 10 minuter för varhes. Vävnaden ska se genomskinlig när du håller den upp till ett ljus. Om vävnaden är fortfarande mycket täckande efter två tvättar, gör ytterligare en tvätt i xylen under 5 min och sedan fortsätta med protokollet. Endast hantera xylen inne ett dragskåp med handskar.
- Ta xylen och fyll scintillationsflaska 2/3 full med smält paraffin. Inkubera i en 60 ° C ugn under 30 min. När du lägger paraffin i flaskan, kommer du att märka paraffinet stelna längs sidorna av flaskan. Placera flaskan i ugnen och låt paraffinet att återupplösa i några minuter. Ta injektionsflaskan ur ugnen och ge lösningen en snabb virvel att blanda och ersätt i ugnen resten av inkubation.
- Upprepa paraffin Inkubationer två gånger under 30 min.
- Inkubera i paraffin två gånger för en timme vardera. Ändra paraffin en sista gång och inkubera över natten i 60 ° C ugn.
- Följande dag, placera vävnaden i ett uppvärmt paraffin bad kammaren och plats under vakuum 2-3 timmar. Detta kommer att underlätta infiltration av paraffin in i vävnaden och avlägsna eventuella luftbubblor. För vissa typer av tunna vävnad, kan ett vakuum steg inte krävas, men det är nödvändigt för hela embryon eller mag-tarmkanalen och andra organ med luminala fack.
- Efter vakuum-underlättad infiltrering av vävnad, vävnad plats i en metallform med smält paraffin och svalna på en is platta. Lämna på is eller vid 4 ° C över natten innan man försöker att avlägsna vävnad från formen. Paraffinblock av vävnad kan lagras på obestämd tid vid 4 ° C.
- Placera paraffin blocket på en mikrotom och skär 8 pm sektioner. Sektioner bör flyta på ett vattenbad till 48 ° C och monteras på glas SuperFrost * Plus diabilder.
- Torra objektglasen över natten i en 37 ° C ugn.
- Förvara sektioner vid 4 ° C tills de behövdes.
III. Alcian Blue / nukleär Fast Red Stain av Elasmobranchii vävnad
1. Alcian Blue Stain för Muciner
- Placera objektglasen med sektioner vända uppåt på en bild varmare. Smälta under 45 min.
- Placera glider in i en hållare. Samtliga därav lösningar finns i badkar inne ett dragskåp. Objektglasen tvättas genom att överföra dem från ett badkar med en lösning till en annan. Se till att lösningen nivåer i badkar täcker bilderna, vävnader på bilderna är helt under vatten. Lös paraffin genom tvättning objektglasen 2 gånger i xylen under 5 min vardera.
- Tvätta objektglasen två gånger med 100% etanol under 1 minut vardera.
- Rehydrera objektglasen i en etanolserie (75%, 50%, 25% etanol) tvätt i varje lösning under 1 min. Tvätta i dH 2 O för 1 minut.
- Fläck i Alcian blue, pH 2,5 under 15 min.
- Utveckla fläck genom tvättning i rinnande kranvatten under 3 min. Doppa en gång i dH 2 O.
- Motfärga i nukleär Fast Red motfärg lösning i 10 min.
- Tvätta i rinnande kranvatten i 3 minuter och doppa i dH 2 O en gång.
- Dehydratidrate i en etanol serie (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) under 20 dopp vardera, eller 1 min vardera. Tvätta 2 gånger i xylen under 5 min vardera. Montera med DPX monteringsmedium och täckglas. Tillåt monteringsmedium att torka och härda i 48 timmar i dragskåpet innan manipulera bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på Alcian blue-färgning i olika regioner av L. erinacea matsmältningskanalen visas i figur 2. Syra mucin innehållande globlet celler är klart synliga av Alcian blue stain hela mag-tarmkanalen. Fördelningen av sura muciner skiljer sig i de olika regionerna i mag-tarmkanalen, vilket återspeglar skillnader i funktion. Sura muciner är glest produceras i spiralen tarmen och kloak, medan en hög koncentration av syra muciner detekteras i den distala tarmen (jämför Figur 2a och 2c med 2b).
| PBT | 1 x PBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| Filter-sterilisera i Nalgene-typ filter vävnadsodling enheter. | |
| 20 x SSC, pH 4,5 </ Td> | 3 M NaCl |
| 0,3 M Na-citrat | |
| Justera pH med citronsyra. | |
| Hybridiseringslösning | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 5 mM EDTA, pH 8 | |
| 50 mg / ml tRNA | |
| 0,2% Tween-20 | |
| 0,5% CHAPS | |
| 100 mg / ml heparin | |
| Alikvot och lagra vid -20 ° C i upp till ett år. | |
| Proteinas K | 10 mg / ml stamlösning |
| 20 il alikvoter in 0,5 pl Eppendorf-liknande rör och förvara vid -20 ° C. | |
| Lösning # 1 | 50% formamid |
| 1,3 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Förvara vid -20 ° C | |
| Lösning # 2 | 50% formamid |
| 1 x SSC, pH 4,5 | |
| 0,2% Tween-20 | |
| Förvara vid -20 ° C | |
| Fårserum | Inaktivera genom upphettning till 55 ° C under 1 timme, och förvara i alikvoter vid -20 ° C. |
| 10 X TBS | 80 g NaCl |
| 2 g KCl | |
| 250 ml, 1 M Tris-HCl, pH 7,5 | |
| Tillsätt vatten till 1 liter | |
| 1 x TBST | 1 x TBS |
| 0,1% Tween-20 | |
| NTMT | 100 mM NaCl |
| 100 mM Tris-HCl, pH 9,5 | |
| </ Td> | 50 mM MgClj 2 |
| 0,1% Tween-20 | |
| Gör ca 100 ml färsk innan du använder och filter. | |
| 200 x NBT lager | 50 mg / ml NBT i 70% dimetylformamid |
| Lagra i -20 ° C i 1 ml alikvoter. | |
| 200 x BCIP lager | 25 mg / ml BCIP i vatten |
| Lagra i -20 ° C i 1 ml alikvoter. |
Tabell 1. RNA hela montera in situ lösningar.
| Lineariserad plasmid | 8 | il |
| 10 x transkriptionsbuffert | 4 pl |
| DIG-UTP nukleotid mix | 2 pl |
| RNAs-inhibitor | 0,5 pl |
| RNApolymeras (SP6, T3 eller T7) | 1 il |
| RNAs-fri sterilt H 2 0 | 4,5 pl |
| Total volym | 20 il |
Tabell 2. Transkriptionsreaktion för att generera RNA-prob.
Figur 1. Shh och Hoxa13 expression i Leucoraja erinacea embryon visualiseras av RNA hela montera in situ hybridisering. (A) Shh uttryck detekteras i ett steg 29 skridsko embryo. (A ') Högre förstoring av (a) visar Shh uttryck i notokord (pilhuvuden) och tarm endoderm (pilar). (b) Hoxa13 expression är lokaliserad till den rektala körtel (pil) i ett steg 29 skridsko embryo (b ') dissekerade matsmältningskanalen från embryot i (b) visar specificiteten av Hoxa13 avskrift uttryck för rektal körtel e endoderm,.. N, notokord ,. rg, rektal körtel Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Fördelning av sura mucin-producerande bägarceller i skridskon mag-tarmkanalen. (A, c) Lågt antal av sura mucin-producerande bägarceller detekteras av Alcian blå fläck i spiralen tarmen och kloak, respektive (pilar). (B)Den distala tarmen innehåller en högre densitet av sura celler mucin bägare (pilar). I alla paneler, kärnor syns tydligt genom den nukleära snabba röda fläcken. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De presenterade protokoll är klassiska metoder för att övervaka genuttryck och identifiera differentierade celltyper och har anpassats för användning i marina Elasmobranchii. Ytterligare modifieringar av dessa protokoll kan behövas för att anpassa sig till olika Elasmobranchii arter.
Den vanligaste oro RNA hela montera in situ 's är risken för RNas kontaminering och därmed nedbrytningen av RNA-sonden och endogena meddelanden. Två aspekter måste beaktas: syntesen av riboprob och hybridisering till embryonala meddelanden och allmänna metoder för hantering av RNA. I allmänhet kan förorenas av ribonukleaser undvikas genom att använda plastartiklar från oöppnad och tidigare oanvänd glas. Om nya glas är tillgänglig behandla alla glas med RNas-AWAY (VWR # 17.810-491). Tvättningar görs genom att försiktigt hälla av lösningar genom en perforerad sked och tillsätta färsk lösning till flaskan.Alternativt, kan mycket små embryon eller organ / vävnader placeras i en Netwell som passar in i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta. Vävnaden kan flyttas från en lösning till nästa genom att helt enkelt lyfta Netwell från en brunn till nästa. Detta hjälper till att förhindra förlust av någon vävnad genom att hälla, och även bevarar arkitekturen hos vävnaden. Ytterligare förslag för att hantera RNA och förhindra RNas förorening kan hittas i Molecular Cloning, A Laboratory Manual, och på flera läkemedelsföretag webbplatser, inklusive Roche ( http://www.roche-applied-science.com/labfaqs/p2_1.htm ) 11 .
Generering av RNA sond och förbehandling och hybridisering av embryon är de mest utsatta steg till förorening av ribonukleaser. Antisens-RNA-prober som kompletterar nativt mRNA-transkript syntetiseras genom in vitro omvänd transkription i presence av digoxigenin-UTP. Kortfattat cDNA plasmider lineariserades med en unik restriktionsenzym vars ställe är beläget vid 5-änden av genen. Detta möjliggör för RNA-polymeraset att falla av vid slutet av genen. Välj en RNA-polymeras genom att identifiera RNA-polymeras-promotorn finns i plasmiden, precis 3 'till stoppkodonet. Medan T3 och T7-RNA-polymeraser används ofta för pBluescript, är SP6 valet för gener subklonades in i pGEM riktade plasmiderna. Förutom RNas-inhibitor, är DEPC-behandlat vatten som används i transkriptionsreaktion och rening av sonden. Hybridiseringslösning och steg med PBT i förbehandlingen av embryon bör alla göras med DEPC vatten. Till DEPC behandla vatten, tillsätt 1 ml DEPC till 1 liter vatten i en stor kolv och blanda väl. Låt stå över natten i en huv och autoklavera nästa dag. Lösningar som 10 x PBS och SSC kan också göras med DEPC-behandlat vatten. Efter hybridisering med riboprob, användning av RNas-fri sålösningar och liknande försiktighetsåtgärder inte längre behövs.
Ytterligare variabler värt att överväga är koncentrationen och proteinas K-behandling, vilket kan påverka penetrationen av sonden. En noggrann titrering av proteinas K beståndet rekommenderas för att optimera behandlingstiden för olika embryonala stadier. Protokollet som beskrivs här har rutinmässigt och framgångsrikt används med embryon i steg från 20 till 31 enligt Ballard 7. För embryon som är mycket unga eller för vävnad som är särskilt "klibbiga", kan rengöringsmedlet Tween-20 ersättas med Triton-X. Dessutom kan gen-specifika modifieringar av protokollet behövas beroende på överflöd av transkriptet. För att minska bakgrunden, har 10% dimetylformamid rutinmässigt till utvecklingen lösningen (NTMT) av flera grupper 12.
I motsats till den känsliga naturen av RNA in situ är, är glädjen i histologi somDet är snabbt och ganska idiotsäker! Varje variation i färgning beror sannolikt på otillräcklig fixering. För att säkerställa att vävnad helt fixerad, rekommenderas det att mycket stora vävnader (såsom mag-tarmkanalen hos ett vuxet djur) dissekeras i mindre bitar och färsk fixeringslösning ersättas varje 10 h under en 48 h period. Det kan vara nödvändigt för att optimera förutsättningarna för fixering, kan både under och över-fast vävnader resultera i dålig sektionering eller ojämn färgning. Dessutom olika histokemiska fläckar fungera optimalt med olika fixativ. Således, är det värt att modifiera fixativ enligt histokemiska fläcken användes 13. 4% paraformaldehyd rekommenderas vid fastställandet mjukdelar organ eller unga embryon. För äldre embryon eller hela djur, 10% formalin föredrages. När vävnaden är paraffin bäddades och snittades, kan den användas för flera syften, inklusive RNA in situ-talet. Detta möjliggör för upplösning av genexpression på cellulär level. Alternativt kan sektioner färgas med olika histokemiska fläckar att identifiera differentierade celltyper.
Den Alcian blå och nukleär Fast Red färgning har utförts med godkänt resultat i skridskon (Leucoraja erinacea), pigghaj (Squalas acanthias), pirål (Myxine glutinosa) och nejonöga (Petromyzon marinus), (opublicerade resultat) 10,14. Förutom den Alcian blue pH 2,5 fläck beskrivs här, modifiera pH Alcian blue lösningen kan särskilja olika mucosaccharides (dvs. sialo-kontra sulfomucins) 13. Olika mucosaccharide beståndsdelar kan skilja gobletceller efter funktion och lokalisering inom mag-tarmkanalen 15,16. Alcian blue stain i tarmkanalen har använts för att diagnostisera sjukdomar såsom Barretts esofagus och öka färgning av pankreatiska beta-celler granulat 17,18.
I summamary, histokemi och RNA hela montera in situ är när de används tillsammans kan leda till en bättre förståelse av sambandet mellan där en gen uttrycks under utveckling och den resulterande differentierad celltyp. Uttryck av bakre Hox gener har kopplats till specifikation av bägare sura mucin celler i utvecklingen tarmkanalen 10,19. Här har jag ett exempel på uttrycket av Shh och en Hox-gen tillsammans med närvaron av sura mucin-producerande bägarceller i L. erinacea mag-tarmkanalen. Dessa tekniker kan tillämpas allmänt på olika arter av Elasmobranchii, olika utvecklingsstadier gener mönstring och olika histologiska fläckar. Den fortsatta tillämpningen och anpassning av tekniker för marina Elasmobranchii är viktigt att hålla jämna steg med den breda användningen av dessa djur för biomedicinsk forskning modeller i fysiologi, endokrinologi, toxikologi och genomik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jag har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Jag vill tacka de många studenter som har arbetat i mitt laboratorium och bidragit till utvecklingen av dessa protokoll. NAT har fått stöd från Skidmore-Union Network, ett projekt upprättas med en NSF utbetalda förskottet bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. | |||
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
