Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Published: March 17, 2013 doi: 10.3791/50167
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Infectious Diseases, New York State Department of Health

Summary

هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.

Abstract

بقع باير (PPS) جزءا لا يتجزأ من أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) ولعب دورا محوريا في الأمعاء والترصد المناعي التوازن. يتم أخذ عينات باستمرار مستضدات الجسيمات والجراثيم في لمعة الأمعاء من قبل خلايا M PP في ظهارة جريب المرتبطة (FAE) ونقلها إلى شبكة الكامنة وراء الخلايا الجذعية (DCS)، الضامة، والخلايا الليمفاوية. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكولات التي هي ذكر المكتب الصحفى الفئران (ط) فصل في تعليق خلية واحدة وتعرض لالتدفق الخلوي و (الثاني) والتي أعدت للcryosectioning المناعية. لالتدفق الخلوي، ذكر المكتب الصحفى لفصل ميكانيكيا ثم يصفى من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لتوليد تعليق خلية واحدة خالية من الخلايا الظهارية والحطام الكبيرة. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى (من أربعة الفئران)، وهذه الطريقة سريعة وقابلة للتكرار غلة يبلغ عدد سكانها> 2.5 × 10 6 خلايا مع> بقاء الخلية 90٪. لجديدة، cryosectioningذكر المكتب الصحفى لاي مغمورة معزولة في قطع الأمثل المتوسطة (OCT) درجة الحرارة، الأداة الإضافية المجمدة في النيتروجين السائل، ثم مقطوع باستخدام cryomicrotome. أقسام الأنسجة (5-12 ميكرون) هي الهواء المجفف، ثابتة مع الأسيتون أو الميثانول، وثم تعرض لimmunolabeling.

Introduction

بقع باير (PPS) هي المجاميع العيانية من بصيلات اللمفاوية المنظمة الحالية في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة للإنسان والفئران (الشكل 1) وتشكل المواقع الأساسية التي تم تهيئتها الاستجابات المناعية المخاطية ضد مستضدات الغذائية والبكتيريا المتعايشة، ومسببات الأمراض الميكروبية، واللقاحات عن طريق الفم 1-4. على عكس الأنسجة الأخرى اللمفاوية الطرفية مثل العقد الليمفاوية المساريقي، ذكر المكتب الصحفى تفتقر الأوعية اللمفاوية وارد. كما هي مدفوعة، مثل الاستجابات المناعية التكيفية في ذكر المكتب الصحفى ردا على مستضدات المستمدة من تجويف الأمعاء. ويتم إنجاز أخذ عينات من المستضدات لمعي من قبل ظهارة جريب المرتبطة (FAE)، الذي يتكون من كل من الخلايا المعوية ومستضد أخذ العينات المعروفة باسم الخلايا M. تحت FAE، في قبة شبه الظهارية (SED) المنطقة، وتقع شبكة من الخلايا الجذعية (DCS) تتداخل مع الضامة، والخلايا B، وCD4 + T الخلايا 5-9. في صميم كل follicl اللمفاوية PPه هي الخلايا الجذعية الجريبي (FDCS) وخلية الغنية المركزية B مركز جرثومي، ويحيط بها مناطق T بين الجريبات الخلية الغنية. أخذ العينات بواسطة المستضد النتائج ذكر المكتب الصحفى في تطوير خلية + B ايغا plasmablasts وCD4 + الخلايا المستجيب والذاكرة التي الصفيحة المخصوصة البذور المحيطة ومنح الحصانة لمجموعة واسعة من الغزاة المخاطية.

تشريح الأحداث المناعية المعقدة المرتبطة مستضد أخذ العينات، وتجهيز، وعرض في ذكر المكتب الصحفى هو مهمة شاقة، بالنظر إلى أن خلايا PP لا تشكل سوى نسبة ضئيلة من الخلايا اللمفاوية في مجموع مخاطية الأمعاء. للمساعدة في توصيف في المختبر من خلايا في هذه البيئة، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مجموع الماوس خلايا PP لتحليل تدفق cytometric والوظيفية، وكذلك بروتوكول لإعداد PP cryosections المناعي للفحص المجهري وimmunohistology. لدينا بروتوكول لعزل وتوصيف، والمناعية من مذكرات التفاهمه خلايا PP ليست رواية في حد ذاتها، كما يتضح من حقيقة أن هناك إشارات عديدة يعود تاريخها إلى أكثر من 25 عاما أن أذكر هذه التقنيات 5،6،9-11. بدلا من ذلك، لدينا بروتوكول يوفر مبسطة (والبصرية) للمحققين طريقة جمع ذكر المكتب الصحفى للمرة الأولى. ويتقن تقنيات بسهولة وصفنا وتسفر بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا مع> بقاء الخلية 90٪. بروتوكول cryosectioning ينتج المسلسل أقسام استنساخه للغاية مثاليا للتلوين المناعي والتصوير مبائر. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يكمل الأخريين إن الرب المقالات الأخيرة. الأولى، من قبل فوكودا والزملاء، يصف استخدام المقايسات ligated حلقة اللفائفية لتقييم امتصاص البكتيريا المسببة للأمراض من قبل خلايا M PP 12. الآخر، من خلال Geem والزملاء، ويصف العزلة وتوصيف البلدان النامية والضامة من الغشاء المخاطي المعوي الماوس، لكنه يستثني صراحة من ذكر المكتب الصحفى تحليل ال 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم إيواء الحيوانات تحت التقليدية وشروط محددة خالية من مسببات الأمراض وعولج في الامتثال الكامل لمركز رعاية الحيوان في ادسورث المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).

1. عن طريق الفم بالتزقيم

  1. (اختياري) سلالة تسمين الماوس في الاختيار مع مستضد أو الميكروبات ذات الاهتمام باستخدام مجموعة ال 22 x1.5 في. بصراحة نهاية إبرة التغذية (بوبر العلمية، نيو هايد بارك، نيويورك). يجب تسليم كميات لا يتجاوز 400 ميكرولتر في الماوس.

2. عزل خلايا PP لقياس التدفق الخلوي

  1. الموت ببطء الفئران خنقا 2 CO، وفقا لرعاية الحيوانات المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).
  2. تطهير البطن مع الايثانول 70٪ أو betadine قبل الجراحة. إجراء البطن القياسية التي تنطوي على واحد (1 سم) شق الصف باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط بداية حوالي 1.5 سم من قاعدة القفص الصدري. فضح فيitoneal تجويف وتحديد الأعور. قص الأمعاء الصغيرة الطرفية عند تقاطع اللفائفية-الأعور وإزالة بلطف الأمعاء بكاملها. والحرص على عدم hyperextend الأنسجة المعوية كما يتم إزالته من التجويف البريتوني.
  3. وضع الأمعاء الدقيقة على سرير من المناشف الورقية الرطبة أو Kimwipes. الرطب الأمعاء الدقيقة بلطف مع المياه المالحة لمنع الجفاف الأنسجة. ذكر المكتب الصحفى تحديد بصريا الفردية تقع على الجانب مضادة للالمساريقي من الأمعاء (الشكل 1). عادة، وهي واحدة من الفأرة من 5 إلى 10 ذكر المكتب الصحفى مرئية التي يتم توزيعها بالتساوي من العفج (القريبة) لالدقاق (البعيدة). في المتوسط، سوف تسفر عن فئران 4 23 ذكر المكتب الصحفى.
  4. باستخدام مقص جراحي منحني، ذكر المكتب الصحفى الفردية المكوس بلطف ووضعها في محلول ملح الباردة هانك المتوازن (HBSS). ملاحظة، يجب وضع المقص منحنى الجانب الأعلى فقط فوق PP ثم تطبق بلطف على الأنسجة. المكوس فقط PP (لا surroundiنانوغرام الأنسجة) ونقل إلى HBSS الباردة.
    ملاحظة: يجب أن يتم كل حضانات والخطوات الطرد المركزي من هذه النقطة إلى الأمام في القسم 2 في 4 درجات مئوية للحفاظ على بقاء الخلية.
  5. ذكر المكتب الصحفى نقل إلى 5 مل الطحال التفكك المتوسطة واحتضان لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز بقوة في 250 دورة في الدقيقة. وتعد فترة حضانة تؤثر سلبا على بقاء الخلية.
  6. لإنشاء تعليق خلية واحدة، ذكر المكتب الصحفى مكان على معقمة (تعقيمها) ميكرومتر النايلون 70 مصفاة الخلية شبكة وطحن بالقوة الأنسجة في شبكة باستخدام قاعدة من المكبس من المحاقن سم مكعب 1. بدلا من ذلك، ذكر المكتب الصحفى شطيرة بين اثنين بلوري العقيمة الشرائح المجهر والزجاج (تعقيمها في مظاريف) وتطحن بلطف الأنسجة مع الحركة ذهابا وإيابا. استخدام ماصة نقل معقمة لنقل التعليق الخلية في أنبوب فالكون 5 مل.
  7. إضافة إلى EDTA تركيز النهائي من 1 ملم إلى تعليق الخلية. احتضان على الروك ل5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. صب التعليق الخلية من خلال 70 ميكرون في الثانية مصفاة لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية الخلوية أو الحطام الأنسجة. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية أو 50.
  9. موضوع الخلايا لطيف الطرد المركزي (5 دقائق في 500 XG). صب الخلايا و resuspend طاف في تدفق العازلة، التي هي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين (FCS).
  10. لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء، تمييع الخلايا في الزرقاء التريبان 1:10 وتفتيش بصريا الخلايا باستخدام المجهر الخفيفة وعدادة الكريات أ. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام عداد الخلايا الكونتيسة (إينفيتروجن) أو أداة مماثلة لتعداد الخلايا تلقائيا الأرقام وقدرتها على البقاء.
    بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى، يجب أن هذا البروتوكول تسفر> 2.5 × 10 6 خلايا الكلية. وهذا يعادل 0،8-1،2 ~ × 10 6 خلايا في الماوس.

الأجسام المضادة للخلايا وصفها لقياس التدفق الخلوي

<رأ بداية = "11">
  • الاستغناء الخلايا (10 5 لكل بئر) في آبار من أسفل لوحة 96-الجولة أيضا.
  • موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.
  • إعادة تعليق الخلايا في كتلة عازلة ونادي احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. في حين أن هناك عددا من المخازن المؤقتة المتاحة تجاريا كتلة FC (مثل الفئران لمكافحة فأر CD16/CD32، BD العلوم البيولوجية)، ونحن ببساطة استخدام قضى المتوسطة من ورم هجين B خلية فأر (ATCC 2.4.G2) التي تفرز مفتش حيدة النسيلة 1 ضد الفئران Fcγ مستقبلات لهذه الخطوة.
  • موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG) على النحو الوارد أعلاه، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.
  • إضافة fluorophore، مترافق الأجسام المضادة مباشرة إلى تعليق خلية في التخفيف المطلوب، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع هزاز المستمر.
  • موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وصبطاف من قلب لوحة وبلطف.
  • غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من العازلة التدفق.
  • أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.
  • إعادة تعليق الخلايا 400 ميكرولتر العازلة التثبيت، والذي يتألف من 300 ميكرولتر من العازلة تدفق و 100 ميكرولتر من 1٪ في بارافورمالدهيد العازلة PHEM (أنابيب 60 ملم، 25 ملم HEPES، 10 ملم EGTA، 4 ملم MgCl 2 في الرقم الهيدروجيني 6).
  • الخلايا تخضع لتدفق الخلوي باستخدام FACSCalibur أو ما يعادلها. تحليل النتائج باستخدام برنامج برو النسخة المحمولة كويست 5.2.

    • 3. إعداد Cryosections PP

    1. في وقت مبكر من جمع الأنسجة، إضافة الأمثل قطع الحرارة (OCT) لمجمع قوالب مم 7x7x5 قاعدة من البلاستيك. أيضا بإعداد مجموعة من النيتروجين السائل (> 750 مل) في دلو ديوار أو الجليد.
    2. الموت ببطء الماوس وإجراء laparotamy، كما هو موضح أعلاه. إزالة الأمعاء ووضعت على مناشف ورقية مبللة.
    3. إلىذكر المكتب الصحفى لخفض عزل cyrosectioning، شرائح 0.5 سم عرضية من الأمعاء الدقيقة تحتوي على واحد ونسيج PP نقل إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. شطف بلطف تجويف هذه الشرائح مع PBS لإزالة الحطام البراز غير المرغوب فيها.
    4. وضع شرائح الأنسجة المعوية عموديا داخل قوالب قاعدة تحتوي أكتوبر تزج القوالب في النيتروجين السائل وتسمح لتجميد الأنسجة تماما (1-2 دقائق). وهذا اللون من أكتوبر من تغيير واضح إلى الأبيض عندما يتم تجميد كامل للأنسجة. . لتبريد أكثر تدرجا (على سبيل المثال للحد من تشقق OCT)، قالب تزج في حمام من نظير البنتان مع تبريد أبخرة النيتروجين السائل ملاحظة: ارتداء نظارات السلامة المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل.
    5. إزالة قوالب قاعدة المجمدة من النيتروجين السائل باستخدام ملقط والسماح للقالب لتدفئة في درجة حرارة الغرفة فترة طويلة بما يكفي (~ 10-15 ثانية) للسماح للحواف كتلة أكتوبر لتخفيف. ثم لإزالة كتلة المجمدة من أكتوبر منالقالب، القالب عكس واضغط بلطف على ظهره لإخراج الكتلة على قطعة نظيفة × 4 سم 4 من رقائق الألومنيوم. التفاف على الفور الأنسجة في احباط وضعها في حقيبة عينة المسمى المخزنة في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. بدلا من ذلك، نقل الأنسجة في الفريزر (<-20 درجة مئوية). استخدام الأنسجة في غضون أسبوع، وإلا سوف تصبح هشة لبنات مع التقدم في السن.

    Cryosectioning

    1. Cryosection الأنسجة باستخدام CM3050S ايكا cryomicrotome أو ما يعادلها. وينبغي ضبط درجة حرارة الغرفة على ناظم البرد -21 ° C. إلى
    2. نسعى جاهدين لالمقاطع التي هي 12-14 ميكرومتر في السمك.
    3. جمع المقاطع على SuperFrost فيشر زائد (أو ما يعادلها) الشرائح المجهر والزجاج، وفحص بصريا باستخدام معيار ضوء انخفاض القوة المجهر. إذا كان يتم جمعها مقاطع متعددة على شريحة، تأكد من أن تتجمع معا لتطبيقات تلطيخ المصب.
    4. متجر رانه الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صندوق الشرائح و، من الناحية المثالية، واستخدامها في غضون أيام قليلة.

    وصفها الأجسام المضادة من Cryosections ومتحد البؤر المجهر التحليل

    1. الشرائح تزج في الأسيتون (أو الميثانول) في جرة أو تلطيخ الأنسجة رفوف لمدة 2 دقيقة. قد يسبب الحضانة لفترات طويلة من الأنسجة لفصل الشريحة.
    2. نقل الشرائح إلى تلطيخ جرة جديدة وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-T (1X PBS مع 0.05٪ توين-20) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
    3. تطويق المقاطع مع ImmEdge القلم مسعور. وسوف يضمن هذا ستبقى محصورة الكواشف والأجسام المضادة لتلك المنطقة خلال حضانات.
    4. احتضان الشرائح في كتلة عازلة (2٪ مصل الماعز في PBS) لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة مرطب، محمية من الضوء.
    5. احتضان الشرائح العازلة مع كتلة FC (انظر أعلاه) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
    6. تراجع الشرائح في PBS-T ومنطقة جافة حول أقسام باستخدام ماصة أو الأنسجة Kimwipes أخرى.والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية.
    7. أقسام الأنسجة تراكب مع حل الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطب. عادة يتم تخفيف الأجسام المضادة الأولية في كتلة عازلة للتركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل. استخدام الأجسام المضادة الأولية مباشرة، وصفت أمر مرغوب فيه، لأنه لا يمكن الجمع بين ما يصل الى ثلاثة أجسام مضادة مباشرة في هذه الخطوة. الأجسام المضادة التي تحمل علامات مباشرة القضاء أيضا على الحاجة إلى خطوات إضافية حضانة الأجسام المضادة.
    8. غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني.
    9. إذا لزم الأمر، والشرائح احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة الرطوبة.
    10. غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني.
    11. احتضان الشرائح لمدة 4 دقائق في بارافورمالدهيد 1٪ في المخزن المؤقت PHEM، كما هو موضح أعلاه.
    12. شطف الشرائح مع PBS لمدة 1 دقيقة.
    13. منطقة جافة حول أقسام باستخدام Kimwipes أو غيرها من استيعابالأنف والحنجرة الأنسجة. والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية. باستخدام ماصة أو القطارة، ضع قطرة من بلطف إطالة المتوسطة الذهب تصاعد مباشرة على القسم. تطبيق ساترة الزجاج على المدى المتوسط ​​تصاعد مع الحرص على تجنب الفقاعات. استخدام ورق النشاف لامتصاص فائض أي وسيط في تصاعد مستمر.
    14. coverslips ختم على الشرائح المجهر مع طلاء الأظافر التجارية والسماح للهواء الجاف.
    15. عرض الشرائح مع SP5 TCS لايكا أو المجهر متحد البؤر ما يعادلها.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    تحليل تدفق cytometric من المعلقات monodisperse من الخلايا PP مجموع يكشف عن تمييز واضح بين استعدادات جيدة الخلية والفقراء. في الخلية الاستعدادات جيدة مع بقاء أكثر من 80٪، فإن الغالبية العظمى من الخلايا إظهار مبعثر إلى الأمام عالية (FSC)، وهو مؤشر على حجم الخلايا عالية، وانخفاض مبعثر الجانب (SSC)، وهو مؤشر على تحبب الخلايا منخفضة (الشكل 2A). في هذه التجربة، ونحن أيضا أعد عمدا "خلية إعداد الفقراء" من خلال احتضان خلايا PP الخطوات العزلة في درجة حرارة الغرفة (بدلا من على الجليد) و، في الخطوة الأخيرة، احتضان الخلايا مع برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ FCS (بدلا من PHEM المخزن المؤقت). في هذه الاستعدادات خلية الفقراء، والغالبية العظمى من الخلايا يحمل FSC المنخفضة والعالية وSSC خارج بوابة R1 المشار إليه (الشكل 2B). هذه الخلايا تشهد موت الخلايا المبرمج المحتمل و / أو النخر.

    الشكل 3 يوضح استخدام مزيج من ما يصل إلى أربعة ديfferent fluorophore، مترافق الاجسام المضادة للتمييز بين مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في خلية واحدة تعليق PP. وضع العلامات مع مجموعة من التمايز (CD) علامات CD19 وتكشف B220 B أن الخلايا تشكل ~ 60٪ من السكان بوابات الخلية PP (الشكل 3A). مجموعات فرعية محددة يمكن تعداد الخلايا T بسهولة عن طريق وضع العلامات مزدوجة مع الأجسام المضادة ضد CD3 CD4 و(الشكل 3B) أو CD3 وCD8 (الشكل 3C). CD4 + + CD8 الخلايا وتشكل T ~ ~ 23٪ و٪ 9 على التوالي من إجمالي الخلايا PP. البلدان النامية مجموعات فرعية المسمى CD11c + ويمكن أيضا (الشكل 3D) وCD103 + (لا تظهر) أن تعداد بواسطة هذه الطريقة. CD11c + تسهم في البلدان النامية حوالي 8٪ من إجمالي سكان بوابات، وهو ما يعادل تقريبا إلى 10،000 في البلدان النامية PP. هذا يوافق تماما مع عدد من البلدان النامية التي لاحظها 14 آخرين.

    بين سكان CD11c + ل+ B220. ويتم الحصول على نتائج مماثلة عند جمع خلايا PP من C57B / 6 الفئران (الشكل 3E).

    يمكن الاستعدادات "ضعيف" خلية يؤدي إلى نتائج مضللة إلى حد كبير، وذلك لأن الخلايا إلى حد كبير الميتة أو التي تحتضر تميل إلى ربط الأجسام المضادة غير محدد. كما هو مبين في الشكل (4)، فإن عدد سكان الخلايا التي صمة عار إيجابية لكلا من علامة الخلية B (B220) وعلامات الخلايا T (CD3، لوحة A؛ CD4، لوحة B) يمكن أن تختلف بأكثر من أضعاف-3 بين الخير و سوء إعداد الخلية. ويبين الشكل 4 تمثيل أكثر من + B220 + CD3 وانقر نقرا مزدوجا إيجابية الخلايا (لوحة A)، وكذلك B220 + B خلايا CD4 + الخلايا وT نقرا مزدوجا إيجابية الخلايا (لوحة B) في الخلية الاستعدادات الفقراء. كما ذكر أعلاه، فإن التفاوت في B النسبية وأعداد الخلايا T في حالة جيدة مقابل الفقراء من المحتمل بسبب غير محددة ملزمة الأجسام المضادة خلايا الموت.

    لدينا بروتوكول يدل أيضا على أن الماوس cryosections PP قابلة للتحليل النسيجية، وكذلك immunolabeling. الشكل 5 يقارن H & E تلطيخ من البارافين ذكر المكتب الصحفى الماوس (لوحات A، B) وأقسام المجمدة (لوحة C). في حين أن أقسام البارافين توفير المزيد من القرار على المستوى الخلوي عندما ملطخة بواسطة H & E، المناطق المضيئة والمظلمة من مراكز جرثومي PP هي أكثر سهولة في ترسيم أقسام cryosection (أرقام 5A-C). H & E الملون cryosections مفيدة لجنبا إلى جنب مقارنة مع cryosections immunolabeled. ويرد cryosection PP نموذجية ملطخة CD3 الأجسام المضادة ضد لتسمية الخلايا T، ومكافحة CD11c الأجسام المضادة لتسليط الضوء على البلدان النامية والأجسام المضادة المقاومة للB220 B لتسليط الضوء على الخلايا في الشكل 6.

    الشكل 1
    الشكل 1. الماوس باير patc[هس]. صورة من الامعاء الصغيرة الماوس رفعه حديثا مع ثلاثة ذكر المكتب الصحفى مرئية (الأسهم البيضاء). حزب التقدم والاشتراكية تظهر نفطة تشبه الهياكل (5 × 5 ملم) على الجانب مضادة للالمساريقي للالمصلية المعوية.

    الشكل 2
    الشكل 2. مجموع خلايا PP تحليلها من قبل التدفق الخلوي. تعرض A التعليق monodisperse من الخلايا PP مجموع التدفق الخلوي باستخدام FACSCallibur BD. (A) مثال على إعداد خلية جيدة. الغالبية العظمى من الخلايا إظهار مبعثر إلى الأمام عالية (FSC)، وهو مؤشر على حجم الخلايا عالية، وانخفاض مبعثر الجانب (SSC)، وهو مؤشر على تحبب الخلايا منخفضة. هذه الخلايا هي في محاصر R1. وتعتبر الخلايا مع FSC منخفضة وعالية SSC، التي تقع خارج بوابة R1، الخلايا الميتة أو التي تحتضر. (B) مثال على إعداد خلية الفقراء، والتي غالبية الخلايا خارج البوابةR1 بسبب FSC منخفضة وعالية SSC.

    الشكل 3
    الشكل 3. ممثل تحليل تدفق الخلايا الليمفاوية cytometric PP. تعليق Monodisperse من الخلايا المحتضنة مع مجموعه PP-fluorophore مترافق الأجسام المضادة الأولية وثم تعرض لالتدفق الخلوي. (A) CD19 وB220 وضع العلامات من الخلايا B PP. (BC) انقر نقرا مزدوجا وضع العلامات للسكان الخلية مجموع مع CD3 CD4 و(B) أو CD8 (C) تعداد مجموعات فرعية محددة الخلايا T (D) انقر نقرا مزدوجا وضع العلامات السكان الكلي لخلايا B220 (علامة الخلية B) وCD11c (DC علامة). (E) مقارنة B220، CD3 ، CD4، وتلطيخ CD11c على خلايا PP من BALB / ج الفئران وC57B / 6.

    الشكل 4
    الشكل 4. كانت ملطخة مضللة بيانات التدفق الخلوي نتيجة لضعف الاستعدادات الخلية PP. جيد (لوحات اليسار) والفقراء (لوحات اليمين) مع الاستعدادات الخلية PP (A) وأجسام مضادة لB220 CD3 لخلية B تفرق السكان وT أو الأجسام المضادة (B) لB220 CD4 والخلايا B للتمييز من مجموعة فرعية من الخلايا T. هناك عدد قليل جدا من الخلايا عموما من الخلايا التي وصمة عار إيجابية لCD4 CD3 أو B220 و، كما هو موضح في لوحات اليسار. في المقابل، في الأعمال التحضيرية خلية الفقراء نقرا مزدوجا إيجابية الخلايا تشكل ما يقرب من 20٪ من مجموع الخلايا. انظر النص لمزيد من التفاصيل حول ما يشكل "الفقراء" إعداد الخلية.

    الشكل 5
    الشكل 5. H & E ممثل الملطخة أقسام PP. البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام (A، B) أو cryosections (C) من PP اللفائفيةكانت ملطخة s مع H & E وتصور من قبل المجهر الضوئي. لاحظ أنه يتم ترسيم بسهولة المناطق المضيئة والمظلمة من بصيلات اللمفاوية في cryosections، بالمقارنة مع أقسام البارافين. الاختصارات: V، الزغابي؛ FAE، جريب المرتبطة ظهارة؛ SED ودون الظهارية قبة؛ LF، جريب اللمفاوية.

    الشكل 6
    الشكل 6. وضع العلامات مناعي من cryosections PP الفئران. قطع طازجة أقسام الأنسجة واحدة على فأرة الحاسوب PP كانت المجفف في الهواء، الأسيتون الثابتة، وملطخة (A) FITC، مترافق المضادة للCD3 الأجسام المضادة لتسمية الخلايا T في المناطق المشتركة بين مسامي و الصفيحة المخصوصة، (B) PE-مترافق المضادة للCD11c الأجسام المضادة لتسليط الضوء على البلدان النامية في SED، و (C) APC-B220 مترافق المضادة للأجسام مضادة لخلايا B تسليط الضوء على (D) A س مركب.و الصور في لوحات AC تم إنشاؤها باستخدام برنامج فيجي. شريط النطاق هو ~ 100 ميكرون.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    في هذه المقالة، قدمنا ​​البروتوكولات موازية لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections للالمناعية. كلتا الطريقتين هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة، وفرت قياس التدفق الخلوي وناظم البرد المتاحة. وينبغي للمحققين مرة الأولى تجدر الإشارة إلى أنه عندما بالمقارنة مع الطحال، والمحاصيل خلية من مجموع ذكر المكتب الصحفى ضئيلة نسبيا. ومع ذلك، فإن البروتوكول يحدد عموما نحن الغلة بين 0،8-1،2 × 10 6 خلايا PP مجموع من ماوس واحدة. النطاق حتى من الممكن، على الرغم من أننا لا نفعل عادة تجمع أكثر من 20-25 ذكر المكتب الصحفى، لأنه، في تجربتنا، وتجميع ويحدث غلة الخلية (وجدوى) تراجع إلى حد كبير. من ناحية أخرى، نحن لا نوصي باستخدام أقل من 15 ذكر المكتب الصحفى لهذا البروتوكول، وكتلة حرجة من الضروري القيام بنجاح الخلايا من خلال إجراء العزل بأكمله. إذا القصوى بقاء الخلية هو أولوية بالنسبة الوظيفية المصبالمقايسات، نوصي بأن تخضع عينة صغيرة من خلايا معزولة لتلطيخ يوديد propidium للسماح النابضة أكثر دقة تجمع قابلة للحياة من الخلايا من مجموع السكان الخلية PP. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن لدينا طريقة قابلة للفرز الخلايا التطبيقات إذا هو المطلوب مجموعة فرعية معينة من الخلايا لنقل بالتبني أو تحليل في المختبر، على سبيل المثال.

    جمع ذكر المكتب الصحفى للcryosectioning واضح ومباشر نسبيا، على الرغم من أن باجتزاء الفعلي للأنسجة PP يمكن أن يكون تحديا. لا بد، على سبيل المثال، أن الأنسجة PP موجهة بشكل صحيح في قوالب (أي عمودي على قاعدة من القالب) لضمان الحصول على ما أقسام صحيح عرضية. نقترح تجميد الأنسجة الإضافية PP وإخضاع ثم cryosections إلى مثبتات مثل الأسيتون عجل أو الميثانول تفاعل الأجسام المضادة للحفاظ على ("استضداد")، على الرغم من عجل مثبتات نتيجة إلى انخفاض في العام resol الخلوية وشبه الخلويةution. إذا الحفاظ على استضداد ليست مصدر قلق خاص، ثم نوصي استخدام مثبتات عبر ربط مثل بارافورمالدهيد (PFA)، والتي تؤدي إلى الحفاظ بشكل أفضل على الهياكل الخلوية وشبه الخلوية. في الواقع، يمكن استخدام PFA لإصلاح الأنسجة قبل cryosectioning. ببساطة تزج ذكر المكتب الصحفى حديثا رفعه في كميات وفيرة من PFA 4٪ لساعة 2>، وغسل الأنسجة مع PBS لإزالة الزائدة مثبت، تتوازن في الأنسجة السكروز (15٪) إذا كان المطلوب، وتضمين ثم في أكتوبر، كما هو موضح أعلاه. يمكن أن تكون الأنسجة ثم cryosectioned، ولكن يجب أن يكون قد تم حظره مع حل جليكاين (0.1 M في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة) لإرواء المتبقية PFA رد الفعل المناعية قبل.

    وأخيرا، في حين وصفناها بروتوكولات لوضع العلامات مناعي من cryosections PP، هذه المقاطع نفسها قابلة للالمناعية (IHC) باستخدام المتاحة تجاريا مجموعات IHC (مثل مختبرات المتجهات، بورلنجام، CA). لIHC، فمن الضروري أن تتضمن حظر أو البيروكسيديز quencهينج خطوة في البروتوكول، والإنزيمية الذاتية تنتشر بشدة في الغشاء المخاطي المعوي. وقد لاحظ آخرون أن لIHC، نضح القلب من الفئران مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني يحسن الحفاظ الأنسجة.

    وباختصار، لقد قدمنا ​​البروتوكولات موازية ومكملة للتحليل الكمي والوظيفي للخلايا الفئران PP، بما في ذلك البلدان النامية والخلايا الليمفاوية. إعداد تعليق خلية واحدة يمكن الكمية والفنية في تحليل المختبر من أنواع الخلايا الرئيسية في حزب التقدم والاشتراكية، في حين immunolabeling من cryosections يوفر معلومات بشأن توطين أنواع معينة من الخلايا، وكذلك خلية خلية التفاعلات الموجودة في الموقع. القيد الرئيسي لهذه النهج على حد سواء هو أنه لا يمثل "الزمن الحقيقي" تصور التفاعلات الخلية خلايا PP. في الوقت الحالي على الأقل، وقد أثبتت ذكر المكتب الصحفى منيع في التصوير intravital، وهي تقنية أحدثت ثورة فهم dynami اللمفاوياتCS في الغدد الليمفاوية الطرفية. حتى يتم التغلب على الحواجز التقنية الحد من التصوير intravital ذكر المكتب الصحفى، والبروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections PP لالمناعية سيظل الوسيلة الأساسية لتحقيق وفهم وظائف محددة المناعية الفرعية من السكان من الخلايا في ذكر المكتب الصحفى، والمواقع الأساسية استقرائي من القناة الهضمية المرتبطة الأنسجة اللمفاوية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgments

    نشكر رينجي الأغاني (ادسورث قياس التدفق الخلوي مركز كور) للمساعدة في تحليل الخلايا وهيلين جونسون (ادسورث مركز التشريح المرضي الأساسية الحيوان) لإعداد أقسام البارافين. نشكر الدكتور ريتشارد كول (ادسورث المجهر الضوئي مركز كور) للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر وجمع الصور. نود أن نعترف اندي بنتلي (ادسورث مركز الصور وتوضيحات) للحصول على المساعدة مع الرسوم المتحركة.

    ويدعم MDJ من قبل مؤسسة الحياة بحوث العلوم، معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) زمالة. ويدعم SA من زمالة مركز البحوث وادز ورث، وشركة صحة ما بعد الدكتوراه جماعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HD061916 وGM082978.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
    2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
    3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
    4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
    5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
    6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
    7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
    8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
    9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
    10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
    11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
    12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
    13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
    14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

    Tags

    العدوى، العدد 73، الأمراض المعدية، علم المناعة، علم الأحياء الدقيقة، الطب، الخليوي علم الأحياء، جراحة، الالتهابات البكتيرية وMycoses، وأمراض الجهاز المناعي، أمراض الجهاز الهضمي، والتصحيح باير، الأمعاء، المخاطية، الأنسجة اللمفاوية، شجيري الخلايا اللمفاوية التدفق الخلوي،، cryosectioning ، عن طريق الفم بالتزقيم، المناعية، والعزلة، والثقافة الخلية، نموذج حيواني
    عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis,… More

    De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter