Summary
理解在派伊尔氏淋巴集结的特定的细胞亚群（PPS），初级感应网站肠相关的淋巴组织的免疫功能有越来越大的兴趣。在这里，我们列出了流式细胞仪分析和PP冰冻切片免疫准备的PP单细胞准备的并行协议。
Abstract
Peyer氏斑（PPS）的肠道相关淋巴组织（GALT）是不可或缺的组成部分，并在肠道的免疫监视和平衡中发挥核心作用。连续采样在肠腔内的颗粒性抗原和微生物PP M细胞在卵泡相关上皮（FAE），运到底层网络的树突状细胞（DC）的，巨噬细胞，和淋巴细胞。在本文中，我们描述了小鼠的PP是（i）解离成单细胞悬浮液，并进行流式细胞仪，及（ii）用于cryosectioning和免疫制备的协议。流式细胞仪，PPS的机械分离，然后通过70微米膜过滤产生单细胞悬液的上皮细胞和大的杂物。用20-25的PP（从四只小鼠）开始，此快速和可重复性的方法产生一个人口> 2.5×10 6细胞> 90％的细胞存活率。对于cryosectioning，新鲜LY孤立的PP都沉浸在最佳切削温度（OCT）中，在液氮快速冷冻，然后切片用冷冻切片机。组织切片（5-12微米），空气干燥，用丙酮或甲醇固定，然后进行免疫标记。
Introduction
Peyer氏修补程序（PPS）是宏观集合体有组织淋巴滤泡整个的小小肠人类和小鼠（ 图1）中存在的和构成的主站点在粘膜免疫应答被发起针对膳食抗原共生细菌，微生物病原体，口服疫苗1-4。与其他外周淋巴组织，如肠系膜淋巴结，PPS缺乏传入的淋巴管。因此，适应性免疫反应的PP中的驱动响应于来自肠腔抗原。管腔抗原的采样来完成的由卵泡关联的上皮（FAE），其中包括被称为M细胞肠细胞和抗原采样单元。上皮子圆顶（SED）的区域中，位于下方的FAE，间杂与巨噬细胞，B细胞和CD4 + T细胞5-9的树突状细胞（DC）的网络。在每个PP淋巴follicl的核心e是滤泡树突状细胞（FDCS）和B细胞丰富的中央生发中心，两侧的T细胞丰富的滤泡区。的PP的查询结果中的发展型IgA + B细胞浆母和CD4 +效应和记忆细胞抗原采样种子周围的固有层，并提供很宽的范围内的免疫力粘膜入侵者。
解剖复杂的免疫抗原采样，处理和呈现在PPS相关的事件，是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞只占一小部分的总淋巴样细胞在肠黏膜。为了有助于在体外表征细胞在这样的环境中，我们提供了一个协议，用于制备总鼠标PP细胞流式细胞仪和功能分析，以及用于制备聚丙烯的冷冻切片的免疫荧光显微镜和免疫组化检测的协议。我们的分离，鉴定和免疫组织化学的谅解备忘录的协议ËPP细胞本身并不新颖，所证明的事实，即有超过25年的历史，多次提到，引用这些技术5,6,9-11。相反，我们的协议提供了一个简化的（视觉）的方法收集PPS第一次调查。我们所描述的技术很容易掌握，容易产生大量的细胞与细胞活力> 90％。 cryosectioning协议产生高度重复的连续切片进行免疫荧光染色和激光共聚焦成像非常适合。此外，我们的协议补充其他两个最近的朱庇特的文章。第一，由福田和他的同事，描述了使用结扎回肠环路检测，以评估的致病细菌的吸收，由PP M细胞12。其他的，的GEEM和他的同事，介绍了小鼠肠黏膜的区议会和巨噬细胞的分离和鉴定，但明确排除了PPS从他们的分析13。
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Protocol
根据传统，无特定病原体动物被安置和处理沃兹沃斯中心的机构动物管理和使用委员会（IACUC）的指导方针完全符合。
1。口灌胃
- （可选）灌胃小鼠品系的选择与抗原或微生物使用X1.5-22 G的兴趣。钝端喂食针（，波普尔科学，海德公园，NY）。交货量不应超过400微升每鼠标。
2。 PP细胞用于流式细胞仪分离
- 安乐死小鼠CO 2窒息，根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针。
- 用70％乙醇或优碘，手术前清洗腹部。执行标准剖腹手术，涉及到一个单一的（1厘米）切口手术级的剪刀沿中线开始从基地约1.5厘米的肋骨。公开每itoneal腔，并确定盲肠。剪断终端小肠回肠盲肠交界处，轻轻取出肠道内的全部。 ，请注意不要超伸被删除，因为它是从腹膜腔肠组织。
- 在床上的湿纸巾或Kimwipes奠定小肠。湿用生理盐水轻轻的小肠，以防止组织脱水。可视地识别个别位于肠道反肠系膜侧（ 图1）的PP。通常情况下，一个单一的鼠标具有均匀分布从十二指肠（近端）回肠（远端）的5至10可见的PP。平均而言，四只老鼠将产生23的PP。
- 使用弯曲的手术剪刀，轻轻消费个别PP和将它们放置在冷的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）。 笔记 ，剪刀应该被放置曲线侧的正上方的PP，然后轻轻地施加到组织。海关关长只的PP（surroundi的异常组织），转移到冷的HBSS。
注：所有的孵化和离心步骤，这一点在第2节，应在4°C保存细胞活力。 - 转移的PP5毫升健脾解离中孵育15-20分钟，在37°C，同时大力摇晃在250转。培养时间的延长细胞活力将产生负面影响。
- 要产生单细胞悬浮液，无菌（蒸压）为70μm的尼龙网细胞过滤网上的地方的PP和强行研磨组织成网状，使用从1毫升注射器的柱塞的基。另外，PPS磨砂无菌玻璃显微镜幻灯片（高压灭菌信封），轻轻地磨一个来回运动组织之间的夹层。使用无菌移液管转移到一个5毫升的Falcon管中的细胞悬浮液。
- 加入EDTA至终浓度为1mM的细胞悬浮液。孵育摇杆在室温下5分钟。
- 倒出细胞悬液通过第二个70微米细胞过滤器，以消除任何剩余的细胞聚集或组织碎片。收集细胞中有15或50毫升锥形管。
- 主题细胞温和离心（在500×g离心5分钟）。在流的缓冲液，磷酸盐缓冲盐水（PBS）含有1％胎牛血清（FCS）的滗析上清液和重悬细胞。
- 为了确定细胞数和存活率，稀释1:10到台盼蓝染色的细胞，并目视检查用光学显微镜和血细胞计数仪的细胞。可替换地，一个的伯爵夫人细胞计数器（Invitrogen公司），或类似的仪器，可以使用自动枚举细胞数和生存能力。
20-25 PPS开始，这个协议应该产生2.5×10 6个细胞总数。这相当于〜0.8-1.2×10 6细胞每只小鼠。
抗体标记的细胞用于流式细胞仪
<OL开始=“11”>3。 PP冰冻切片的制备
- 在推进组织收集，最佳切削温度（OCT）化合物，7x7x5毫米的塑料底座模具。还要准备一个游泳池（750毫升）的液态氮杜瓦瓶或冰桶中。
- 安乐死鼠标和执行laparotamy，如上所述。删除的小肠和地方上湿纸巾。
- 对隔离为cyrosectioning的PP，横向切0.5厘米段的小肠内含有一个单一的PP和转移组织培养皿中包含PBS。这些段与PBS轻轻冲洗管腔，以消除不必要的粪便杂物。
- 将肠组织分部内垂直基地模具OCT。浸没在液氮中的模具，并允许组织完全冻结（1-2分钟）。在OCT会改变颜色，从透明至白色，当组织被完全冻结。对于一个逐渐冷却（ 例如 ，减少开裂的OCT），浸泡在用液氮蒸气浴冷却的异戊烷的模具。 注意：穿戴合适的工作时，用液态氮的安全护目镜。
- 从液氮使用钳子删除已冻结的基模具，并允许模具预热只是足够长，在室温下（约10-15秒），以允许在OCT块的边缘软化。然后删除冻结块OCT倒置的模具的模具，并在后面轻轻按下，退出块到一个干净的4×4 cm长的铝箔。立即在箔片和地点在液氮或干冰上存储的标记的试样袋包裹组织。或者，转移组织中的冷冻器（<-20℃）。使用组织在一个星期内，否则，块随着年龄的增长会变脆。
Cryosectioning
- 冰冻切片的组织使用一个徕卡CM3050S的冷冻切片机或同等学历。应设置在低温恒温器的腔室的温度为-21℃。
- 争取是12-14微米厚的部分。
- 费舍尔的Superfrost Plus（或同等学历）显微镜玻片上收集部分和视觉使用的是标准的低功耗光学显微镜检查。如果有多个部分正在收集有关的幻灯片，确保他们聚集在一起下游染色应用。
- 商店吨他滑动的滑动框，并在室温下在理想的情况下，使用它们在几天之内。
冰冻切片抗体标记和共聚焦显微镜分析
- 浸入丙酮（或甲醇）的组织染色缸或机架2分钟的幻灯片。长时间的潜伏期，可能会导致组织中分离的幻灯片。
- 转移到新的染色缸的幻灯片，并用PBS-T（1X用0.05％Tween-20的PBS）洗3次，每次3分钟。
- 与的ImmEdge疏水笔包围的部分。这将确保试剂和抗体将保持期间只限于该区域孵育。
- 在一个加湿室中在37℃下30分钟，避光孵育在块缓冲液（2％山羊血清的PBS）的幻灯片。
- 孵育10分钟的FC块缓冲区（见上文）的幻灯片，在37°C。
- 浸在PBS-T和干燥的部分使用Kimwipes或其他吸水组织周围地区的幻灯片。小心不要接触到实际的组织切片。
- 叠加组织切片与初级抗体溶液并孵育30分钟，在37℃下的潮湿室中。初级抗体通常是在块缓冲液稀释至终浓度为20微克/毫升。直接标记的第一抗体的使用是可取的，直接在此步骤中，因为多达三个抗体可以结合。直接标记的抗体的同时也消除了需要额外的抗体孵育步骤。
- 浸泡在PBS中洗涤3次（每次5分钟）的滑动。
- 如果必要，孵育与有关的二次抗体，在37℃下30分钟，在湿气室内滑动。
- 浸泡在PBS中洗涤3次（每次5分钟）的滑动。
- 孵育4分钟，在1％多聚甲醛在PHEM缓冲液中，如上文所述的幻灯片。
- 冲洗1分钟，用PBS滑动。
- 干周围地区的部分使用Kimwipes或其他吸收耳鼻喉科组织。小心不要接触到实际的组织切片。使用移液管或滴管轻轻将延长黄金直接安装介质上的部分下降。应用盖玻片上的安装介质照顾，以避免气泡。用吸水纸，以吸收任何多余的安装介质。
- 密封盖玻片显微镜载玻片与商业的指甲油，并在空气中晾干。
- 查看幻灯片用Leica TCS SP5或有同等作用的共聚焦显微镜。
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Representative Results
单分散悬浮液的总PP细胞的流式细胞仪分析揭示了一个明确的区分好的和坏的细胞制剂。在良好的细胞制剂中，有超过80％的可行性，绝大多数的细胞表现出高的前向散射（FSC），细胞体积高的指标，以及低侧散射（SSC），低的细胞粒度（ 图2A）的指标。在这个实验中，我们还特意准备了一个“细胞制剂差”孵育PP细胞在室温下（而不是在冰上）在分离步骤，并在最后一步，用PBS加1％FCS的培养细胞（而不是PHEM缓冲区）。在这些贫困的细胞制剂，大部分细胞具有低FSC和SSC高和指定的外门R1（ 图2B）。这些细胞有可能发生细胞凋亡和/或坏死。
图3演示了如何使用四二的鸡尾酒fferent荧光团共轭的单克隆抗体来区分各种细胞类型的PP单细胞悬浮液。标记分化群（CD）标志物CD19和B220表明，B细胞构成的门控PP细胞人口的60％（ 图3A）。特异性T细胞亚群，可以容易地列举出与抗CD3和CD4（ 图3B）或CD3和CD8（ 图3C）的双标记。 CD4 +和CD8 + T细胞构成〜23％〜9％，分别的总的PP细胞。区议会子集标记的CD11c +细胞 （ 图3D）和CD103 +（未示出）也可以通过该方法来枚举。表面CD11c + DCS门控的总人口，这是大致相当于10000议会每PP的8％左右。这正好与同意别人14观察到的DC的数量。
在人口中的CD11c + +双阳性。当PP细胞收集从C57B / 6小鼠（ 图3E），得到类似的结果。
“差”的细胞制剂可能会导致很大的误导性的结果，这主要是因为死亡或濒临死亡的细胞往往非特异性结合的抗体。正如在图4中所示，可以通过不同的细胞染色阳性的B细胞标记物（B220）和T细胞标记（CD3，面板A; CD4 +，B组）的人口超过3倍之间的一个良好的和坏细胞制剂， 图4示出过表示B220 +和CD3 +双阳性细胞（图A），以及B220 + B细胞和CD4 + T细胞在细胞制剂差的双阳性细胞（图B）。正如上面提到的，相对B和T细胞数的差距在良好的对贫可能是由于死亡的细胞的非特异性结合的抗体。
我们的协议还表明，，适合鼠标PP冰冻切片病理分析，以及免疫标记。 图5比较了H＆E染色的鼠标PPS石蜡（板A，B）和冰冻切片（C 组）。 ，虽然石蜡切片在细胞水平上提供了更高的分辨率，H＆E染色时，光与暗的区域更容易划分的PP生发中心在冰冻切片章节（ 图5A-C）。 H＆E染色冰冻切片侧端比较与immunolabeled冰冻切片有用的。在图6中示出一个典型的PP冰冻切片染色，用抗-CD3抗体的T细胞，抗CD11c抗体标记突出DCs和抗B220抗体以突出显示B细胞。
图1。鼠标Peyer氏PATC住户开支统计调查。图像新鲜切除的小鼠小肠有三个明显的PPS（白色箭头）。的PP作为泡状结构（5×5毫米）上的抗肠浆膜肠系膜侧出现。
图2。总的PP细胞用流式细胞仪分析。单分散悬浮液的总PP细胞受到流式细胞仪检测使用BD FACSCallibur的。（A）良好的细胞制剂的例子。绝大多数的细胞表现出较高的正向散射（FSC），细胞体积高的指标，和低侧散射（SSC），低格粒度指标。这些细胞在R1盒装。 FSC和SSC高，位于以外的R1大门，被认为是死的细胞或死亡的细胞。（B）一个可怜的细胞准备，其中的大多数细胞是大门外的例子R1由于低FSC和SSC高。
图3。代表性的流式细胞仪分析的PP淋巴细胞的单分散悬浮液的总PP细胞与荧光团共轭的第一抗体孵育，然后进行流式细胞术（A）的 CD19和B220标签的PP B细胞。（BC）的双标签的总细胞群CD3和CD4（B）或CD8（C）枚举（D）双标记的细胞总人口为B220（B细胞标记物）和CD11c（DC标记）（E）比较B220，CD3特异性T细胞亚群。 ，CD4 +，从BALB / c和C57B / 6小鼠的PP细胞和CD11c染色。
图4。流式细胞仪检测数据，误导性差的PP细胞制剂的结果。好评（左图）和差（右图）PP细胞制剂（A）抗体的B220和CD3区分B和T细胞群或（B）抗体的染色B220和CD4 T细胞的一个子集来区分B细胞。通常有极少数细胞B220和CD3或CD4染色阳性的细胞，在左侧面板所示。相反，在恶劣的细胞制剂双阳性细胞占细胞总数的近20％。关于什么构成一个“穷”细胞制备的详细信息，请参阅文本。
图5。代表H＆E-染色PP部分。石蜡包埋切片（A，B）或（C）的冰冻切片回肠PPS分别与H＆E染色，光镜观察。的淋巴滤泡，光明与黑暗的区域很容易被划分在冰冻切片，石蜡切片。 ：V长柔毛; FAE，滤泡相关上皮细胞; SED，上皮子球，LF，淋巴滤泡。
图6。小鼠PP冷冻切片的免疫荧光标记。新鲜切割组织内的一个单一的鼠标PP空气干燥，丙酮固定，和与（A）FITC标记的抗-CD3抗体的标记的T细胞间卵泡区域中，和染色固有层（B）PE标记的抗CD11c抗体突出的SED区议会和（C）APC标记的抗B220抗体突出的B细胞。（D）的复合Øf图像面板中的交流产生的斐济软件。比例尺为100微米。
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Discussion
在这篇文章中，我们提供了并行协议的准备PP准备流式细胞仪和功能分析和冰冻切片免疫组化染色的单细胞。这两种方法都高度重复性和容易获得，流式细胞仪和低温恒温器。对于第一次调查应该指出，当脾，总的电池产量PPS是相对贫乏。然而，该协议，概述一般为0.8〜1.2×10共6个 PP细胞从一个单一的鼠标之间的收益率。规模化是可能的，但我们通常不超过20-25 PPS池，因为，在我们的经验中，发生聚集和细胞产率和可行性下降大大。另一方面，我们不建议使用此协议的不到15 PPS，作为一个重要的质量是在整个分离过程中，要成功地进行了细胞。如果最大的细胞活力下游功能的优先级分析，我们建议一个小样本分离出的细胞受到碘化丙啶染色，以便更准确的选通可行的PP细胞总人口的细胞池。最后，应该指出的是，我们的方法是经得起细胞分拣所需的过继转移或在体外分析，例如如果一个特定的细胞子集的应用程序。
集合PPS cryosectioning是相对简单的，虽然实际的PP切片的组织可以是具有挑战性的。这是必要的，例如，PP组织是正确的方向（即垂直于基底的模具）在模具中，以确保真正的横截面得到。我们建议卡扣冻结PP组织，然后沉淀固定剂，如丙酮或甲醇，保持抗体的反应性（“抗原性”）的冷冻切片，沉淀固定剂的结果，即使在减少整体的细胞和亚细胞的甲阶酚醛树脂ution。如果保留抗原性是不是特别的关注，那么我们建议您使用交联固色剂如多聚甲醛（PFA），从而更好地保护细胞和亚细胞结构。事实上，PFA可以用于，修复组织之前cryosectioning。丰富量的4％PFA中简单新鲜切除的PP的浸入，> 2小时，用PBS洗组织，以除去过量的固定液，平衡组织中蔗糖（15％），如果需要的话，然后嵌入在OCT中，如上所述。然后，组织可以是cryosectioned，但必须被阻止剩余的反应性PFA用甘氨酸溶液（0.1M，在PBS中，15分钟），以便淬灭之前，免疫染色。
最后，虽然我们已经描述了PP冰冻切片免疫荧光标记的协议，这些相同的部分可以用市售的免疫组化试剂盒（ 如向量实验室，旧金山，CA）免疫组织化学（IHC）。对于免疫组化，它是必不可少的包括过氧化物酶阻塞或quenc的兴步在协议中，内源性过氧化物酶在肠道黏膜是非常普遍的。也有人指出，IHC，提高与在PBS中的4％多聚甲醛的小鼠心脏灌注组织保存。
总之，我们提供的数量和功能分析的小鼠的PP细胞中，包括淋巴细胞和区议会的并行和互补协议。在PPS的主要类型的细胞在体外的分析，实现定量和功能的单细胞悬液的制备冰冻切片免疫标记提供有关本地化的特定类型的细胞，以及细胞间的相互作用中存在的原位 。这两种方法的主要限制是，无论是代表“实时”的可视化的PP细胞 - 细胞相互作用。至少在目前，PPS已经被证明不活体成像，这种技术具有革命性的淋巴细胞来动态的了解cs在周围淋巴结。直到克服技术壁垒，限制活体成像的PPS，协议流式细胞仪和功能分析和PP冰冻切片免疫准备的PP单细胞准备将保持在这篇文章中概述的主要手段调查和了解免疫功能的特定子的细胞群体在PPS，肠道相关淋巴组织的初级感应网站。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢狄仁杰歌（Wadsworth中心流式细胞仪核心）协助细胞分析和海伦·约翰逊（Wadsworth中心动物病理组织核心）的石蜡切片的制备。我们感谢理查德·A·科尔博士（Wadsworth中心光学显微镜核心），激光共聚焦显微镜和图像采集的援助。我们要感谢安迪·本特利（沃兹沃斯中心的照片和插图）与动画的援助。
MDJ支持生命科学研究基金会，霍华德·休斯医学研究所（HHMI）的奖学金。 SA的支持，一个沃兹沃斯中心健康研究公司壁间的博士后研究。这项工作是支持的，部分由美国国立卫生研究院资助HD061916和GM082978。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
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References
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