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Immunology and Infection

अलग और immunostaining लिम्फोसाइटों और murine Peyer पैच से वृक्ष के समान कोशिकाओं

Published: March 17, 2013 doi: 10.3791/50167
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Infectious Diseases, New York State Department of Health

Summary

Peyer पैच में कोशिकाओं के विशिष्ट subpopulations (पी पी एस), आंत से जुड़े lymphoid ऊतकों के प्राथमिक आगमनात्मक साइटों के प्रतिरक्षाविज्ञानी कार्यों को समझने में एक बढ़ती रुचि है. यहाँ हम पीपी प्रवाह cytometric विश्लेषण और immunostaining के लिए पीपी cryosections के लिए एकल कक्ष की तैयारी की तैयारी के लिए समानांतर प्रोटोकॉल रूपरेखा.

Abstract

Peyer पैच (पी पी एस) आंत से जुड़े lymphoid ऊतकों के अभिन्न घटकों (Galt) और आंत्र immunosurveillance और homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं. आंतों लुमेन में पार्टिकुलेट प्रतिजनों और रोगाणुओं कूप से जुड़े उपकला (FAE) में लगातार पीपी एम कोशिकाओं द्वारा जांचा और वृक्ष के समान कोशिकाओं के एक अंतर्निहित नेटवर्क (DCs), मैक्रोफेज, और लिम्फोसाइटों पहुँचाया. इस अनुच्छेद में, हम प्रोटोकॉल जिसमें murine पी पी एस (i) एकल कक्ष निलंबन dissociated में और प्रवाह cytometry के अधीन है और (ii) cryosectioning और immunostaining के लिए तैयार का वर्णन. प्रवाह cytometry के लिए, पी पी एस यंत्रवत् dissociated और फिर 70 सुक्ष्ममापी झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करने के लिए एक सेल उपकला कोशिकाओं और बड़े मलबे के निलंबन मुक्त उत्पन्न कर रहे हैं. 20-25 पी पी एस (चार चूहों से) के साथ शुरू, इस त्वरित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि पैदावार 2.5> आबादी x 10> 90% सेल व्यवहार्यता के साथ 6 कोशिकाओं. Cryosectioning ताजा,ly पृथक पी पी एस इष्टतम काटना तापमान मध्यम (अक्टूबर), तस्वीर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है, और फिर sectioned एक cryomicrotome का उपयोग में डूब रहे हैं. ऊतक वर्गों (5-12 सुक्ष्ममापी) हवा सूखे, एसीटोन या मेथनॉल के साथ तय हो गई है, और तो immunolabeling के अधीन करने के लिए.

Introduction

Peyer पैच (पी पी एस) संगठित lymphoid मनुष्यों और चूहों (1 चित्रा) की छोटी आंत भर में मौजूद के रोम के macroscopic समुच्चय हैं और प्राथमिक जो साइटों पर mucosal प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आहार एंटीजन, खानेवाला बैक्टीरिया, माइक्रोबियल रोगज़नक़ों, और मौखिक टीके के खिलाफ शुरू कर रहे हैं गठन 1-4. Mesenteric लिम्फ नोड्स के रूप में अन्य परिधीय lymphoid ऊतकों के विपरीत, पी पी एस अभिवाही lymphatics की कमी है. जैसे, पी पी एस में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आंतों लुमेन से प्राप्त प्रतिजनों के जवाब में संचालित कर रहे हैं. luminal प्रतिजनों के नमूने कूप से जुड़े (FAE) उपकला, जो दोनों enterocytes और प्रतिजन कोशिकाओं के नमूने एम कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है के होते हैं के द्वारा पूरा किया है. FAE नीचे, उप उपकला (SED) गुंबद क्षेत्र में वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, और सीडी 4 + टी कोशिकाओं 5-9 के साथ intermingled एक नेटवर्क निहित है. प्रत्येक पीपी lymphoid follicl के मूल मेंई कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (FDCs) और एक बी सेल युक्त केंद्रीय कृमिसंबंधी केंद्र, टी सेल अमीर interfollicular क्षेत्र द्वारा flanked हैं. IgA + बी कोशिका plasmablasts और CD4 + effector और स्मृति कोशिकाओं के विकास में पी पी एस परिणाम द्वारा Antigen नमूना है कि बीज आसपास के लामिना propria और एक विस्तृत श्रृंखला के mucosal आक्रमणकारियों को उन्मुक्ति प्रदान.

जटिल immunologic प्रतिजन नमूने, प्रसंस्करण, पी पी एस में और प्रस्तुति के साथ जुड़े घटनाओं विदारक एक चुनौतीपूर्ण काम है, विचार है कि पीपी कोशिकाओं आंत्र mucosa में कुल lymphoid कोशिकाओं के केवल एक छोटे से अंश का गठन. कोशिकाओं के इस माहौल में इन विट्रो में लक्षण वर्णन में सहायता हम प्रवाह cytometric और कार्यात्मक विश्लेषण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पीपी immunofluorescence माइक्रोस्कोपी और immunohistology के लिए cryosections की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए कुल माउस पीपी कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. , समझौता ज्ञापनों का अलगाव, लक्षण और immunostaining के लिए हमारा प्रोटोकॉलई पीपी कोशिकाओं से प्रति उपन्यास नहीं है, के रूप में तथ्य यह है कि वहाँ कई वापस डेटिंग 25 से अधिक वर्षों उल्लेख है कि इन तकनीकों का हवाला देते हैं 5,6,9-11 द्वारा evidenced. बल्कि, हमारी प्रोटोकॉल (और दृश्य) पहली बार के लिए पी पी एस एकत्रित जांचकर्ताओं के लिए एक सुव्यवस्थित विधि प्रदान करता है. हम तकनीक का वर्णन आसानी से महारत हासिल कर रहे हैं और आसानी से> 90% सेल व्यवहार्यता के साथ कोशिकाओं की बड़ी संख्या उपज. प्रोटोकॉल cryosectioning पैदावार अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धारावाहिक आदर्श immunofluorescence धुंधला हो जाना और confocal इमेजिंग के लिए उपयुक्त वर्गों. इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल दो अन्य हाल जौव लेख पूरक. 1, फुकुदा और उनके सहयोगियों द्वारा ligated ileal पाश assays का उपयोग करने के पीपी एम 12 कोशिकाओं द्वारा रोगजनक बैक्टीरिया के तेज का आकलन बताता है. अन्य, Geem और उनके सहयोगियों द्वारा, अलगाव और DCs और माउस आंत्र mucosa से मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन का वर्णन है, लेकिन स्पष्ट रूप से उनके विश्लेषण से 13 पी पी एस शामिल नहीं.

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Protocol

पशु पारंपरिक, विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखे थे और Wadsworth सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों (IACUC) के साथ पूर्ण अनुपालन में इलाज किया गया.

1. मौखिक नलिका - पोषण

  1. (वैकल्पिक) प्रतिजन या एक 22 जी का उपयोग कर x1.5 में ब्याज के रोगाणुओं के साथ नलिका - पोषण पसंद के माउस तनाव. कुंद अंत खिला सुई (पॉपर वैज्ञानिक, नई हाइड पार्क, NY). डिलिवरी मात्रा माउस प्रति 400 μl अधिक नहीं होनी चाहिए.

2. फ्लो के लिए पीपी कोशिकाओं का अलगाव

  1. सीओ 2 asphyxiation द्वारा चूहों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों (IACUC) के अनुसार, euthanize.
  2. 70% इथेनॉल या सर्जरी से पहले Betadine के साथ पेट शुद्ध. प्रदर्शन एक मानक laparotomy है कि एक एकल (1 सेमी) रिब पिंजरे के आधार से 1.5 सेमी के बारे में midline शुरुआत के साथ शल्य ग्रेड कैंची का उपयोग चीरा शामिल. प्रति बेनकाबitoneal गुहा और cecum की पहचान. कैंची से कतरना जंक्शन ileal cecal टर्मिनल छोटी आंत और धीरे से अपनी संपूर्णता में आंत निकाल. देखभाल करने के लिए आंतों ऊतक नहीं hyperextend के रूप में यह peritoneal गुहा से हटाया जा रहा है.
  3. नम कागज तौलिये या Kimwipes के एक बिस्तर पर छोटी आंत करना. नमक के साथ छोटे धीरे आंत गीले ऊतक निर्जलीकरण को रोकने. नेत्रहीन व्यक्ति आंत (1 चित्रा) की ओर विरोधी mesenteric स्थित पी पी एस की पहचान. आमतौर पर, एक माउस 5 से 10 दिखाई पी पी एस कि समान रूप से ileum (डिस्टल) ग्रहणी (समीपस्थ) से वितरित कर रहे हैं. औसत पर, चार चूहों 23 पी पी एस निकलेगा.
  4. घुमावदार शल्य कैंची, धीरे आबकारी व्यक्ति पी पी एस और उपयोग उन्हें ठंड हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) में जगह नोट, कैंची वक्र पक्ष रखा जाना चाहिए पीपी बस के ऊपर और फिर धीरे ऊतकों को लागू. उत्पाद शुल्क केवल पीपी (नहीं surroundiएनजी) ऊतक और ठंड HbSS को हस्तांतरण.
    नोट: ° C सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए और इस धारा 2 में आगे बिंदु से incubations centrifugation चरणों का 4 में किया जाना चाहिए.
  5. 5 मिलीग्राम प्लीहा पृथक्करण और 15-20 मिनट के लिए मध्यम सेते में 37 में पी पी एस स्थानांतरण ° C जबकि सख्ती 250 rpm पर मिलाते हुए. अब ऊष्मायन समय नकारात्मक सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करेगा.
  6. एक एकल कक्ष, एक बाँझ (autoclaved) 70 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल सेल झरनी पर निलंबन की जगह पी पी एस पैदा करते हैं और जबरन एक 1 सीसी सिरिंज से एक सवार के आधार का उपयोग कर के जाल में ऊतक पीसने के. वैकल्पिक रूप से, दो बाँझ कांच पाले सेओढ़ लिया लिफाफे में autoclaved माइक्रोस्कोप स्लाइड और धीरे से एक प्रस्ताव के साथ आगे और पीछे के ऊतकों पीसने के बीच सैंडविच पी पी एस. एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए एक 5 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण.
  7. 1 मिमी की अंतिम सेल निलंबन एकाग्रता EDTA जोड़ें. के लिए एक घुमाव पर सेतेकमरे के तापमान पर 5 मिनट.
  8. पसाना सेल निलंबन एक दूसरे 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से किसी भी शेष सेलुलर समुच्चय या ऊतक मलबे को हटाने के लिए. एक 15 या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा.
  9. कोमल centrifugation के अधीन कोशिकाओं (500 XG पर 5 मिनट). प्रवाह बफर, जो buffered खारा (पीबीएस) 1% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) युक्त फॉस्फेट में पसाना तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं.
  10. सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, trypan नीले में 1:10 कोशिकाओं पतला और नेत्रहीन एक प्रकाश माइक्रोस्कोप और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं का निरीक्षण किया. वैकल्पिक रूप से, एक काउंटेस सेल काउंटर (Invitrogen) या इसी तरह के उपकरण के लिए स्वचालित रूप से सेल नंबर और व्यवहार्यता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    20-25 पी पी एस के साथ शुरू, इस प्रोटोकॉल> 2.5 x 10 कुल 6 कोशिकाओं उपज चाहिए. यह ~ x माउस प्रति 10 6 कोशिकाओं 0.8-1.2 equates.

कोशिकाओं के फ्लो के लिए एंटीबॉडी लेबल

<राजभाषा शुरू = "11">
  • 96-ही दौर नीचे की थाली के कुओं में कोशिकाओं (5 अच्छी तरह से प्रति 10) बांटना.
  • कोमल centrifugation (1000 XG पर 5 मिनट), और धीरे inverting प्लेट द्वारा पसाना तैरनेवाला विषय थाली.
  • एफसी ब्लॉक बफर में कोशिकाओं Resuspend और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एफसी ब्लॉक buffers की संख्या (जैसे चूहा CD16/CD32 विरोधी माउस, बी.डी. बायोसाइंसेज) कर रहे हैं, हम सिर्फ एक चूहे बी कोशिका (2.4.G2 ATCC) हाइब्रिडोमा कि murine खिलाफ एक मोनोक्लोनल आईजीजी 1 secretes से खर्च माध्यम का उपयोग इस कदम के लिए Fcγ रिसेप्टर्स.
  • इसके बाद के संस्करण के रूप में कोमल centrifugation (1000 XG पर 5 मिनट), और धीरे inverting प्लेट द्वारा पसाना तैरनेवाला के अधीन रहते हुए थाली.
  • Fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी सीधे वांछित कमजोर पड़ने पर सेल निलंबन के लिए, जोड़ें और निरंतर कमाल के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  • कोमल centrifugation के अधीन रहते हुए प्लेट (1000 XG पर 5 मिनट), और पसानाधीरे inverting प्लेट द्वारा तैरनेवाला.
  • प्रवाह बफर के 100 μl के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  • 5 मिनट, धीरे inverting प्लेट द्वारा और पसाना तैरनेवाला के लिए 1000 XG पर थाली अपकेंद्रित्र.
  • Resuspend 400 μl नियतन बफर, जो प्रवाह बफर के 300 μl में 1% paraformaldehyde PHEM बफर (60 मिमी पाइप, 25 मिमी HEPES, 10 मिमी EGTA, 4 मिमी पीएच में 2 MgCl 6) के 100 μl के होते कोशिकाओं.
  • विषय कोशिकाओं प्रवाह cytometry एक FACSCalibur या समकक्ष का उपयोग करने के लिए. सेल क्वेस्ट प्रो सॉफ्टवेयर संस्करण का उपयोग कर 5.2 परिणामों का विश्लेषण.

    • 3. पीपी Cryosections की तैयारी

    1. ऊतक संग्रह के अग्रिम में, 7x7x5 मिमी प्लास्टिक के आधार molds इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) जोड़ने. इसके अलावा एक देवर या बर्फ बाल्टी में तरल नाइट्रोजन (एमएल> 750) का एक पूल तैयार.
    2. माउस euthanize और एक laparotamy प्रदर्शन, जैसा कि ऊपर वर्णित है. आंत और गीला कागज तौलिए पर जगह निकालें.
    3. सेcyrosectioning के लिए पी पी एस को अलग करने के लिए, छोटी आंत के 0.5 सेमी अनुप्रस्थ खंडों पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश के लिए एक एकल पीपी और हस्तांतरण ऊतक युक्त काटा. धीरे पीबीएस के साथ इन क्षेत्रों के लुमेन कुल्ला अवांछित fecal मलबा हटाने के.
    4. आधार अक्टूबर युक्त molds के अंदर खड़ी आंतों ऊतक क्षेत्रों रखें. तरल नाइट्रोजन में molds विसर्जित कर दिया और ऊतकों को पूरी तरह से रोक (1-2 मिनट) की अनुमति. अक्टूबर का रंग सफेद स्पष्ट से बदलने के लिए जब ऊतक पूरी तरह से जमे हुए है. एक अधिक क्रमिक ठंडा (उदाहरण के लिए अक्टूबर के खुर को कम करने) के लिए, isopentane की एक स्नान तरल नाइट्रोजन वाष्प से ठंडा में विसर्जित मोल्ड नोट: उपयुक्त सुरक्षा चश्मे पहनें जब तरल नाइट्रोजन के साथ काम कर रहा है.
    5. तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर संदंश से जमे हुए आधार molds निकालें और मोल्ड कमरे में अभी काफी लंबा तापमान (~ 10-15 सेकंड) में गर्म करने के लिए अक्टूबर ब्लॉक के किनारों को नरम करने के लिए अनुमति देते हैं. फिर से अक्टूबर के जमे हुए ब्लॉक हटानेमोल्ड, पलटना और एक साफ 4 x 4 एल्यूमीनियम पन्नी के सेमी टुकड़े पर ब्लॉक बेदखल करना पीठ पर धीरे दबाएँ. तुरंत पन्नी और एक लेबल नमूना बैग में जगह तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ पर संग्रहीत में ऊतक लपेटो. वैकल्पिक रूप से, एक फ्रीजर (<-20 डिग्री सेल्सियस) में ऊतक हस्तांतरण. एक सप्ताह के भीतर ऊतक का प्रयोग करें, अन्यथा ब्लॉक उम्र के साथ भंगुर हो जाएगा.

    Cryosectioning

    1. एक Leica CM3050S cryomicrotome या बराबर का उपयोग ऊतक Cryosection. cryostat पर चैम्बर तापमान -21 सेट किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस
    2. वर्गों है कि मोटाई में 12-14 सुक्ष्ममापी के लिए प्रयास करते हैं.
    3. फिशर SuperFrost (या समतुल्य) प्लस ग्लास खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों ले लीजिए और नेत्रहीन का निरीक्षण एक मानक कम शक्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग. यदि एकाधिक अनुभागों स्लाइड पर एकत्र की जा रही हैं, तो सुनिश्चित करने के लिए, कि वे एक साथ अनुप्रवाह धुंधला हो अनुप्रयोगों के लिए क्लस्टर हैं.
    4. स्टोर टीवह एक स्लाइड बॉक्स में कमरे के तापमान पर स्लाइड और, आदर्श, उन्हें कुछ दिनों के भीतर का उपयोग करें.

    Cryosections एंटीबॉडी लेबल और Confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

    1. एसीटोन में ऊतक धुंधला हो जाना या 2 मिनट के लिए जार रैक में विसर्जित स्लाइड्स (या मेथनॉल). लंबे समय तक ऊष्मायन ऊतकों के कारण स्लाइड से अलग हो सकता है.
    2. नए धुंधला जार स्लाइड स्थानांतरण और पीबीएस टी (0.05% Tween-20 के साथ 1X पीबीएस) के साथ 3 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धो लो.
    3. एक ImmEdge hydrophobic कलम के साथ वर्गों घेरना. इससे यह सुनिश्चित होगा है है कि अभिकर्मकों और एंटीबॉडी incubations दौरान उस क्षेत्र तक ही सीमित रहेगी.
    4. एक humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट, प्रकाश से रक्षा के लिए ब्लॉक बफर में स्लाइड्स (2% पीबीएस में बकरी सीरम) सेते हैं.
    5. एफसी 10 मिनट के लिए ब्लॉक बफर (ऊपर देखें) के साथ 37 स्लाइड्स सेते डिग्री सेल्सियस
    6. पीबीएस - टी और Kimwipes या अन्य शोषक ऊतक का उपयोग वर्गों के आसपास शुष्क क्षेत्र में डुबकी स्लाइड्स.वास्तविक ऊतक वर्गों नहीं छूना ध्यान रखना.
    7. ओवरले प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और 30 मिनट के लिए सेते 37 ° एक humidified कक्ष में सी के साथ ऊतक वर्गों. प्राथमिक एंटीबॉडी आम तौर पर 20 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता ब्लॉक बफर में पतला. सीधे लेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग वांछनीय है, क्योंकि के रूप में कई के रूप में तीन एंटीबॉडी इस कदम पर सीधे जोड़ा जा सकता है. सीधे लेबल एंटीबॉडी भी अतिरिक्त एंटीबॉडी ऊष्मायन कदम के लिए समाप्त करने की जरूरत है.
    8. धो पीबीएस में विसर्जन द्वारा 3 (5 मिनट प्रत्येक) बार स्लाइड.
    9. यदि प्रासंगिक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक नमी कक्ष में आवश्यक, सेते स्लाइड.
    10. धो पीबीएस में विसर्जन द्वारा 3 (5 मिनट प्रत्येक) बार स्लाइड.
    11. PHEM बफर में 4 मिनट 1% paraformaldehyde में, जैसा कि ऊपर वर्णित के लिए स्लाइड सेते हैं.
    12. पीबीएस के साथ 1 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला.
    13. Kimwipes का उपयोग कर वर्गों के आसपास सूखी क्षेत्र या अन्य को अवशोषितent ऊतक. वास्तविक ऊतक वर्गों नहीं छूना ध्यान रखना. एक विंदुक या dropper का प्रयोग, धीरे गोल्ड बढ़ते मध्यम खंड पर सीधे लम्बा की एक बूंद जगह है. बढ़ते मध्यम देखभाल करने के लिए बुलबुले से बचने पर एक गिलास coverslip लागू करें. सोख्ता कागज का उपयोग करने के लिए किसी भी अतिरिक्त बढ़ते मध्यम को अवशोषित करने के लिए.
    14. खुर्दबीन स्लाइड के लिए वाणिज्यिक नेल पॉलिश और शुष्क हवा की अनुमति के साथ सील coverslips.
    15. एक Leica टीसीएस SP5 या समकक्ष confocal खुर्दबीन के साथ स्लाइड देखें.

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    Representative Results

    प्रवाह कुल पीपी कोशिकाओं के monodisperse निलंबन की cytometric विश्लेषण अच्छे और गरीब सेल की तैयारी के बीच एक स्पष्ट अंतर का पता चलता है. 80% से अधिक की व्यवहार्यता के साथ अच्छी सेल की तैयारी में, कोशिकाओं के विशाल बहुमत के उच्च आगे तितर बितर (FSC), उच्च सेल की मात्रा का एक सूचक है, और कम (एसएससी) की ओर तितर बितर, कम सेल granularity (2A चित्रा) का एक संकेतक प्रदर्शित करता है. इस प्रयोग में, हम भी जानबूझकर कमरे के तापमान (बजाय की बर्फ पर) पर अलगाव चरणों के दौरान पीपी कोशिकाओं incubating और अंतिम चरण में, एक "गरीब सेल तैयारी" तैयार, पीबीएस FCS प्लस 1% के साथ कोशिकाओं incubating (बजाय PHEM ) बफर. इन गरीब सेल की तैयारी में, कोशिकाओं के बहुमत कम FSC और एसएससी उच्च प्रदर्शन और संकेत गेट R1 (चित्रा 2B) के बाहर हैं. इन कोशिकाओं की संभावना apoptosis और / या परिगलन के दौर से गुजर रहे हैं.

    चित्रा 3 के एक कॉकटेल के उपयोग को दर्शाता है चार different fluorophore संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पीपी एकल कक्ष निलंबन में सेल प्रकार की एक किस्म के बीच भेदभाव है. भेदभाव के क्लस्टर (सीडी) CD19 मार्करों और B220 पता चलता है कि बी कोशिकाओं gated पीपी सेल की आबादी का 60% (चित्रा 3 ए) का गठन के साथ लेबल. विशिष्ट टी सेल सबसेट CD3 और CD4 (3B चित्रा) या CD3 और CD8 (चित्रा 3C) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ डबल लेबलिंग द्वारा आसानी से enumerated जा सकता है. + CD4 और CD8 + टी कोशिकाओं ~ 23% और ~ 9% पीपी कोशिकाओं की कुल संख्या, क्रमशः गठन. DCs कैंपेन्स के लेबल CD11c + (चित्रा 3 डी) और CD103 + (नहीं दिखाया गया है) भी इस विधि द्वारा enumerated जा सकता है. CD11c + DCs कुल gated आबादी है, जो मोटे तौर पर पीपी प्रति 10,000 DCs बराबर है के बारे में 8% करने के लिए योगदान करते हैं. यह 14 दूसरों के द्वारा मनाया DCs की संख्या के साथ बिल्कुल सहमत हैं.

    CD11c की आबादी के बीच + + के लिए सकारात्मक थे. इसी तरह के परिणाम जब पीपी कोशिकाओं C57B / 6 चूहों (3E चित्रा) से एकत्र कर रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं.

    "बेचारी" सेल तैयारियाँ अत्यधिक भ्रामक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, क्योंकि मोटे तौर पर मृत या मर कोशिकाओं एंटीबॉडी गैर विशेष रूप से बाइंड करने के लिए करते हैं. के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, कोशिकाओं है कि दोनों बी सेल (B220) मार्कर और टी सेल मार्कर (पैनल ए CD3, CD4, पैनल बी) के लिए सकारात्मक दाग की आबादी तीन गुना से अधिक के बीच एक अच्छा और भिन्न हो सकते हैं बुरा सेल तैयारी चित्रा 4 B220 + और ​​CD3 + कोशिकाओं डबल सकारात्मक (पैनल) के एक से अधिक प्रतिनिधित्व, B220 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता चलता है + बी कोशिकाओं और सीडी 4 + टी कोशिकाओं गरीब सेल तैयारी में डबल पॉजिटिव कोशिकाओं (पैनल बी). जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, रिश्तेदार बी और टी सेल संख्या में असमानता बनाम अच्छा गरीब होने की संभावना है गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन के कारण कोशिकाओं मर रहा है.

    हमारा प्रोटोकॉल भी दर्शाता है कि माउस पीपी cryosections histopathologic विश्लेषण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से immunolabeling उत्तरदायी हैं चित्रा 5 तुलना माउस पी पी एस (एक पैनल, बी) आयल और जमी वर्गों (पैनल सी) के एच एंड ई धुंधला हो. जबकि आयल वर्गों सेलुलर स्तर पर अधिक संकल्प जब एच एंड ई दाग प्रदान करते हैं, पीपी कीटाणु केन्द्रों के प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में अधिक आसानी से कर रहे हैं cryosection वर्गों (आंकड़े 5A सी) में सीमांकन. एच एंड ई दाग cryosections immunolabeled cryosections साथ तुलना पक्ष द्वारा साइड के लिए उपयोगी होते हैं. एक ठेठ पीपी विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ दाग टी कोशिकाओं, विरोधी CD11c एंटीबॉडी लेबल के DCs और विरोधी B220 एंटीबॉडी को उजागर करने के लिए बी कोशिकाओं को उजागर cryosection चित्रा 6 में दिखाया गया है.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. माउस Peyer patches तीन दिखाई पी पी एस (सफेद तीर) के साथ एक नया excised माउस छोटी आंत की छवि. पी पी एस आंतों serosa की ओर विरोधी mesenteric छाला संरचनाओं की तरह (5 एक्स 5 मिमी) रूप में दिखाई देते हैं.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. कुल पीपी प्रवाह cytometry से विश्लेषण कोशिकाओं कुल पीपी कोशिकाओं के monodisperse निलंबन प्रवाह cytometry एक बी.डी. FACSCallibur का उपयोग करने के लिए किया गया था एक अच्छा सेल तैयारी के उदाहरण (ए). कोशिकाओं के विशाल बहुमत के उच्च आगे तितर बितर (FSC), उच्च सेल की मात्रा का एक सूचक है, और कम (एसएससी) की ओर तितर बितर, कम सेल granularity का एक संकेतक प्रदर्शित करता है. इन कोशिकाओं R1 में बॉक्सिंग हैं. कम FSC और उच्च एसएससी, R1 गेट के बाहर स्थित है, के साथ कोशिकाओं के मृत या मर रहा कोशिकाओं (बी) एक गरीब सेल तैयारी है, जिसमें कोशिकाओं का बहुमत गेट के बाहर का उदाहरण माना जाता है.R1 कम FSC और एसएससी उच्च कारण.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. पीपी लिम्फोसाइटों के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric विश्लेषण. कुल पीपी कोशिकाओं के monodisperse निलंबन fluorophore संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated और फिर प्रवाह cytometry अधीन (ए) पीपी बी कोशिकाओं की CD19 और B220 लेबलिंग (BC) कुल सेल आबादी के डबल लेबलिंग CD3 CD4 और (ख) या सीडी 8 (सी) के साथ विशिष्ट टी सेल सबसेट की गणना करने के लिए (डी) B220 (बी सेल मार्कर) के लिए कुल सेल आबादी के डबल लेबलिंग और CD11c (डीसी मार्कर) (ई) B220 तुलना, CD3 , CD4, और पीपी BALB / ग और C57B / 6 चूहों से कोशिकाओं पर CD11c धुंधला हो जाना.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. गरीब पीपी सेल की तैयारी के एक परिणाम के रूप में भ्रामक प्रवाह cytometry डेटा अच्छा (बाएं पैनल) और गरीब (सही पैनल) पीपी सेल की तैयारी (ए) एंटीबॉडी के साथ दाग थे B220 और CD3 बी और टी सेल आबादी या (बी) एंटीबॉडी अंतर B220 और CD4 टी कोशिकाओं की एक सबसेट से बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए. वहां आम तौर पर कर रहे हैं कोशिकाओं है कि B220 और CD3 या CD4 के लिए सकारात्मक दाग की बहुत कुछ कोशिकाओं, के रूप में छोड़ दिया पैनल में दिखाया गया है. इसके विपरीत, गरीब सेल तैयारी में डबल सकारात्मक कोशिकाओं कुल कोशिकाओं के लगभग 20% का गठन. अधिक विवरण के बारे में क्या एक "गरीब" सेल तैयारी का गठन के लिए पाठ देखें.

    चित्रा 5
    चित्रा 5. प्रतिनिधि एच एंड ई दाग पीपी वर्गों आयल एम्बेडेड. वर्गों (ए, बी) या ileal पीपी का cryosections (सी)एस एच एंड ई के साथ दाग थे और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized नोट कि lymphoid के रोम के प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों आसानी से cryosections में सीमांकन कर रहे हैं, रूप में पैराफिन वर्गों की तुलना में. Abbreviations: वी, villous, FAE, कूप से जुड़े उपकला, SED, उप उपकला गुंबद, वामो, lymphoid कूप.

    चित्रा 6
    6 चित्रा. Murine पीपी cryosections Immunofluorescent लेबलिंग. हौसले एक माउस के ऊतक वर्गों पीपी हवा सूखे, एसीटोन तय, और (ए) FITC संयुग्मित विरोधी CD3 एंटीबॉडी अंतर कूपिक क्षेत्रों में टी कोशिकाओं लेबल और साथ दाग थे कटौती लामिना propria, (बी) पीई संयुग्मित विरोधी CD11c एंटीबॉडी SED में DCs को उजागर करने के लिए, और (सी) APC संयुग्मित विरोधी B220 एंटीबॉडी बी कोशिकाओं को उजागर करने के लिए (डी) एक समग्र ओ.छवियों पैनलों एसी फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न में च. स्केल बार ~ 100 सुक्ष्ममापी है.

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    Discussion

    इस अनुच्छेद में, हम immunostaining के लिए पीपी प्रवाह cytometric और कार्यात्मक विश्लेषण और cryosections के लिए एकल कक्ष की तैयारी की तैयारी करने के लिए समानांतर प्रोटोकॉल उपलब्ध कराई है. दोनों तरीकों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और आसानी से सुलभ हैं, एक प्रवाह cytometer और cryostat उपलब्ध प्रदान कर रहे हैं. जांचकर्ताओं के लिए पहली बार यह बताया जाना चाहिए कि जब तिल्ली की तुलना में, पी पी एस से कुल सेल पैदावार अपेक्षाकृत अल्प हैं. बहरहाल, प्रोटोकॉल हम आम तौर पर 0.8-1.2 x 10 6 एक माउस से कुल पीपी कोशिकाओं के बीच पैदावार रूपरेखा. स्केल - संभव है, हालांकि हम आम तौर पर पूल 20-25 से अधिक पी पी एस नहीं करते हैं, क्योंकि, हमारे अनुभव में, एकत्रीकरण होता है और सेल (और व्यवहार्यता) पैदावार गिरावट बहुत. दूसरी ओर, हम इस प्रोटोकॉल के लिए 15 से कम पी पी एस का उपयोग नहीं की सिफारिश करते हैं, के रूप में एक महत्वपूर्ण जन सफलतापूर्वक पूरे अलगाव की प्रक्रिया के माध्यम से कोशिकाओं को ले जाने के लिए आवश्यक है. यदि अधिक से अधिक सेल व्यवहार्यता अनुप्रवाह कार्यात्मक के लिए एक प्राथमिकता हैassays, हम अनुशंसा करते हैं कि अलग कक्षों का एक छोटा सा नमूना propidium आयोडाइड धुंधला अधिक सटीक gating कुल पीपी सेल आबादी से कोशिकाओं के व्यवहार्य पूल के लिए अनुमति देने के अधीन हो. अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हमारे विधि अनुप्रयोगों अगर एक विशेष सेल सबसेट दत्तक हस्तांतरण के लिए या इन विट्रो विश्लेषण में, उदाहरण के लिए वांछित है छँटाई सेल करने के लिए उत्तरदायी है.

    पी पी एस के संग्रह cryosectioning के लिए अपेक्षाकृत सरल है, हालांकि पीपी ऊतकों की वास्तविक सेक्शनिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह आवश्यक है, उदाहरण के लिए, है कि पीपी ऊतकों ठीक molds में उन्मुख (यानी मोल्ड के आधार पर सीधा) करने के लिए सुनिश्चित करें कि सच अनुप्रस्थ वर्गों को प्राप्त कर रहे हैं. हम तस्वीर ठंड पीपी ऊतकों का प्रस्ताव और फिर एसीटोन या मेथनॉल तरह fixatives precipitating एंटीबॉडी जेट प्रतिजनकता ("") की रक्षा करने के लिए cryosections subjecting, भले ही समग्र सेलुलर और उप सेलुलर resol में एक कमी में fixatives परिणाम precipitatingution. यदि प्रतिजनकता संरक्षण एक विशेष चिंता का विषय नहीं है, तो हम के इस्तेमाल की सिफारिश पार जोड़ने paraformaldehyde (पीएफए), सेलुलर और उप सेलुलर संरचनाओं के बेहतर संरक्षण में जो परिणाम की तरह fixatives. दरअसल, पीएफए ​​के ऊतकों cryosectioning करने से पहले तय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बस> 2 घंटे के लिए 4% पीएफए ​​की प्रचुर मात्रा में हौसले से excised पी पी एस, विसर्जित कर देते हैं पीबीएस के साथ ऊतक धोने के लिए अतिरिक्त लगानेवाला हटाने, sucrose में ऊतक (15%) संतुलन में लाना अगर वांछित है, और फिर अक्तूबर में एम्बेड, जैसा कि ऊपर वर्णित है. ऊतक cryosectioned तो हो सकते हैं, लेकिन ग्लाइसिन समाधान (पीबीएस में 15 मिनट के लिए 0.1 एम) के साथ बंद किया जाना चाहिए अवशिष्ट प्रतिक्रियाशील पीएफए ​​immunostaining करने से पहले बुझाना.

    अंत में, जबकि हम पीपी cryosections immunofluorescent लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, ये वही वर्गों immunohistochemistry (आईएचसी) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईएचसी किट (जैसे वेक्टर लैब्स, Burlingame, CA) का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी हैं. आईएचसी के लिए, यह जरूरी है कि एक अवरुद्ध peroxidase या quenc शामिलप्रोटोकॉल में hing कदम है, के रूप में अंतर्जात पराक्सिडेजों आंत्र mucosa में अत्यधिक प्रचलित हैं. दूसरों का उल्लेख किया है कि आईएचसी के लिए, पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ चूहों के हृदय छिड़काव ऊतक संरक्षण में सुधार.

    सारांश में, हम lymphocytes और DCs सहित murine पीपी कोशिकाओं के मात्रात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए समानांतर और पूरक प्रोटोकॉल उपलब्ध कराई है. एकल कक्ष निलंबन की तैयारी पी पी एस में प्रमुख सेल प्रकार के इन विट्रो विश्लेषण में मात्रात्मक और कार्यात्मक सक्षम बनाता है, है जबकि cryosections की immunolabeling विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के स्थानीयकरण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल सेल कि बातचीत में सीटू मौजूद के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इन दोनों तरीकों की प्राथमिक सीमा यह है कि न तो पीपी सेल सेल बातचीत के "वास्तविक समय" दृश्य का प्रतिनिधित्व करता है. कम से कम समय के लिए, पी पी एस intravital इमेजिंग, एक तकनीक है कि लिम्फोसाइट dynami की समझ में क्र ांतिकारी परिवर्तन के लिए अभेद्य साबित किया हैपरिधीय लिम्फ नोड्स में सीएस. जब तक पी पी एस के intravital इमेजिंग सीमित तकनीकी बाधाओं को दूर कर रहे हैं, प्रोटोकॉल पीपी प्रवाह cytometric और कार्यात्मक विश्लेषण और immunostaining के लिए पीपी cryosections के लिए एकल कक्ष की तैयारी की तैयारी के लिए इस अनुच्छेद में उल्लिखित जांच और विशिष्ट उप के प्रतिरक्षाविज्ञानी कार्यों को समझने के प्राथमिक साधन के रहेगा पी पी एस में कोशिकाओं की आबादी, आंत से जुड़े lymphoid ऊतकों के प्राथमिक आगमनात्मक साइटों.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgments

    हम सेल विश्लेषण और पैराफिन वर्गों की तैयारी के लिए हेलेन जॉनसन (Wadsworth केंद्र पशु हिस्तोपैथोलोजी कोर) में सहायता के लिए धन्यवाद Renjie सांग (Wadsworth केंद्र फ्लो कोर). हम confocal माइक्रोस्कोपी और छवि संग्रह के साथ सहायता के लिए धन्यवाद डॉ. रिचर्ड ए कोल (Wadsworth केंद्र लाइट माइक्रोस्कोपी कोर). हम एनिमेशन के साथ सहायता के लिए एंडी बेंटले (Wadsworth केंद्र फोटो और चित्रण) स्वीकार करना चाहते हैं.

    MDJ लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (HHMI) फैलोशिप द्वारा समर्थित है. SA Wadsworth केंद्र स्वास्थ्य अनुसंधान इंक अंदर postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस काम के हिस्से में NIH HD061916 और GM082978 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    OCT Compound Tissue-Tek 4583
    7x7x5 mm Base Molds Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge Pen Vector Labs H-4000
    Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951
    Edge Rite Blade Thermo Scientific 4280L
    Anti-Mouse CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    Anti-Mouse CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    Anti-Mouse CD3-FITC BD Pharmigen 561798
    Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652
    Anti- Mouse CD8-PE BD Pharmigen 553032
    Anti-Mouse CD19-PercP BioLegend 115531
    Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red Fisher Scientific 14175-079
    70 μm cell strainer BD Falcon 352350
    Spleen Dissociation Medium Stem Cell Technologies 7915
    Goat serum Invitrogen 16210-072
    Fc Block ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes obtained from cell line 2.4.G2
    Curved Scissor F.S.T 14061-09
    Cryostat Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    Countess Cell Counter Invitrogen
    Hematoxylin Richard Allan 7211
    Eosin Richard Allan 71304
    Formalin Starplex Scientific 3661

    Table 1. Reagents and equipment used in this study.

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    References

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    संक्रमण 73 अंक संक्रामक रोगों इम्यूनोलॉजी सूक्ष्म जीव विज्ञान चिकित्सा सेलुलर जीवविज्ञान सर्जरी बैक्टीरियल संक्रमण और Mycoses प्रतिरक्षा प्रणाली रोग पाचन प्रणाली रोग है Peyer पैच आंत mucosal lymphoid ऊतक लिम्फोसाइट वृक्ष के समान प्रवाह cytometry cryosectioning मौखिक नलिका - पोषण immunostaining अलगाव सेल संस्कृति पशु मॉडल
    अलग और immunostaining लिम्फोसाइटों और murine Peyer पैच से वृक्ष के समान कोशिकाओं
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    De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis,… More

    De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (73), e50167, doi:10.3791/50167 (2013).

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