Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.

Abstract

فيتامين A ضروري لرؤية و. النمو / التفريق بين جميع أجهزة الإنسان تقريبا الريتينول البلازما بروتين ملزمة (RBP) هو مبدأ والناقل محددة من فيتامين A في الدم. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإنتاج وتنقية هولو-RBP واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة النقل من فيتامين A من قبل مستقبلات RBP عالية تقارب STRA6. أول تقنية يجعل من الممكن لإنتاج كمية كبيرة من نوعية عالية هولو-RBP (100٪ محملة الريتينول) لفيتامين (أ) المقايسات النقل. عالية الجودة RBP أمر ضروري لفحوصات الفنية لتتجمع RBP النشرات فيتامين A تلوث بسهولة والبكتيرية في إعداد RBP يمكن أن يسبب التحف. جعلت تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي مثل الكهربية إسهامات حاسمة في دراسات النقل الغشاء. لم يتم النقل RBP الريتينول مستقبلات بوساطة تحليلها في الوقت الحقيقي حتى وقت قريب. والأسلوب الثاني هو موضح هنا الجرميةل في الوقت تحليل الإفراج الريتينول STRA6 المحفزة أو التحميل. أسلوب الثالث هو في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى الريتينول الخلوية I بروتين ملزمة (CRBP-I). هذه التقنيات توفر حساسية عالية في الكشف والقرار فيتامين A في RBP مستقبلات آلية الامتصاص.

Introduction

فيتامين A هو جزيء العضوية التي لا غنى عنها لبقاء الإنسان وحسن سير جميع أجهزة الإنسان تقريبا. فيتامين A المشتقات (الرتينوئيدات) المشاركة في مختلف الأحداث البيوكيميائية والخلوية بما في ذلك الاستشعار من الضوء لرؤية 1،2 وتنظيم التعبير الجيني والترجمة البروتين أثناء التطور الجنيني والكبار في الأنسجة 3-6. على الرغم من الريتينول لديه القدرة على نشر نظام ككل، وجاء مع تطور البلازما بروتين ملزمة الريتينول، وهو بروتين الناقل محددة لفيتامين (أ) النقل في الدم لتحقيق الكفاءة العالية والدقة وتجنب السمية المرتبطة نشر عشوائي 7-10. A مستقبلات عالية تقارب الممارسات التجارية التقييدية التي تربط لويستغرق فيتامين A كان الافتراض في 1970s و11-13. على الرغم من الأدلة المتراكمة منذ ثلاثة عقود على وجود مستقبلات RBP 14-31، وناقشت فرضية مستقبلات لسنوات عديدة نظرا لexistenc(ه) من تعريف غير صحيح من هولو-RBP. التعريف الصحيح للهولو-RBP هو أنه هو مجمع عالية تقارب بين الريتينول 01:01 والممارسات التجارية التقييدية. استخراج المتكررة من قبل هولو-RBP المذيبات العضوية ضروري لإنتاج APO-RBP. ويستخدم هذا التعريف من قبل مختبرات كلها تقريبا دراسة RBP 7،9،32-35 أو مستقبلات RBP 14-31،36-42. تعريف غير صحيح من هولو-RBP الذي تم استخدامه لدحض وجود مستقبلات RBP هو خليط من الريتينول الحاد الحرة مع APO-RBP. منذ وظيفة مستقبلات فيتامين A في RBP امتصاص من هولو-RBP هو الافراج عن الريتينول من هولو-RBP، فإن مستقبلات RBP تلعب أي دور في امتصاص فيتامين الريتينول إذا مجاني لتبدأ (على النحو الذي اقترحه تعريف غير صحيح من هولو -RBP).

دعا مؤخرا تحديد مستقبلات RBP باعتبارها multitransmembrane البروتين مجال STRA636 وظيفتها في امتصاص فيتامين A-من هولو RBP 36-43 يجادل بقوة ضد فرضية أن لا RBPتحتاج إلى مستقبلات فيتامين لتقديم تحليلات مفصلة A. كشفت أن لديها STRA6 المجالات عبر الغشاء 9 مع محطة تقع خارج الخلية-N وC-تقع محطة داخل خلوي 40. عبر الغشاء الواقع بين 6 و 7 هو مجال الممارسات التجارية التقييدية الأساسية ملزمة 39. ويقترن STRA6 على حد سواء والانتقال بعيد المدى المحددة CRBP-I في امتصاص فيتامين A-RBP من هولو، ولكن لا الانتقال بعيد المدى المحددة ولا CRBP-I. مطلوب للغاية لتعزيز النشاط STRA6 41 القدرة على تحفيز STRA6 الريتينول بيان من هولو-RBP هو المفتاح لفيتامين A في نشاط امتصاص 41. من خلال الاعتماد على STRA6 لاطلاق سراح الريتينول، ويمكن التسليم عن طريق فيتامين (أ) فيتامين (أ) نقل RBP لاستهداف الخلايا في الأنسجة الطرفية مع خصوصية عالية وكفاءة.

ويتضح على الأهمية الحاسمة لتعريف هولو-RBP وليس فقط عن طريق إعداد النقاش التاريخية على وجود مستقبلات RBP، ولكن أيضا من خلال الورقات الثلاث الأخيرة ذات الصلة على أساس تعريفات DIF-هولو RBPferent من التعريف الأصلي والصحيح 44-46. استخدام الورقة الأولى التعريف هولو-RBP التي تم استخدامها في رفض وجود مستقبلات RBP لدراسة مستقبلات RBP 44. جاء الأوراق الثاني والثالث إلى تعريف الثالث من هولو-RBP التي جعلت من أقل احتمالا لالريتينول إلى دراسة لتشكيل مجمع السليم مع RBP 45،46. أعدت هذه الدراسات عن طريق خلط 3 H-retinol/RBP هولو-RBP (ولا حتى APO-RBP) مع 3 H-الريتينول. وبما أن هذا الفحص لم ديك 3 H-retinol/RBP شكلت ولم إزالة المفرط مجانا 3 H-الريتينول 45،46، فإنه ليس مقايسة لامتصاص فيتامين H-3 من 3 H-retinol/RBP، ولكن هو حر 3 نشر الفحص H-الريتينول. فقد تبين في وقت سابق ان STRA6 لا يعزز امتصاص الخلوية من الريتينول مجانا من الانتقال بعيد المدى المحددة 38 أو CRBP-I 41. تقريبا لا بد لجميع الممارسات التجارية التقييدية الريتينول في الدم وعدم وجود كشف الصحائفه الريتينول. A المهمة الرئيسية للمستقبلات RBP هو تحفيز إطلاق الريتينول من هولو-RBP خلال امتصاص فيتامين إي من هولو-RBP 41. إذا تم الافراج بشكل مصطنع أو الريتينول في شكل حر لتبدأ 45،46، ليست هناك حاجة لمستقبلات RBP. النتائج مختلفة بشكل كبير تم الحصول عليها من فحص مجاني نشر الريتينول بالمقارنة مع المقايسات يعتمد على استعداد بشكل صحيح هولو-RBP توضيح أن إعداد الصحيح للRBP أمر حاسم لفحوصات جانه الفنية.

يمكن تنقيته من مصل الإنسان RBP 41، لكن الإجراء معقد والعائد منخفض. نهج بديل هو إنتاج RBP في E. القولونية. لأن E. القولونية ليس لديها القدرة على أضعاف بشكل صحيح الثدييات البروتينات يفرز مع أكثر من زوج واحد من السندات ثاني كبريتيد مثل RBP، لا بد من الممارسات التجارية التقييدية refold وتنقية البروتين مطوية بشكل صحيح. البروتينات تتجمع لا تتصرف بشكل مختلف عن RBP فقط مطوية تصحيحه في المقايسات المختلفة،ولكن يمكن أيضا أن يسبب تراكم البروتين أثناء التخزين. لنفس السبب، ويتم إنتاج سوى APO-RBP عالية الجودة من هولو-RBP. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل لانتاج عالية الجودة 100٪ RBP محملة الريتينول من خلال التعبير البكتيرية، طوي ثانية، وتنقية HPLC. HPLC تنقية ليس فقط يزيل RBP مطوية بشكل غير صحيح ولكن أيضا التلوث الجرثومي كبيرة القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب خطورة إذا تم استخدام الممارسات التجارية التقييدية في المقايسات نقل الإشارة. وصفنا أيضا اثنين من تقنيات الرصد الحساسة في الوقت الحقيقي لدراسة الريتينول النقل STRA6. كل تقنيات تعتمد على الممارسات التجارية التقييدية ذات جودة عالية. نظرا لضيق المكان، والتقنيات الكلاسيكية المشعة فيتامين ريتينويد القاعدة والقائمة على HPLC لا وصف المقايسات امتصاص هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الإنتاج، وطوي ثانية، وتنقية HPLC من هولو-RBP

  1. تحويل BL-21cells مع ناقلات pET3a لإيواء [كدنا] RBP الإنسان مع البطاقات صاحب 6X على محطة-N. تحول زراعة BL-21 في الخلايا شاكر في C ° 37 في 40 مل مع وسائل الإعلام LB كربنيسيلين حتى OD في 600 نانومتر تصل إلى 0.5. حمل RBP التعبير البروتين بإضافة IPTG ل1MM. تنمو هذه البكتيريا في 37 ° C آخر 5 ساعة.
  2. RBP القولونية المنتجة في الوقت الحاضر هو في الغالب غير قابلة للذوبان في الهيئات إدراج. لإثراء الهيئات إدراج، الخلايا بيليه في 10،000 XG لمدة 20 دقيقة. يصوتن ثم الخلايا على الجليد في 5 مل PBS مع مثبطات الأنزيم البروتيني، تليها 2 دورات التجميد والذوبان. بيليه أسفل الهيئات إدراج في 20000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والحفاظ على بيليه على الجليد.
  3. ذوبان إدراج بيليه الجسم عن طريق صوتنة في 10 مل 7،5 هيدروكلوريد الجوانيدين M. إضافة وحدة تخزين النصف (5 مل) من 25 مم تريس العازلة، 9.0 درجة الحموضة وDTT إلى ج النهائيoncentration من 10 مم. مزيج بقوة على حل خلاط دوامة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للحد تماما وتفسد البروتينات.
  4. أجهزة الطرد المركزي الحل البروتين لإزالة المواد غير القابلة للذوبان في 18000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 بعد زيادة ونقصان، ونقل إلى أنبوب طاف جديدة ووضع أنبوب على الجليد.
  5. إعداد أربعة مجلدات (60 مل) من العازلة طوي ثانية (25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.0، 0.3 مم سيستين، 3.0 السيستين ملم، 1 ملم EDTA). ديغا المخزن المؤقت طوي ثانية. إعداد أيضا 600 ميكرولتر الريتينول ملي 10 في الايثانول تحت ضوء أحمر خافت. يبقيه في الظلام على الجليد. كل المخزن المؤقت طوي ثانية والحل الريتينول يجب أن تكون طازجة.
  6. تبريد كلا من البروتين والحل المخزن المؤقت طوي ثانية على الجليد لمدة لا تقل 30 دقيقة. ارتفاع درجة الحرارة يقلل من المرجح نوعية refolded RBP. إضافة 1 مل العازلة طوي ثانية نقطه نقطه و 10 ميكرولتر حل الريتينول بدوره في حين يتم خلط البروتين بقوة الحل في كوب على الجليد. كرر هذه الخطوة حتى جميع العازلة طوي ثانية والريتينولتضاف. الحفاظ على اثارة رد فعل على الجليد في الظلام لمدة 5 ساعة.
  7. تدور باستمرار رد فعل طوي ثانية في 24000 XG لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 لا بد من إزالة الركام الحق بعد رد فعل طوي ثانية.
  8. التركيز الحل طاف باستخدام Amicon الترا المكثف 15 (MWCO 10 K) إلى حوالي 10 مل. لا تركز على حل refolded أكثر من هذا المستوى. وسوف تركز أكثر من اللازم يؤدي إلى تجميع البروتين ويقلل من المحصول النهائي ونوعية RBP مطوية بشكل صحيح. تمييع عينة مركزة من البرد PBS إلى 100 مل. والغرض من هذه الخطوة هو إزالة المكونات في رد فعل طوي ثانية التي تتداخل مع تنقية النيكل.
  9. تدور حل واحد لمزيد من الوقت في 24000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 من المهم لإزالة أي راسب. نقل طاف لكل منهما 50 مل أنابيب، كل منها يحتوي على 1 مل ني NTA الطين التي تم غسلها مع برنامج تلفزيوني. تدوير أنابيب في C ° 4 لمدة ساعة. تفرخ المخفف و حلأو يمكن أن يتسبب في 1 ساعة هطول الأمطار تتجمع البروتينات التي تحتاج إلى إزالة.
  10. تدور أسفل أنابيب في 500 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف بعناية. يجب إزالة أي شيء عائم. إضافة الباردة PBS إلى 30 مل لكل أنبوب. تدور مرة أخرى وإزالة طاف. كرر هذه العملية حتى ترى سوى الخرز في الأنبوب.
  11. نقل الراتنج ني NTA لعمود فارغ. غسل الراتنج مع وحدات التخزين العمود 20 من إيميدازول 10 مم، 500 ملي كلوريد الصوديوم في برنامج تلفزيوني. أزل صاحب-RBP في حجم العمود 5 من الاميدازول 100 ملم في برنامج تلفزيوني. لا تقم بتخزين هذا الحل لفترة طويلة من الزمن، وتجميد يقلل العائد النهائي والجودة. للحصول على أفضل نتيجة، تنقية RBP بواسطة HPLC على الفور.
  12. Dialyze صاحب-RBP تنقيته من الراتنج ني NTA ضد تريس 25 ملم، ودرجة الحموضة 8.4، و 120 ملي مول كلوريد الصوديوم. ويمكن أيضا أن تستخدم مكثف لتبادل العازلة. واضحة لعينات HPLC بواسطة الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية الحق قبل كل مرة.
  13. تنقية هولو-RBP على HPLC باستخدام أيونتبادل العمود AX-300 من التدرج خطوة كلوريد الصوديوم (220 ملي 12 دقيقة، 360 مم 15 دقيقة، وملي 1000 15 دقيقة) باستخدام 25 مم تريس، ودرجة الحموضة 8.4 والطور المتحرك في 1 مل / دقيقة. مع ارتفاع تركيز كلوريد الصوديوم، يتم تحريرها هولو-RBP بينما صاحب-APO-RBP وتتجمع RBP البقاء منضما إلى عمود (الشكل 1). إذا لم يتم RBP طوي ثانية على النحو الأمثل، تتجمع RBP (مثل تتجمع RBP-I في الشكل 1) يمكن أن تسود إعداد كله.
  14. استرداد مطوية بشكل صحيح هولو-RBP من كسور في ذروة 360 مم كلوريد الصوديوم. ترصد بعناية الشخصي شطف من مطوية بشكل صحيح وتتجمع صاحب-RBP. كلوريد الصوديوم في ملي 1،000، تتجمع معظم ينبغي الإفراج عن صاحب-RBP.
  15. يتم تجميع الكسور التي تحتوي على هولو-RBP، تتركز، ومدال ضد PBS بين عشية وضحاها في C. ° 4 تحقق العائد النهائي والجودة (330 nm/280 نانومتر) من الطيف. يجب أن يكون المنتج بشكل صحيح مطوية A 330 نانومتر nm/280 نسبة من أعلى قليلا من 1 (الشكل 1).
  16. لالمنتجه APO-RBP، إضافة حجم مساو من هيبتان إلى تنقية هولو-RBP وتخلط بلطف عن طريق تناوب بين عشية وضحاها في C. ° 4 الطرد المركزي في 16000 ز لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و نقل بعناية مرحلة القاع المائية إلى أنبوب جديد (تجنب الراسب في واجهة). تكرار هذه العملية ثلاث مرات مع الحضانة 3 لكل ساعة. تحقق امتصاص الطيف على Nanodrop للتأكد من ذروة 330 نانومتر قد انخفض إلى مستوى الخلفية.

2. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة الإصدار الريتينول الريتينول وتحميل

  1. منع سوداء جيدا 96-Microfluor-2 لوحة (الحرارية العلمية) مع 200 ميكرولتر من الكازين مانع (بيرس) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع الالتصاق غير محدد من هولو-RBP إلى البلاستيك. مانع الكازين يعطي تأثير أفضل من عرقلة الحلول حجب تم اختبار جميع.
  2. تغسل الأغشية الطازجة من الخلايا أو الخلايا معربا عن STRA6 سيطرة على استخدام PBS ومرت حقنة هاميلتون (GastiGHT # 1710) 6 مرات لإنتاج موحدة في التعليق PBS. ونحن عادة استخدام الأغشية المستمدة من 100/1 إلى 1/20 من الخلايا نمت على طبق مم 100 في رد الفعل.
  3. غسل الآبار المغلفة من لوحة Microfluor-2 مرة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تبرد لوحة على الجليد قبل إضافة التعليق غشاء (50 ميكرولتر لكل بئر).
  4. يتم قياس الحقيقي في الوقت الحقيقي رصد مضان الريتينول باستخدام البصريات مضان من أوميغا POLARstar (BMG LABTECH) مع 320ex الإثارة تصفية وتصفية الانبعاثات 460-10. يتم تعيين البرنامج إلى نقطة النهاية وضع القراءة. ويمكن أيضا وضع لوحة استخدامها لقياس دورة الوقت إذا لم تختلف الفواصل الزمنية. الإشارة من كل نقطة في الساعة بمعدل 10 قياسات (في المتوسط ​​المدارية التي يبلغ قطرها 2 ملم) ويتم تعيين مكسب في 1،800. تهتز لوحة لمدة 10 ثانية في 500 دورة في الدقيقة باستخدام نقرا مزدوجا المدارية الهز قبل كل قياس.
  5. لبدء الفحص الإفراج الريتينول، وقراءة الآبار مرة واحدة باستخدام نقطة النهاية قراءة ميضاف قصيدة قبل هولو-RBP (تركيز عادة ميكرومتر 1 انتهاء) في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة هولو-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر كل 5-10 دقيقة للساعة 1-3. لبدء الفحص التحميل الريتينول، جميع العابر الريتينول (عادة 1 ميكرومتر تركيز النهائي) يضاف إلى الآبار تحت ضوء أحمر خافت. للقراءة مرة واحدة لوحة قبل إضافة APO-RBP في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة APO-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر كل 5-10 دقيقة للساعة 1-3.
  6. بعد الانتهاء من جميع القياسات، تحميل البيانات الخام (على سبيل المثال هو موضح في الشكل 2) من تحليل البيانات البرمجيات أوميغا (BMG LABTECH) إلى Microsoft Excel لتحليل البيانات. كل نقطة زمنية بإنشاء ملف الذي يحتوي على القراءات لجميع الظروف التجريبية. على سبيل المثال، إذا كان هناك نقاط زمنية 20، 20 ملف إلى تعزيز ملف Excel واحدة لتحليل البيانات.
  7. لتحليل البيانات، تعتبر الإشارات مضان قبل إضافة الريتينول أو هولو RBP-0 دقيقة في الخلفية والإشاراتطرح د من إشارات مضان النهائي في جميع نقاط الوقت. على الرغم من انخفاض مقارنة الإشارات الخلفية لمضان الريتينول في هولو-RBP، طرح خلفية يلغي تأثير غير محدد من تشتت الضوء بواسطة الأغشية ويجعل من الممكن للتركيز على الريتينول مضان من هولو-RBP أو الريتينول وأضاف في 0 دقيقة.

3. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة النقل من الريتينول من هولو-RBP لCRBP-I

  1. الريتينول-EGFP هو جديد بالرنين نقل مضان (الحنق) الزوج أنه قد تم مؤخرا تأسيس 41. STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I رصد في الوقت الحقيقي وذلك عن طريق قياس الريتينول-EGFP الحنق. ويتم إنتاج EGFP-CRBP-I البروتين الانصهار مع البطاقات 6XHis (EGFP-CRBP-I) في خلايا الثدييات ويتم تنقيته في ني NTA الراتنج قبل التجربة. ويمكن تخزين EGFP-CRBP-I في برنامج تلفزيوني مع مثبطات الأنزيم البروتيني لفترة قصيرة من الزمن في C. ° 4 وبدلا من الانصهار البروتين طق المجمدة في -80 درجة مئوية في مأخوذة الصغيرة.
  2. قبل ردود الفعل، وإعداد منعت Microfluor-2 لوحة والأغشية كما هو موضح أعلاه. غسل الآبار المغلفة من لوحة Microfluor-2 مرة مع 200 ميكرولتر PBS قبل إضافة التعليق غشاء (50 ميكرولتر لكل بئر).
  3. يتم قياس الوقت الحقيقي الريتينول-EGFP الحنق باستخدام POLARstar أوميغا مع 320ex الإثارة تصفية والمرشحات الانبعاثات 460-10 510-10 والخاص في وقت واحد مبارزة الانبعاثات مضان البصريات. يتم تعيين البرنامج إلى نقطة النهاية وضع القراءة. ويمكن أيضا وضع لوحة استخدامها لقياس دورة الوقت إذا لم تختلف الفواصل الزمنية. الإشارة من كل نقطة في الساعة بمعدل 10 قياسات (في المتوسط ​​المدارية التي يبلغ قطرها 2 ملم) ويتم تعيين مكسب لكل قناة عند 1،800. تهتز لوحة لمدة 10 ثانية في 500 دورة في الدقيقة باستخدام نقرا مزدوجا المدارية الهز قبل كل قياس.
  4. لبدء التفاعلات، EGFP-CRBP-I (عادة 1 ميكرومتر تركيز النهائي) يضاف إلى الآبار. للقراءة على لوحةيضاف CE باستخدام وضع نقطة النهاية قبل القراءة هولو-RBP في 0 دقيقة. حالما يتم إضافة هولو-RBP، ويتم رصد رد فعل مستمر عن طريق قياس كل 5-10 دقيقة للساعة 1-2.
  5. بعد الانتهاء من جميع القياسات، تحميل البيانات الخام (على سبيل المثال هو موضح في الشكل 3) من برنامج تحليل أوميغا البيانات إلى Microsoft Excel لتحليل البيانات كما هو موضح أعلاه.
  6. الريتينول-EGFP الحنق يمثل الفرق الناتج عن دينامية التغيير في نسبة الانبعاثات من قمم متقبل / المانحة 47. المعادلة من 41 إلى حساب هذه النسبة [(510 ر -510 ب) / (460 ر -460 ب)]، حيث 510 ر، ب 510، ر 460، وب 460 تمثل الانبعاثات بنحو 510 نانومتر بعد الشروع في رد فعل ( ر = الوقت نقطة)، بنحو 510 نانومتر قبل الريتينول أو هولو RBP-يضاف (ب = الخلفية) حيث بلغت 460 نانومتر بعد الشروع في رد فعل (ر = نقطة زمنية)، وبلغت 460 نانومتر قبل الريتينول أو هولو RBP المضافة و (ب = الخلفية)، على التوالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نقدم نتائج ممثلة هنا للهولو-RBP إنتاج وتنقية من قبل HPLC (الشكل 1)، في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة الإفراج الريتينول من هولو-RBP وتحميل الريتينول إلى APO-RBP (الشكل 2) في الوقت الحقيقي وتحليل STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I (الشكل 3).

دون طوي ثانية، أنتجت RBP في البكتيريا وتتجمع تقريبا تماما بسبب وجود العديد من السندات ثاني كبريتيد غير صحيحة. ولذلك، طوي ثانية في وجود الريتينول يجند من الأهمية بمكان في الحصول على مطوية جيدا RBP. وجدنا أنه إذا لم يتم رد الفعل بشكل صحيح طوي ثانية، تتجمع الأنواع RBP (مثل تتجمع RBP-I في الشكل 1) يمكن أن تسود إعداد كله والعائد ذات جودة عالية هولو-RBP يمكن أن تكون منخفضة جدا بعد تنقية HPLC. ولذلك، يمكن تصحيح HPLC لا مشكلة طوي ثانية الفقراء. كما هو مبين في (الشكل 1). على الرغم من أن تتجمع جزئيا RBP يربط تزال الريتينول، مجمع الريتينول / RBP هو أقل استقرارا، وأكثر RBP بسهولة النشرات ملزمة الريتينول. تتجمع RBP يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات غير صحيحة من الممارسات التجارية التقييدية أو التجارب فيتامين A-ذات الصلة. وثمة فرق آخر بين RBP مطوية بشكل صحيح وتتجمع RBP هو أن مطوية بشكل صحيح هولو-RBP مستقرة لسنوات في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني. إذا كانهولو-RBP إعداد وتتجمع التلوث RBP، وغير قابلة للذوبان المواد الظهور بعد فترة من التخزين. ويمكن ملاحظة مواد غير قابلة للذوبان بعد الغزل أسفل الحل بسرعة عالية في C. ° 4 ويتم إنتاج سوى APO-RBP عالية الجودة من هولو-RBP.

مرة واحدة تنقية عالية الجودة هولو-RBP أو APO RBP-IS المتاحة، يمكن استخدامه لدراسة STRA6 المحفزة الريتينول النقل. كل من الإفراج الريتينول في الوقت الحقيقي وفحص الريتينول فحص التحميل تعتمد على رصد الريتينول مضان. مصدر واحد للتراجع الاصطناعي من مضان الريتينول هو ملزم غير محددة من الممارسات التجارية التقييدية إلى الطبق البلاستيك (مرة واحدة لا بد RBP إلى الجدار البلاستيك، ويمكن لم يعد من الممكن قياسها في الحل). لقد اختبرنا العديد من الظروف ووجد أن منع حظر الكازين (بيرس) هو الأكثر فعالية في الحد من هذا التدهور غير محددة ومستقلة من مستقبلات فيتامين مضان. مصدر آخر من الانخفاض الاصطناعي من مضان الريتينول هو نوعية رديئة من الممارسات التجارية التقييدية، كما نوقشأعلاه.

STRA6 المحفزة الريتينول الإفراج عنهم، الريتينول التحميل والنقل الريتينول هي أحداث بطيئة نسبيا، كما هو مبين في البيانات ممثل في أرقام 2 و 3. ردود فعل بطيئة نسبيا لأن كل RBP يربط جزيء واحد فقط من فيتامين A وجميع التفاعلات المحفزة STRA6 تعتمد على ربط كل من والتفكك RBP RBP للمتابعة. لSTRA6 المحفزة الإفراج الريتينول رد فعل على الاستمرار، يمكن هولو-RBP يلزم إلا بعد APO-RBP تنأى. لSTRA6 حفز رد فعل على مواصلة التحميل الريتينول، يمكن APO-RBP يلزم إلا بعد هولو-RBP تنأى. لجميع تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي وصفها هنا، وجدنا أن وتيرة القياس المثالي هو واحد قياس كل 5 دقائق أو 10 دقيقة. على الرغم من أن قياسات أكثر تواترا يمكن أن تخلق دقة أعلى الزمنية، فإن الناتج ملفات البيانات تكون كبيرة للغاية لأن كل نقطة زمنية بإنشاء ملف إكسل.

الشكل 1 خيمة ذات العرض = "5.5in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" SRC = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
الشكل 1. تنقية refolded RBP على HPLC للحصول على هولو-RBP 100٪ محملة الريتينول. refolded النيكل الراتنج المنقى يتم تطبيق الممارسات التجارية التقييدية إلى العمود التبادل الأيوني AX-300 من التدرج خطوة كلوريد الصوديوم (220 ملي 10 دقيقة، 360 مم 15 دقيقة، وملي 1000 15 دقيقة). يتم تحرير مطوية بشكل صحيح هولو-RBP وصاحب-مزال عند 360 نانومتر كلوريد الصوديوم. أطياف الامتصاص (250 نانومتر-400 نانومتر) من قمم الموافق مطوية بشكل صحيح هولو-RBP، تتجمع RBP-1، تتجمع RBP-2، وتظهر أيضا التلوث (يشار الذروة من البروتين خط عمودي الأزرق ويشار الريتينول الذروة بواسطة خط عمودي أحمر). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
الشكل 2. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة تحميل الريتينول إلى APO-RBP والريتينول بيان من هولو-RBP. لعبت هذا الاختبار دورا هاما في الكشف عن ما يمكن أن تفعله STRA6 في حد ذاته دون الانتقال بعيد المدى المحددة أو CRBP-IA مثال على ملف البيانات الخام لتحميل الريتينول STRA6-catalzyed وإطلاق الريتينول كما هو موضح في تحليل البيانات أوميغا البرمجيات. لبدء رد فعل الإفراج الريتينول، يضاف إلى هولو-RBP STRA6 غشاء غشاء أو التحكم في 0 دقيقة. لبدء رد فعل التحميل الريتينول، يضاف إلى الريتينول أو الغشاء غشاء STRA6 تحكم خلط مع APO-RBP في 0 دقيقة. كشفت قياسات مضان لإثارة 320 نانومتر و 460 نانومتر الانبعاثات أثناء الوقت من رد فعل. ردود فعل 1-6 رصد الريتينول التحميل في APO-RBP (1، 3، و 5 STRA6 رد فعل، 2، 4، و 6 ردود الفعل التحكم). ردود الفعل 7 حتي 12 شاشة التحميل الريتينول إلى APO-RBP (7، 9، و 11 STRA6 التفاعل؛ 8، 10، و 12 ردود فعل السيطرة). B. الإشارات النهائية تحسب لردود الفعل هو مبين في A. تم احتساب الرسم البياني اليسار على أساس ردود الفعل 1 إلى 6. تم حساب الرسم البياني يعتمد على ردود الفعل الحق 7 إلى 12. يتم تعريف إشارة مضان أعلى ك 1 في الرسم البياني الأيسر. وأضاف مضان من هولو-RBP في 0 دقيقة ويعرف ك 1 في الرسم البياني الصحيح. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. في الوقت الحقيقي رصد STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى IA-CRBP مثال على ملف البيانات الخام التي تراقب الحنق بين الريتينول وEGFP كما هو موضح في تحليل البيانات أوميغا البرمجيات. في 0 دقيقة، يتم إضافة هولو-RBP لردود الفعل التي تحتوي على الغشاء STRA6 (ردود الفعل 1، 3، و 5) أو غشاء التحكم مع EGFP-CRBP-I لبدء التفاعلات (تفاعلات 2 و 4 و 6). كشفت في وقت واحد قياسات الانبعاثات مبارزة لإثارة 320 نانومتر في تتبع مسار الأخضر الانبعاثات الوقت 460-10 والتتبع والأزرق مسار الانبعاثات الوقت 510-10. باء النهائية تحسب الحنق إشارة لردود الفعل هو مبين في A. والحنق وحسبت وفقا لإشارات الطرق في الخطوة 3.6. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا لتبادل الإنتاج RBP الأمثل لبروتوكول RBP إنتاج وتنقية الإجراءات الحاسمة لتوليد RBP مطوية بشكل صحيح. نظرا لإمكانية الأنواع RBP تتجمع وجود كميات ضئيلة من البروتينات البكتيرية حتى في HPLC تنقية البكتيريا المنتجة RBP، فمن المفيد استخدام الممارسات التجارية التقييدية الأصلية من المصل لتأكيد استنتاج المتعلقة RBP. RBP البول، والذي يتوفر تجاريا، هو خليط معقد من الأنواع بما في ذلك العديد من الممارسات التجارية التقييدية APO-RBP وهولو-RBP 48،49.

تستند تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي وصفها هنا على مضان لا يتجزأ من الريتينول. كان الدافع الأصلي لتطوير هذه المقايسات التي كانت تقتصر من قبل ونحن على المعلومات التي يمكن أن يكشف عنها المقايسات المشعة الكلاسيكية والمقايسات HPLC مقرا لها. على سبيل المثال، وجدنا أن لديه STRA6 فيتامين A القليل النشاط في حد ذاته امتصاص فيتامين في المقايسات امتصاص A، ولكننا لا يمكن أن يفسر بسهولة قليلة النشاط من STRA6 في امتصاص فيتامين A أو دون الانتقال بعيد المدى المحددة CRBP-I 41. في retinyl في المقايسات استر على أساس، فمن السهل أن نفهم أن STRA6 في حد ذاته لا يجعل استر retinyl لأن STRA6 ليس له نشاط الانزيم الذي الانتقال بعيد المدى المحددة. ومع ذلك، حتى في الريتينول القائم على المقايسات، لا يزال النشاط STRA6 القليل من تلقاء نفسه. لا يوجد اي STRA6 فيتامين A امتصاص النشاط على الإطلاق؟ إذا لم يحدث ذلك، كيف يمكن CRBP-I أو الانتقال بعيد المدى المحددة تسريع نشاطها؟ إذا كان كذلك، فما حاجتها لCRBP-I أو الانتقال بعيد المدى المحددة؟ على الرغم من المقايسات المشعة ومقرها المقايسات HPLC لم الإجابة على هذه الأسئلة، ونحن مسبب أن STRA6 ينبغي لديها القدرة على اطلاق سراح الريتينول من الممارسات التجارية التقييدية. نحن مسبب أيضا أن مقايسة مضان الريتينول قد تكشف هذا النشاط. جعلت الريتينول مضان من الممكن قياس لدراسة حركة الريتينول الحرة في خلايا مستقبلة للضوء ضوء الفقاريات بعد التبييض للأصباغ بصرية في الوقت الحقيقي 50،51. كيف يمكن مراقبة الممارسات التجارية التقييدية من خلال قياس نشاط مستقبلات فيتامين مضان؟ اكتشف في عامفي وقت مبكر 1970s من قبل مجموعات بحثية اللذين عززت بشكل كبير الريتينول مضان عندما يتجهون إلى RBP 52،53. وجدنا أن STRA6 المحفزة الريتينول بيان من هولو-RBP يؤدي إلى انخفاض في مضان الريتينول، في حين STRA6 المحفزة تحميل الريتينول إلى APO-RBP يسبب زيادة في مضان الريتينول. على الرغم من استخدام المقايسات المشعة والمقايسات القائمة على نطاق واسع HPLC لدراسة امتصاص فيتامين A، لم المقايسات مضان تستخدم لدراسة نشاط مستقبلات RBP حتى وقت قريب، من المحتمل لأن الأغشية الداخلية تستخدم كمصدر للمستقبلات تحتوى على نسبة عالية جدا مضان الخلفية ويكون خليط معقد من البروتينات ملزمة ريتينويد / الانزيمات التي تجعل من الصعب تفسير مساهمة كل البروتين. الأدوات المتاحة حاليا الحساسة أيضا ما جعل هذه التقنيات أكثر جدوى. بالإضافة إلى توجيه قياس مضان، الجديد الريتينول-EGFP الحنق زوج في وقت واحد إلى جانب 41 البصريات الانبعاثات مبارزةيجعل من الممكن لدراسة النقل الريتينول الريتينول إلى البروتينات ملزمة في الوقت الحقيقي، وردود الفعل في نفس الوقت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 71، البيولوجيا الجزيئية، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، طب العيون، البروتيوميات، والبروتينات، وبروتينات النقل عبر الأغشية، وفيتامين A، ريتينويد، RBP معقدة، غشاء النقل، مستقبلات الغشاء، STRA6، الريتينول بروتين ملزمة
في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter