Summary
在这里，我们描述了一个优化的技术，生产高品质的维生素A / RBP复杂的和实时监测技术研究维生素A运输STRA6，RBP受体。
Abstract
维生素A是必不可少的眼光和几乎所有的人体器官的生长/分化的。血浆视黄醇结合蛋白（RBP）的原则和具体的载体在血液中的维生素A。在这里，我们描述了一个优化的技术，生产和净化的holo-RBP和两个实时监测技术的研究维生素A高亲和力RBP受体STRA6的运输。第一种技术使得有可能产生大量的高品质的holo-RBP（100％-加载与视黄醇），维生素A运送检测。高品质的RBP功能分析是必不可少的，因为错误折叠的RBP版本维生素容易和细菌的污染在RBP准备的产生伪影。实时监控技术，如电的细胞膜传输方面的研究作出了重要的贡献。 RBP受体介导的视黄醇运输实时分析，直到最近。这里所描述的第二个技术是意图分析L-STRA6催化视黄醇释放或装载。第三种方法是STRA6催化视黄醇运输全息-RBP细胞视黄醇结合蛋白I（CRBP-I）的实时分析。这些技术提供了高灵敏度和分辨率，揭示RBP受体的维生素A的吸收机制。
Introduction
维生素A是一种有机分子，是人类生存和几乎所有的人体器官的正常运作至关重要。维生素A衍生物（视黄醇）参与不同的生物化学和细胞的活动，包括光检测视力1,2和调节胚胎发育过程中的基因表达和蛋白质的翻译和成人组织3-6。虽然维生素A有能力扩散全身，演变与血浆视黄醇结合蛋白，一个特定的载体蛋白，维生素在血液中的运输，以实现高效率和特异性，以避免毒性与随机扩散7-10。高亲和力受体结合的限制性商业惯例，并采取了维生素A的假设在20世纪70年代11-13。尽管RBP受体的存在14-31的三十年中积累的证据，受体假说争论多年的existence的全息-RBP一个不正确的定义。全息-RBP的正确定义是，它是维生素A和RBP高亲和1:1的复合物之间。重复提取的holo-RBP由有机溶剂是必要的产生的apo-RBP。这个定义所使用的几乎所有的实验室研究RBP的7,9,32-35或在RBP受体14-31,36-42。全息-RBP被用来反驳的RBP受体的存在是不正确的定义与APO-RBP的急性的免费视黄醇的混合物。由于RBP受体的功能的维生素A吸收全息-RBP-RBP全息释放视黄醇，RBP受体不发挥作用，在视黄醇摄入维生素A是开始（所提出的不正确的定义全息RBP）。
最近的研究发现RBP受体作为一个multitransmembrane的结构域蛋白称为STRA636和其功能的维生素A吸收从全息-RBP 36-43强烈反对的假设，即RBP不需要的受体提供维生素A的详细分析表明STRA6有9个跨膜结构域与位于细胞外的N-末端和C-末端位于细胞内40。位于跨膜6和图7之间是一个必不可少的RBP结合结构域39。 STRA6耦合都LRAT和CRBP-I中的维生素A吸收全息-RBP，但既不是LRAT也不是CRBP-I是绝对必要的，增强了STRA6活动41。 STRA6的能力，以促进维生素A的holo-RBP释放的关键是维生素A的吸收活动41。通过依靠STRA6释放其视黄醇，维生素A交付RBP可以运输维生素A的外周组织中的靶细胞，以高特异性和高效率。
RBP受体的存在，不仅历史辩论至关重要的holo-RBP的定义和准备说明，但最近三个相关的论文的基础上的holo-RBP定义不同ferent从原来的和正确的定义44-46。第一篇论文使用的holo-RBP定义被用来否决RBP受体的存在，研究RBP受体44。第二次和第三次的论文想出的holo-RBP与三分之一的定义，使得它更可能为视黄醇的研究，以形成适当的配合物与RBP 45,46。这些编写的研究报告3 H-retinol/RBP由混合的holo-RBP（APO-RBP），用3 H-视黄醇。由于该试验中没有3 H-retinol/RBP形成的，并没有除去过量的游离的3 H-视黄醇45,46，它是不测定3 H-视黄醇的吸收来自3 H-retinol/RBP，但是一个免费的的3 H-视黄醇扩散法。它已被证明先前STRA6不增强细胞摄取的免费视黄醇由38或LRAT CRBP-I 41。几乎所有的视黄醇被绑定到血液中的限制性商业惯例和有没有可检测频率Ë视黄醇。 RBP受体的主要功能是促进维生素A的释放维生素A摄取的holo-RBP在全息-RBP 41。如果人工释放或视黄醇是游离形式与45,46开始，RBP受体是不需要的。获得免费的视黄醇扩散法相比，分析的基础上正确处理的holo-RBP说明，正确的准备RBP显着不同的结果，它的功能分析是至关重要的。
RBP可以41从人血清中纯化的，但是该过程是复杂的和产率是低的。另一种方法是在大肠杆菌中产生RBP 大肠杆菌。因为E.大肠杆菌不正确折叠与多于一对RBP二硫键，如哺乳动物的分泌蛋白的能力，它是必不可少的正确折叠的蛋白质再折叠限制性商业惯例和纯化。错误折叠的蛋白质不仅有不同的行为矫正折叠RBP在不同的检测，但也导致蛋白质聚集在储存过程中。出于同样的原因，APO-RBP只生产高品质的holo-RBP。我们在这里介绍一种优化方案，以生产高品质的RBP与视黄醇通过细菌表达，复性和高效液相色谱（HPLC）分离，100％负载。高效液相色谱（HPLC）分离，不仅能消除错误折叠的RBP，但也明显受到细菌污染，可能会导致严重的文物，如果RBP使用的信号转导实验。我们还描述了两个敏感的实时监测技术研究视黄醇的运输STRA6。这两种技术都依赖于高品质的RBP。由于空间的限制，放射性维甲酸和HPLC-维生素A吸收分析的经典方法是没有描述在这里。
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Protocol
1。生产，复性，HPLC纯化全新RBP
- 的pET3a载体，6X His标签上的N-末端的cDNA为人类RBP变换的BL-21cells与。生长转化BL-21细胞在40ml与羧苄青霉素的LB培养基在37℃下摇床直到OD在600nm处达到0.5。诱导RBP蛋白表达加入IPTG至1mm。长出的细菌在37℃下另外5小时。
- RBP在大肠杆菌中产生的主要是存在于包涵体。为了丰富包涵体在10,000 xg离心20分钟，沉淀细胞。然后超声处理的细胞在5毫升的PBS在冰上与蛋白酶抑制剂，接着通过2个循环的冷冻和解冻。佩莱上下包涵体在20,000 xg离心30分钟，在4℃下去除上清液，并保持在冰上沉淀。
- 通过超声处理在10毫升7.5 M盐酸胍溶解包涵体颗粒。加入一半的体积（5毫升）的25mM的Tris缓冲液，pH值9.0和DTT到最后的C臭氧浓度的的10mM。大力混合溶液在室温下过夜，充分减少和蛋白质变性在旋涡混合器。
- 离心的蛋白质溶液，在4℃下18,000 xg离心20分钟以除去不溶性物质分拆后，将上清转移到新的试管中，并在冰上放置管。
- 准备四个卷（60毫升）的重折叠缓冲液中（25毫摩尔Tris，pH为9.0，0.3 mM的胱氨酸，3.0 mM的半胱氨酸，1mM EDTA中）。德加的复性缓冲液。还要准备600微升10毫米的视黄醇，乙醇在昏暗的红灯。保持在黑暗中冰。的复性缓冲液和维生素A的解决方案都需要新鲜的准备。
- 冷却的蛋白质溶液，至少30分钟的重折叠缓冲液在冰上。较高的温度可能会降低复性RBP的质量。加入1毫升的重折叠缓冲液中滴加和10μl的视黄醇，而蛋白质溶液在冰上在烧杯中剧烈混合溶液中依次。重复此步骤，直到所有的复性缓冲液和维生素A被添加。继续搅拌反应5小时，在黑暗中在冰上。
- 自旋向下折叠反应在24000×g离心30分钟，在4°C。它是必不可少的，以去除聚集体后，复性反应。
- 浓缩上清液使用Amicon Ultra 15集中器（MWCO 10 K）的溶液至约10毫升。不要集中复性的解决方案超过这个水平。集中过多会导致蛋白质聚集和降低最终产量和质量的正确折叠的RBP。稀释浓缩的样品用冷PBS至100 ml。此步骤的目的是在复性的反应干扰镍纯化以删除组件。
- 附带一个更多的时间在该溶液在4℃下24,000 xg离心20分钟重要的是要除去任何沉淀物。将上清转移至两个50ml试管，每片含1毫升的Ni-NTA，已用PBS洗涤浆料。一小时，在4℃下旋转管。孵化稀释后的溶液F或1小时，可能会导致需要被删除的错折叠蛋白的沉淀。
- 旋转管500 xg离心3分钟。仔细收集上清“。任何浮动应该被删除。冷PBS每管30毫升。再次离心，并除去上清液。重复这个过程，直到你什么也看不到，但珠管。
- Ni-NTA树脂转移到一个空的列。的树脂用20倍柱体积的10mM咪唑，500mM NaCl的在PBS中清洗。洗脱的His-RBP 5倍柱体积的100mM咪唑的PBS中。不要将本溶液在较长的一段时间内，冷冻时间最终的产量和品质。为了最好的结果，净化RBP立即高效液相色谱法。
- 透析的His-RBP从反对的25mM Tris，pH值8.4，和120mM氯化钠的Ni-NTA树脂纯化。甲集中器也可以用于缓冲液交换。离心16,000 xg离心10分钟，在4°C在每次运行前，清除样品的HPLC。
- 使用离子净化全息-RBP HPLC交换柱AX-300通过使用作为在1毫升/分钟的流动相的pH值为8.4的25mM Tris，分步梯度的NaCl（220 mM的12分钟，360毫15分钟，和1,000 mM的15分钟）。随着NaCl浓度的升高，全息-HIS-RBP被释放，而Apo-RBP，错误折叠的RBP留绑定列（ 图1）。如果还没有做最佳RBP重折叠，错误折叠的RBP（ 例如，错误折叠的RBP-I在图1）可以在整个制剂中占主导地位。
- 恢复正确折叠的holo-RBP从高峰分数在360毫米氯化钠。小心地监视正确的折叠和错误折叠的RBP的洗脱曲线。于1000毫米的NaCl，大多数的错误折叠的RBP应该被释放。
- 含有的holo-RBP的馏分被汇集，浓缩，并在4℃下对PBS透析过夜检查的最终产量和质量（330 nm/280纳米）由分光光度计。正确折叠的产品应具有330 nm/280 nm的比率稍微高于1（图 1）。
- 为了生产ËAPO-RBP，加等体积的正庚烷的纯化的holo-RBP，轻轻混匀，旋转过夜后，于4℃离心10分钟，在4℃，并小心地16000克的底部的水相转移到新的试管（避免沉淀物的界面处）。重复该过程三次，为每个与孵育3小时。检查，以确保在330 nm处的峰值下降到本底水平上的NanoDrop分光光度计的吸收。
2。实时监控的STRA6催化视黄醇发行和视黄醇装载的
- 座的黑色96孔显微荧光-2板（Thermo Scientific的）用200μl的拦截器，酪蛋白（Pierce公司）过夜，在4℃，以防止非特异性的holo-RBP粘附到塑料。酪蛋白拦截器的所有阻塞的解决方案，我们测试给出了最好的阻断作用。
- 表达STRA6或控制细胞的细胞从新鲜制备的膜用PBS洗涤，并通过微量注射器（GastiGHT＃1710）的6倍，以产生均匀的悬浮液在PBS中。我们通常使用来自于1/100〜1/20的每个反应的100毫米的培养皿上生长的细胞的膜。
- 洗净一次的显微荧光-2板的包被的孔用200μl的PBS。膜悬浮液（每孔50μl）加入前板置于冰上冷却。
- 实时监控的POLARstar欧米茄（BMG LABTECH）用荧光光学测量视黄醇荧光激发滤光片320ex和发射滤光片460-10。程序设置到端点的阅读模式。板模式也可以被用于测量的时间过程，如果不发生变化的时间间隔。每个时间点的信号是10次测量的平均值（轨道平均具有直径为2毫米）的增益被设定为1800。在500 RPM，使用双轨道的晃动，在每次测量前板振动，持续10秒。
- 要启动的视黄醇的释放试验，井读取一次使用端点读数m颂歌的holo-RBP之前（通常为1最终浓度10μM）0分钟时加入。尽快的holo-RBP被添加时，该反应连续监测每5-10分钟为1-3小时。要启动的视黄醇的的加载测定，全反式视黄醇（通常为1最终浓度10μM）的被添加在昏暗的红色光的孔。读板，一旦，APO-RBP前加0分钟。尽快的apo-RBP被添加时，该反应连续监测每5-10分钟为1-3小时。
- 完成所有的测量后，下载的原始数据（例如，在图2所示）的的欧米加数据分析软件（BMG LABTECH）到Microsoft Excel进行数据分析。每个时间点生成一个文件，其中包含所有的实验条件下的读数。例如，如果有20个时间点，20个文件合并成一个Excel文件进行数据分析。
- 进行数据分析，添加前的视黄醇或的holo-RBP 0分钟时的荧光信号被认为是背景信号ð减去最终在所有时间点的荧光信号。虽然背景信号比较低荧光的holo-RBP视黄醇，减去背景消除膜的非特异性光散射的影响，并使得有可能集中在0分钟添加视黄醇的holo-RBP或视黄醇的荧光。
3。催化STRA6视黄醇运输的实时监控，从全息-RBP CRBP-I
- 视黄醇-EGFP的是一个新的荧光共振转移（FRET），最近已经建立的对41。从全息-RBP的STRA6催化视黄醇运输EGFP-CRBP-I实时监控，测量视黄醇-EGFP的荧光共振能量转移。与，6xHis标签（EGFP-CRBP-Ⅰ）的EGFP-CRBP-I融合蛋白在哺乳动物细胞中产生的中和实验前的Ni-NTA树脂纯化。 EGFP-CRBP-I可以被存储在一个短的时间内与蛋白酶抑制剂的PBS在4℃下另外，融合蛋白I的冰冻在-80°C的小样品。
- 在反应之前，准备被阻止的显微荧光-2板和膜如上所述。洗净一次的显微荧光-2板的包被的孔用200μlPBS中，然后加入的膜悬浮液（每孔50μl）。
- 的实时视黄醇-EGFP荧光共振能量转移的320ex激发滤光片和排放过滤器460-10和510-10使用POLARstar欧米茄同时决斗发射荧光光学测量。程序设置到端点的阅读模式。板模式也可以被用于测量的时间过程，如果不发生变化的时间间隔。每个时间点的信号是10次测量的平均值（轨道平均具有直径为2毫米）的增益被设置为在1,800每通道。在500 RPM，使用双轨道的晃动，在每次测量前板振动，持续10秒。
- 为了启动反应，EGFP-CRBP-I（通常为1最终浓度10μM）加入到孔中。读板CE使用端点的阅读模式之前的holo-RBP加0分。尽快的holo-RBP被添加，将反应连续监测通过测量每5-10分钟1-2小时。
- 所有测量完成后，下载从欧米茄数据分析软件中的原始数据（例如， 图3中所示）到Microsoft Excel如上所述进行数据分析。
- 视黄醇-EGFP FRET的计算方法是在比受主/施主发射峰47的动态变化。的等式41来计算这个比例是[（510吨-510）/（-460460吨b）〕，其中460吨510吨，510 B，和460 B代表在510 nm处的排放量，在反应开始后（吨=时间点），视黄醇或前的holo-RBP在510 nm处被添加（β=背景），在460nm处的反应开始后（t =时间点），和视黄醇或的holo-RBP前在460nm处被添加（B =背景）。
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Representative Results
我们目前在这里代表的holo-RBP生产和净化高效液相色谱法（ 图1），视黄醇STRA6催化释放的holo-RBP和维生素A装到APO-RBP（ 图2）和实时分析的实时分析结果STRA6催化视黄醇运输全息-RBP EGFP-CRBP-I（ 图3）。
没有重折叠，RBP在细菌中产生的几乎完全是由于存在许多不正确的二硫键错折叠。因此，复性的配位体的存在下，视黄醇中是极为重要的，在获得良好的折叠RBP。我们发现，如果没有正确完成的复性反应，错误折叠的RBP物种（ 例如，错误折叠的RBP-I在图1）可以在整个制剂和产率的高品质的holo-RBP可以非常低，在HPLC纯化后中占主导地位。因此，高效液相色谱仪不能正确复性差的问题。所示
一旦纯化的高品质的holo-RBP或载脂蛋白-RBP是可用的，它可用于以研究STRA6催化视黄醇运输。实时视黄醇释放测定和视黄醇加载测定取决于监测视黄醇荧光。人工视黄醇荧光下降的来源之一是RBP的塑料培养皿（一次RBP被绑定到的塑料壁，它可以不再被测量在溶液中）的非特异性结合。我们已经测试了许多封闭条件和拦截器酪蛋白（皮尔斯）是最有效的减少这种非特异性和受体依赖性视黄醇荧光下降，。视黄醇荧光人工下降的另一个来源是质量差的RBP，讨论以上。
STRA6催化的视黄醇，视黄醇加载和视黄醇运输释放是相对缓慢的事件，如在图2和图3中所示的有代表性的数据。的反应是比较慢的，因为每个的RBP只绑定一个分子的维生素A和所有STRA6催化反应依赖于RBP绑定和RBP解离继续。对于STRA6催化视黄醇的释放反应继续下去，全息-RBP只能绑定在APO-RBP分解后。对于STRA6催化视黄醇装载反应继续下去，APO-RBP只能绑定后全息-RBP分解。对于所有的实时监控这里描述的技术中，我们发现，理想的频率的测量是测量每5分钟或10分钟。虽然更频繁的测量，可创造较高的时间分辨率，得到的数据文件将是非常大的，因为每个时间点上创建一个Excel文件。
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图1纯化 ，复性RBP高效液相色谱法获得的holo-RBP与视黄醇100％负载。镍树脂纯化重折叠RBP步梯度的NaCl（220 mM的10分钟，360毫15分钟，和1,000 mM的15分钟）被施加到AX-300离子交换柱。正确折叠的全息-HIS-RBP被释放，并在360 nm处的NaCl洗脱。为250nm-400nm的吸收光谱（）的峰值相对应的正确折叠的holo-RBP，错误折叠的RBP-1，错误折叠的RBP-2，和污染也示（蛋白质峰由蓝色垂直线表示，和视黄醇峰表示红色垂直线） 点击此处查看大图 。
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图2。实时监控的STRA6催化视黄醇加载到APO-RBP和维生素A的holo-RBP释放。此法发挥了重要的作用，揭示出STRA6可以做的事没有LRAT或CRBP-IA的STRA6 catalzyed视黄醇装载和视黄醇发布的欧米茄数据分析软件的原始数据文件的一个例子。要启动的视黄醇的释放反应，全息-RBP添加到STRA6 0分钟的膜或控制膜。要启动负载反应的视黄醇，视黄醇添加到STRA6的膜或控制膜预混APO-RBP 0分钟。 320 nm激发和460 nm发射的荧光测量，发现在反应过程中的时间。反应1至6个显示器的视黄醇加载到的apo-RBP（1，3，及5是STRA6的反应，2，4，和图6是控制反应）。反应7至12的监视器的视黄醇加载到的apo-RBP（7，9和11是STRA6反应; 8，10，和12是控制反应）。 B.最终的计算反应的信号在A所示的左侧曲线图，计算根据第1〜6的反应。右图计算的反应7至12。最高的荧光信号被定义为1的左侧曲线图。添加荧光全息-RBP被定义为1 0分钟，在右边的图。 点击这里查看大图 。
图3-RBP全息实时监控的STRA6催化视黄醇运输CRBP-IA原始数据文件的一个例子，监控之间的荧光共振能量转移，维生素A和EGFP的欧米茄数据分析软件。的holo-RBP 0分钟时，被添加到含有与EGFP-CRBP STRA6膜（反应1，3和5）或控制膜的反应I至引发反应（反应2，4，和6）。激发波长为320 nm的同时的决斗排放测量显示绿色的跟踪460-10排放的时间过程和蓝色曲线为510-10发射时间过程。 B.计算得到的共振信号的反应A. FRET信号进行计算的方法步骤3.6。 点击这里查看大图 。
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Discussion
我们在这里分享一个优化的RBP生产协议，因为RBP生产和纯化过程是产生正确折叠RBP的关键。由于错误折叠RBP物种和即使在HPLC纯化的细菌产生的RBP的细菌蛋白质的存在下痕量的可能性，它是有帮助使用本机RBP从血清，确认有关RBP的结论。尿RBP，市场上可买到的，是一种复杂的混合物许多种RBP，包括APO-RBP和全息-RBP 48,49。
这里所描述的实时监测技术基础上的自身荧光的视黄醇。这些实验的原始动力，以发展的信息可以揭示经典的放射性检测和高效液相色谱法为基础的检测，我们受到了限制。例如，我们发现，STRA6有一点维生素A吸收的活性维生素A的吸收分析，但我们不能轻易地解释低活性的STRA6的维生素A吸收，没有LRAT或CRBP-I 41。在视黄基酯为基础的检测，很容易明白，STRA6本身不会使视黄酯，因为STRA6是不是一种酶，具有LRAT活性。然而，即使在视黄醇为基础的检测，STRA6仍然具有本身的活性很小。 STRA6有任何维生素A的吸收活动呢？如果没有的话，怎么能CRBP-I或LRAT加速它的活动吗？如果是的话，为什么它需要CRBP-我或LRAT的的吗？ ，虽然放射性检测和高效液相色谱法为基础的检测没有回答这些问题，我们的理由是，STRA6应该有能力从RBP释放视黄醇。我们的理由是，视黄醇荧光分析可能会揭示这一活动。视黄醇的荧光测量使得有可能研究的移动自由视黄醇在脊椎动物感光细胞漂白视色素在实时50,51的光后。 RBP受体的活动进行监视测量视黄醇荧光呢？它被发现于20世纪70年代初，视黄醇，显着提高荧光当绑定到RBP 52,53两个研究小组。我们发现，STRA6催化的视黄醇的释放的holo-RBP导致减少在视黄醇荧光，而STRA6催化的视黄醇的apo-RBP加载到导致增加在视黄醇荧光。虽然放射性检测和高效液相色谱法为基础的检测已被广泛用于研究维生素A的吸收，荧光检测没有被用来研究RBP受体的活动，直到最近，可能因为内源性膜作为源的受体有很高的背景荧光并具有类视黄醇结合蛋白/酶的复杂混合物，这使得它很难解释每个蛋白的贡献。当前可用的灵敏的仪器是什么使这些技术更可行。除了 直接荧光测量，新的视黄醇-EGFP FRET对41同时的决斗发射光学加上使得能够在实时和同时在多个反应研究视黄醇的运输，视黄醇结合蛋白。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由美国国立卫生研究院授予R01EY018144支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| guanidine hydrochloride | EMD | 5010 | |
| cystine | Sigma | C8755 | |
| cysteine | Sigma | C7352 | |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | |
| Tris | Fisher | 7786-1 | |
| DTT | EMD | 3860 | |
| retinol | Sigma | R7632 | |
| carbenicillin | Fisher | BP2648-5 | |
| IPTG | EMD | 5810 | |
| PBS | EMD | 6508 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| Ni-NTA | Qiagen | 1018244 | |
| imidazole | EMD | 5720 | |
| heptane | EMD | HX0295-1 | |
| Blocker Casein | Pierce | 37528 | |
| Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) | Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor-2 plate | Fisher | 14-245-177 | |
| Hamilton syringe Gastight #1710 | Fisher | 14-824-655 |
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