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Biology

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

여기 고품질의 비타민 A / RBP의 복잡하고 STRA6, RBP 수용체가 비타민에게 교통편을 공부하는 두 실시간 모니터링 기술을 생산하는 최적의 기술을 설명합니다.

Abstract

비타민 A는 시력을 위해 필수적이며, 성장 / 거의 모든 인간의 장기 차별화. 플라즈마 레티놀 결합 단백질 (RBP)은 혈액의 원칙과 비타민의 특정 항공사입니다. 우리는 여기 생산하고 고친 화성 RBP 수용체 STRA6에 의한 비타민 A의 전송을 공부하고 홀로 RBP와 두 개의 실시간 모니터링 기술을 정화 할 수있는 최적화 된 기술을 설명합니다. 첫 번째 기술은 가능한 고품질 비타민에 홀로 RBP (100 레티놀과 %로드) A 교통 assays의 대량 생산 할 수 있습니다. RBP 자료 비타민 RBP 준비에 쉽게와 세균 오염 유물을 일으킬 수 misfolded 있기 때문에 우수한 품질의 RBP는 기능 assays를위한 필수적입니다. 전기 생리학 등의 실시간 모니터링 기술은 막 수송의 연구에 중요한 공헌을 만들었습니다. RBP 수용체 - 매개 레티놀 전송은 실시간으로 최근까지 분석되지 않았습니다. 여기에 설명 된 두 번째 기술은 정말이에요이다STRA6 - 촉매 레티놀 자료 나로드의 L-시간 분석. 세 번째 기술은 홀로 RBP에서 세포의 레티놀 결합 단백질 I (CRBP-I)에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송의 실시간 분석이다. 이 기술은 RBP 수용체의 비타민 A 이해 메커니즘을 드러내는 높은 감도와 해상도를 제공합니다.

Introduction

비타민 A는 인간의 생존과 거의 모든 인간의 장기의 적절한 작동을 위해 필수적이며 유기 분자이다. 비타민 A 유도체 (retinoids)는 비전 1,2 및 배아 발달 동안과 성인 조직 3-6 유전자 발현과 단백질 번역 조절을위한 빛의 감지 등 다양한 생화학 및 세포의 행사에 참여하고 있습니다. 레티놀이 체계적으로 확산 할 수있는 능력을 가지고 있지만, 진화는 플라즈마 레티놀 결합 단백질, 비타민 높은 효율성과 특이성을 달성하고 7-10 임의의 확산과 관련된 독성을 피하기 위해 혈액에서 교통에 대한 특정 캐리어 단백질을 세웠 어. RBP에 바인딩과 비타민을 차지 고친 화성 수용체가이 1970 년대 11-13에 가설되었다. RBP 수용체 14-31의 존재에 세 수십 년 동안 축적 된 증거에도 불구하고, 수용체 가설 인해 existenc에 몇 년 동안 논의되었습니다홀로 RBP의 잘못된 정의 5. 홀로 RBP의 올바른 정의는 레티놀과 RBP 사이의 높은 연관성 1:1 복잡한 것입니다. 유기 용매에 의한 홀로 RBP의 반복 추출 APO-RBP를 생성 할 필요가 있습니다. 이 정의는 RBP 7,9,32-35 또는 RBP 수용체 14-31,36-42를 공부 거의 모든 실험실에서 사용됩니다. RBP 수용체의 존재를 증명하는 데 사용 된 홀로 RBP의 잘못된 정의는 APO-RBP 무료로 레티놀의 급성 혼합입니다. 비타민의 RBP 수용체의 기능 때문에 홀로 RBP의 이해는 홀로 RBP의 레티놀을 공개하는 것입니다 레티놀은 (같은 홀로그램의 잘못된 정의에 의해 제안으로 시작하는 무료있는 경우, RBP 수용체는 레티놀 이해에 더 역할을하지 않을 - RBP).

multitransmembrane 도메인 단백질 등의 RBP 수용체의 최근 식별이 STRA636 전화를 비타민에서의 기능은 홀로 RBP 36-43에서 호응을 강력히 RBP하지 않는 가설에 대한 주장STRA6이 intracellularly 40에 위치한 구 transmembrane의 extracellularly있는 N-말단과 도메인과 C-말단를 가지고 계시 비타민 A. 자세한 분석을 제공하는 수용체가 필요합니다. transmembrane 6과 7 사이에 위치한 것은 필수 RBP 구속력을 도메인 39입니다. STRA6는 LRAT과 비타민 홀로 RBP의 이해에 CRBP-I 모두에 커플 링하지만, LRAT도도 CRBP-I는 절대적으로 강화 STRA6 활동을 41 필요합니다.합니다 홀로 RBP에서 레티놀 자료를 catalyze하는 STRA6의 능력은 비타민 A 통풍 관 활동을 41의 핵심입니다. 의 레티놀을 발표 할 STRA6에 의존함으로써, 비타민 RBP의 게재는 비타민 A 높은 특이성과 효율성과 주변 조직의 세포를 타겟팅 할 수송 할 수 있습니다.

홀로 RBP 정의와 준비의 중요한 중요성은 홀로 RBP 정의 DIF에 따라 세 관련 최근 논문으로도 RBP 수용체의 존재에 대한 역사적 논쟁이 아니라 그림이되지만,원본과 올바른 정의 44-46에서 ferent. 첫 번째 논문은 RBP 수용체에게 44 공부를 할 수있는 RBP 수용체의 존재를 승인하는 데 사용 된 홀로 RBP 정의를 사용했습니다. 두 번째 및 세 번째 논문은 훨씬 가능성이 레티놀에 대한 공부를했다 RBP 45,46과 적절한 복잡한을 형성하기 위해 만든 홀로 RBP의 세 번째 정의를 내놓았다. 이 연구는 3 H-레티놀과 함께 홀로 RBP를 (도 못 APO-RBP) 혼합하여 3 H-retinol/RBP을 준비했습니다. 이 분석 3 H-retinol/RBP이 형성되고 과도한 무료 3 H-레티놀 45,46를 제거하지 않은이 없었 때문에, 3 H-retinol/RBP에서 3 H-레티놀의 이해를위한 분석되지는 않지만 무료입니다 3 H-레티놀 확산 분석. 그것은 STRA6이 LRAT 38 또는 CRBP-I 41에서 무료로 레티놀의 세포 이해를 강화하지 않는 이전에 표시되어 있습니다. 거의 모든 레티놀은 혈액에 RBP에 바인딩되며 감지가 fre 없습니다전자 레티놀. RBP 수용체의 주요 기능은 홀로 RBP 41에서 레티놀의 이해 동안 홀로 RBP에서 레티놀 출시를 catalyze하는 것입니다. 레티놀은 인위적으로 발표 또는 45,46로 시작하는 자유 형식에 경우, RBP 수용체가 필요하지 않습니다. 올바르게 홀로 RBP는 RBP의 올바른 준비를 보여주는 준비에 따라 assays에 비해 무료 레티놀 확산 분석에서 얻은 크게 다른 결과는 기능 assays에 대한 중요합니다.

RBP는 인간의 혈청 41에서 정화하지만, 절차는 복잡하고 수율이 낮 될 수 있습니다. 다른 방법은 E.에 RBP을 생산하는 것입니다 대장균. 때문에 E. 대장균이 제대로 RBP 같은 이황화 채권의 하나 이상의 쌍 포유류의 분비 단백질을 접는 할 수있는 능력이 없습니다, 그것은 refold RBP와 올바르게 접혀 단백질을 정화하는 것이 필수적입니다. Misfolded 단백질은 다르게 다양한 assays에서 수정 접힌 RBP에서 동작하지뿐만 아니라, 저장 중 단백질 집계을 유발할 수 있습니다. 같은 이유로, APO-RBP은 높은 품질의 홀로 RBP에서 생산된다. 우리는 고품질의 RBP에게 세균 표현, refolding 및 HPLC 정화를 통해 레티놀과 함께로드 100 %를 생산하려면 여기를 최적화 프로토콜을 설명합니다. HPLC 정화가 잘못 접 RBP뿐만 아니라, RBP는 신호 전달의 assays에 사용하는 경우 심각한 유물을 일으킬 수 있습니다 중요한 세균 오염을 제거뿐만 아니라. 우리는 또한 STRA6으로 레티놀 전송을 공부하는 두 민감한 실시간 모니터링 기술을 설명합니다. 두 기술은 고품질의 RBP에 따라 달라집니다. 공간 제한으로 인해 방사능 retinoid 기반 및 HPLC 기반 비타민의 고전 기법을 이해의 assays는 여기에서 설명하지 않습니다.

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Protocol

1. 홀로 RBP의 생산, Refolding 및 HPLC 정화

  1. pET3a 벡터는 N-말단에 6x 그의 태그로 인간의 RBP에 대한 cDNA를 숨겨와 BL-21cells을 변환 할 수 있습니다. 600 nm의에서 OD까지 carbenicillin 40 ML의 LB 미디어에서 37 ° C에서 흔드는의 변화 BL-21 세포를 성장 0.5에 도달합니다. 1mM에 IPTG를 추가하여 RBP 단백질 식을 유도. 37 박테리아를 성장 ° C 앞으로 5 시간.
  2. E.coli에서 생산 RBP는 불용성 포함 기관의 대부분이 존재합니다. 20 분 10,000 XG에 포함 기관, 펠렛 세포를 풍부하게합니다. 그런 다음 동결 융해의 2주기에 의해 다음 단백 분해 효소 억제제 5 개 ML PBS에서 얼음에 세포를 sonicate. 아래 펠렛 4에 30 분에 20,000 XG에 포함기구 ° C. 표면에 뜨는을 제거하고 얼음에 펠렛을 유지.
  3. 10 ML 7.5 M 구아니딘 히드로 클로라이드의 sonication하여 포함 몸 펠릿을 Solubilize. 최종 C 25 MM 트리스 버퍼, 산도 9.0 및 DTT의 반 볼륨 (5 ML)를 추가10 mm의 oncentration. 힘차게 완전히 줄이고 단백질을 변성을 실온에서 하룻밤 와류 믹서에 솔루션을 섞는다.
  4. 4 ° C.에 20 분 동안 18,000 XG에서 불용성 물질을 제거하는 단백질 솔루션을 원심 분리기 스핀 후 새로운 튜브로 표면에 뜨는 전송과 얼음에 튜브를 놓습니다.
  5. refolding 버퍼 네 개의 볼륨 (60 ML)를 (25 MM 트리스, 산도 9.0, 0.3 MM 시스틴, 3.0 밀리미터 시스테인, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 준비합니다. 가스를 제거하다는 refolding 버퍼. 또한 희미한 붉은 빛 아래에서 에탄올에 600 μl 10 MM의 레티놀을 준비합니다. 얼음의 어둠 속에서 보관하십시오. refolding 버퍼와 레티놀 솔루션을 모두 신선하게 조리 있어야합니다.
  6. 단백질 솔루션과 최소 30 분을위한 얼음에 refolding 버퍼를 모두 진정해. 높은 온도는 가능성이 RBP를 refolded의 품질을 줄일 수 있습니다. 한 ML의 refolding 버퍼 dropwise와 턴 10 μl 레티놀 솔루션 단백질 솔루션은 강력 얼음의 비커에 혼합되는 동안을 추가합니다. 모든 refolding 버퍼와 레티놀 때까지이 단계를 반복합니다추가됩니다. 5 시간의 어둠 속에서 얼음에 반응을 감동하세요.
  7. 4 ° C.에 30 분에 24,000 XG에서 refolding 반응을 스핀 다운 그것은 바로 refolding 반응 후 집계를 제거하는 것이 필수적입니다.
  8. 10 ML에 Amicon 울트라 15 농축기 (MWCO 10 K)를 사용하여 표면에 뜨는 솔루션을 집중. 이 레벨보다 더 refolded 솔루션을 집중하지 마십시오. 너무 많이 집중하는 것은 단백질 집계 될 올바르게 접혀 RBP의 최종 수율과 품질을 낮춰합니다. 차가운 PBS 100 ML에 집중 샘플을 희석. 이 단계의 목적은 니켈 정화에 영향을 refolding 반응에 구성 요소를 제거하는 것입니다.
  9. 4 ° C.에 20 분에 24,000 XG에서 솔루션을 한 번 더 돌려 그것은 어떤 침전물을 제거하는 것이 중요합니다. 이 50 ML 튜브, PBS로 세척 된 각 함유 한 ML 니켈 NTA 슬러리에 표면에 뜨는을 전송합니다. 한 시간 동안 4 ° C에서 튜브를 회전합니다. 희석 솔루션 f를 잠복기가또는 1 시간 제거해야 misfolded 단백질의 강우량을 일으킬 수 있습니다.
  10. 3 분 500 XG에서 튜브를 스핀 다운. 조심스럽게 표면에 뜨는 제거합니다. 아무거나의 부동을 제거해야합니다. 각 튜브 30 ML에서 차가운 PBS를 추가합니다. 다시 돌리고 표면에 뜨는을 제거합니다. 당신이 튜브에 있지만 구슬 아무 것도 보이지 않을 때까지이 과정을 반복합니다.
  11. 빈 항목에 니켈 NTA 수지를 전송합니다. 10 MM 이미 다졸, PBS 500 MM NaCl의 20 열 볼륨과 수지를 씻으십시오. PBS 100 MM 이미 다졸의 5 열 권에 그의-RBP를 Elute. 오랜 기간 동안이 솔루션을 저장하고 냉동은 최종 수율과 품질을 감소하지 마십시오. 최상의 결과를 들어, 즉시 HPLC에 의해 RBP를 정화.
  12. 25 MM 트리스, 산도 8.4, 120 MM NaCl에 대한 니켈 NTA 수지에서 정화 그의-RBP를 Dialyze. 농축기는 버퍼 교환에 사용할 수 있습니다. ° C 오른쪽 각 실행하기 전에 4에 10 분에 16,000 XG에서 원심 분리하여 HPLC 용 클리어 샘플.
  13. 이온을 사용하여 HPLC에 홀로 RBP 정화교환 한 ML / 분에서 모바일 위상은 25 MM 트리스, 산도 8.4을 사용하여 NaCl 단계 기울기 (220 MM 12 분, 360 MM 15 분, 1,000 MM 15 분)에 의한 열 AX-300. NaCl 농도가 상승함에 따라 홀로 그 .. RBP는 APO-RBP 동안 출시와 RBP,이 칼럼 (그림 1)에 바인딩 숙박 misfolded 있습니다. RBP의 refolding이 최적으로 수행되지 않을 경우, RBP (예는 그림 1에 RBP-I을 misfolded) 전체 준비를 predominate 수 있습니다 misfolded.
  14. 360 MM NaCl의 정상 분수에서 제대로 접 홀로 RBP를 복구 할 수 있습니다. 조심스럽게 올바르게 접혀와 그의-RBP를 misfolded의 용출 프로파일을 모니터링 할 수 있습니다. 1000 MM NaCl에서 대부분 그의-RBP이 출시됩니다 misfolded.
  15. 홀로 RBP를 포함하는 분수는 풀링 집중, 4 ° C.에서 하루 아침에 PBS에 대한 dialyzed 아르 분광 광도계에 의한 최종 수율과 품질 (330 nm/280 nm 정도)를 확인합니다. 제대로 접 제품은 1 (그림 1)보다 약간 높은의 330 nm/280 nm의 비율이 있어야합니다.
  16. produc에전자 APO-RBP는 정화 홀로 RBP에 헵탄의 동일한 볼륨을 추가, 4 ° C.에서 하루 아침에 돌려 부드럽게 섞는다 4 ° C에서 10 분 동안 16,000g에서 원심 분리기 조심스럽게 새로운 튜브 (인터페이스에서 침전물을 피해)에 하단에 수성 단계를 전송합니다. 각 3 시간에 부화를 사용하여 프로세스 세 번을 반복합니다. 330 nm의 피크가 배경 수준으로 감소가 있는지 확인하는 Nanodrop 분광 광도계에 흡수를 확인합니다.

2. STRA6 - 촉매 레티놀 자료와 레티놀로드의 실시간 모니터링

  1. 4에 밤새 차단 카세인 (피어스) 200 μl와 검은 색 96 - 웰 Microfluor-2 판을 (열 과학) 차단 ° 플라스틱에 홀로 RBP의 특이 현상 스틱 킹을 방지하기 위해 C. 차단 카세인은 우리가 테스트 된 모든 차단 솔루션의 최고 차단 효과를 제공합니다.
  2. 갓 STRA6 또는 제어 셀을 표현하는 세포로 만든 멤브레인은 해밀턴 주사기 (Gasti를 통해 PBS를 사용하여 세탁 및 전달PBS의 균일 한 현탁액을 생성하기 위해) 6 번 # 1710을 ght. 우리는 일반적으로 반응 당 100mm 요리에 성장 세포의 1백분의 1 1 / 20 일부터 파생 된 멤브레인을 사용합니다.
  3. PBS 200 μl를 한 번 Microfluor-2 판의 코팅 우물을 씻는다. 막 정지 (물론 당 50 μl)의 추가 전에 얼음에 판을 냉각.
  4. 레티놀 형광의 실시간 모니터링은 여기 필터 320ex와 방출 필터 460-10로 POLARstar 오메가 (BMG Labtech)의 형광 광학를 사용하여 측정된다. 이 프로그램은 엔드 포인트 독서 모드로 설정되어 있습니다. 시간 간격이 다양하지 않을 경우 플레이트 모드는 시간 과정을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 때마다 포인트에서 신호는 10 측정 (2 mm의 직경 궤도 평균)의 평균이며, 이익이 1800로 설정되어 있습니다. 플레이트는 각 측정하기 전에 두 번 궤도 흔들림을 사용하여 500 rpm으로 10 초에 흔들리고 있습니다.
  5. 레티놀 릴리스 분석을 시작하려면 우물이 m을 읽는 종점을 사용하여 한 번 읽기홀로 RBP 전에 송시는 (일반적으로 1 μM 최종 농도) 0 분에 추가됩니다. 즉시 홀로 RBP이 추가로 반응은 1-3 시간에 지속적으로 모든 5-10 분 모니터링된다. 레티놀 로딩 분석, 모든 트랜스 레티놀을 (일반적으로 1 μM 최종 농도)를 시작하려면 것은 희미한 붉은 빛 아래에있는 우물에 추가됩니다. APO-RBP이 0 분에 추가되기 전에 플레이트는 한 번 읽습니다. 가능한 한 빨리 APO-RBP이 추가로 반응은 1-3 시간에 지속적으로 모든 5-10 분 모니터링된다.
  6. 모든 측정이 완료되면, 데이터 분석 용 Microsoft Excel에 오메가 데이터 분석 소프트웨어 (BMG Labtech)에서 원시 데이터를 (그림 2에 표시된 예) 다운로드 할 수 있습니다. 때마다 포인트는 모든 실험 조건의 판독을 포함하는 파일을 생성합니다. 20 시간 포인트가있는 경우 예를 들어, 데이터 분석에 대해 하나의 엑셀 파일로 20 파일을 통합.
  7. 데이터 분석의 경우, 0 분의 레티놀이나 홀로 RBP를 추가하기 전에 형광 신호를 배경 신호를로 간주됩니다d는 모든 시간 지점에서의 최종 형광 신호에서 차감. 배경 신호가 낮은 빼는 방법, 홀로 RBP의 레티놀 형광에 비해 있지만 배경은 멤브레인에 의한 빛의 분산의 특이 현상의 영향을 제거하고 0 분에 추가 홀로 RBP이나 레티놀의 레티놀 형광에 초점을 수 있습니다.

3. CRBP-I에 홀로 RBP에서 레티놀의 STRA6 - 촉매 교통의 실시간 모니터링

  1. 레티놀 - EGFP 최근 41 설립 된 새로운 형광 공명 전송 (걱정) 쌍입니다. 홀로 RBP에서 EGFP-CRBP-I는 레티놀-EGFP를 측정하여 실시간으로 모니터링에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송이 초조해. 6XHis 태그 (EGFP-CRBP-I)와 EGFP-CRBP-I 융합 단백질은 포유류의 세포에서 생산되고 실험 전에 니켈 NTA 수지에 정화되어 있습니다. EGFP-CRBP-I은 4 ° C.에서 시간의 짧은 기간 동안 단백 분해 효소 억제제와 PBS에 저장 될 수 있습니다 또는 융합 단백질 전s은 (는) -80 ° C에서 작은 aliquots에 냉동.
  2. 반응하기 전에 차단 Microfluor-2 판 이상 설명한 바와 같이 세포막을 준비합니다. 막 정지 (물론 당 50 μl)의 추가 전에 200 μl PBS로 한 번 Microfluor-2 판의 코팅 우물을 씻는다.
  3. 실시간 레티놀-EGFP 걱정은 동시 결투 방출 형광 광학을 사용하여 여기 필터 320ex와 방출 필터 460-10 및 510-10로 POLARstar 오메가를 사용하여 측정된다. 이 프로그램은 엔드 포인트 독서 모드로 설정되어 있습니다. 시간 간격이 다양하지 않을 경우 플레이트 모드는 시간 과정을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 때마다 포인트에서 신호는 10 측정 (2 mm의 직경 궤도 평균)의 평균이며, 게인은 채널 당 1800로 설정되어 있습니다. 플레이트는 각 측정하기 전에 두 번 궤도 흔들림을 사용하여 500 rpm으로 10 초에 흔들리고 있습니다.
  4. 반응, EGFP-CRBP-I (일반적으로 1 μM 최종 농도)를 시작하려면하는 것은 우물에 추가됩니다. 플레이트에서 읽을 수 있습니다홀로 RBP하기 전에 엔드 포인트 독서 모드를 사용 CE는 0 분에서 추가됩니다. 즉시 홀로 RBP이 추가로 반응 측정하여 지속적으로 1-2 시간마다 5-10 분 모니터링된다.
  5. 모든 측정이 완료 한 후, 위에 설명 된대로 데이터 분석 용 Microsoft Excel에 오메가 데이터 분석 소프트웨어의 원시 데이터를 (그림 3에 표시된 예) 다운로드 할 수 있습니다.
  6. 레티놀-EGFP는 수용체 / 기증자 방출 피크 (47)의 비율로 동적 변경에 의해 계산됩니다 초조해. 이 비율을 계산하는 방정식 41은 [(510t -510 B) / (460t -460 B)], 어디에서 510t, 510 B, 460t, 그리고 460 B는 반응 개시 후 510 nm의에서 배출량을 나타냅니다 ( t = 시간 지점), 레티놀이나 홀로 RBP 전에 510 나노 미터에서 반응 (t = 시점)의 개시 후 460 nm의에서, (B = 배경) 추가하고, 레티놀이나 홀로 RBP 전에 460 nm의에서 추가됩니다 (B = 배경), 각각.

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Representative Results

우리는 홀로 RBP와 레티놀을로드하는 APO-RBP로 (그림 2)와 실시간 분석에서 STRA6 - 촉매 레티놀 자료의 HPLC에 의한 홀로 RBP 생산 및 정화 (그림 1), 실시간 분석을 보시려면 여기를 대표 결과를 제공 홀로 RBP에서 EGFP-CRBP-I에 STRA6 - 촉매 레티놀 전송 (그림 3).

거의 대부분 잘못된 이황화 채권의 존재로 인해 misfolded됩니다 refolding없이, RBP는 박테리아에서 생산. 따라서 리간드 레티놀의 존재에 refolding하는 것은 잘 접힌 RBP를 얻기에 매우 중요합니다. 우리는 refolding 반응이 제대로 수행되지 않은 경우, RBP 종은 (예 : 그림 1에 RBP-I을 misfolded) 전체 준비와 홀로 RBP는 HPLC 정화 후 매우 낮은 수 높은 품질의 수익율을 predominate 수 misfolded 것으로 나타났습니다. 따라서, HPLC는 가난한 refolding의 문제를 해결할 수 없습니다. 에 도시 된 바와 같이 (그림 1)보다 훨씬 낮은 레티놀 피크가 있습니다. 부분적으로 RBP 여전히 레티놀을 바인딩 misfolded 있지만, 레티놀 / RBP 복잡한은 훨씬 더 안정적이며, RBP 더 쉽게 레티놀을 준수 출시. RBP는 RBP 또는 비타민 A-관련 실험에서 잘못된 결론으로​​ 이어질 수 Misfolded. 제대로 접 RBP 사이 RBP를 misfolded 또 다른 차이점은 제대로 접 홀로 RBP 4에서 년 동안 안정적 ° PBS에서 C입니다. 경우홀로 RBP 준비가 RBP 오염을 misfolded했다 불용성 자료는 보관 기간 이후에 등장 할 것입니다. 불용성 물질은 4 ° C.에서 높은 속도로 솔루션을 회전 한 후 관찰 할 수있다 APO-RBP은 높은 품질의 홀로 RBP에서 생산된다.

일단 가능한 고품질의 홀로 RBP 또는 APO-RBP을하고 있습니다 정화, 그것은 STRA6 - 촉매 레티놀 전송을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 실시간 레티놀 자료 분석 및 레티놀 로딩 분석 모두 레티놀 형광을 모니터링하기에 따라 달라집니다. 레티놀 형광 인공 감소 중 하나 소스는 플라스틱 접시 (한 번 RBP는 플라스틱 벽에 바인딩되어, 그것은 더 이상 해결책으로 측정 할 수 없습니다)에 RBP의 특이 현상 바인딩입니다. 우리는 많은 차단 조건을 테스트하고 차단기 카세인 (피어스)는 레티놀 형광의 특이 현상과 수용체 독립적 인 감소를 줄이는 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 논의로 레티놀 형광 인공 감소의 또 다른 원인으로는 RBP의 품질입니다위.

STRA6 - 촉매 레티놀 출시 레티놀 로딩 및 레티놀 교통은도 2 및도 3을 대표하는 데이터에 표시 느린 이벤트입니다. 각 RBP는 모든 STRA6 - 촉매 반응이 계속 RBP 구속력과 RBP 분리 모두에 따라 달라집니다 비타민 중 하나 분자를 결합하기 때문에 반응이 느린 있습니다. STRA6 - 촉매 레티놀 릴리스 반응이 계속 들어 홀로 RBP는 APO-RBP dissociates 후 바인딩 할 수 있습니다. 계속하려면 STRA6 - 촉매 레티놀을로드하는 반응의 경우, APO-RBP는 홀로 RBP의 dissociates 후 바인딩 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 모든 실시간 모니터링 기술의 경우, 우리는 측정의 이상적인 주파수가 한 측정마다 5 분 또는 10 분입니다 것으로 나타났습니다. 더 자주 측정 높은 시간적 해상도를 만들 수 있지만 때마다 포인트가 Excel 파일을 생성하기 때문에, 결과 데이터 파일은 매우 큰 수 있습니다.

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그림 1. 정화의 레티놀을 탑재 홀로 RBP 100 %를 얻기 위해 HPLC에 RBP를 refolded. 니켈 수지 정화는 RBP는 NaCl 단계 기울기 (220 MM 10 분, 360 MM 15 분, 1,000 MM 15 분)에 의해 이온 교환 컬럼 AX-300에 적용됩니다 refolded. 제대로 접 홀로 그 .. RBP는 출시와 360 nm의 NaCl에서 용출되어 있습니다. 제대로 접 홀로 RBP에 해당하는 피크의 흡수 스펙트럼 (250 나노 미터-400 나노 미터)는, RBP-1을 misfolded RBP-2 misfolded, 그리고 오염은 (단백질 피크가 파란색 세로 선으로 표시되어 있으며 레티놀 정상은 표시됩니다 표시됩니다 빨간색 수직선) 등이 포함됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 2. APO-RBP와 홀로 RBP에서 레티놀 자료에 STRA6 - 촉매 레티놀 로딩의 실시간 모니터링. 이 분석은 STRA6이 LRAT 또는 CRBP-IA 오메가 데이터 분석 소프트웨어에 표시된대로 STRA6-catalzyed 레티놀 로딩 및 레티놀 릴리스에 대한 원시 데이터 파일의 예를하지 않고 자체적으로 수행 할 수있는 공개에 중요한 역할을했다. 레티놀 릴리스 반응을 시작하려면, 홀로 RBP는 STRA6 막 또는 0 분에서 제어 막에 추가됩니다. 레티놀 로딩 반응을 시작하려면, 레티놀은 STRA6 막 또는 0 분에서 APO-RBP과 premixed 제어 막에 추가됩니다. 320 나노 미터 여기와 460 nm의 방출을위한 형광 측정은 반응의 시간 과정을 공개했다. 반응 1-6 모니터 레티놀 APO-RBP에 로딩 (;, 2 4, 6 제어 반응 아르 1, 3, 5는 STRA6 반응입니다.) 반응 7-12 모니터 레티놀 APO-RBP에 로딩 (7, 9, 11 STRA6 반응 아르, 8, 10, 12 제어 반응 아르). A.에 표시되는 반응에 대한 B. 최종 계산 신호는 왼쪽 그래프는 6 반응 1 일 기준으로 계산되었습니다. 오른쪽 그래프는 7 12 반응에 기초하여 계산되었다. 가장 높은 형광 신호는 왼쪽 그래프에서 1로 정의됩니다. 홀로 RBP의 형광은 0에서 분은 오른쪽 그래프에서 1로 정의되어 추가되었습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 홀로 RBP에서 CRBP-IA에 STRA6 - 촉매 레티놀 교통의 실시간 모니터링 오메가 데이터 분석 소프트웨어에 표시된대로 레티놀과 EGFP 사이에 걱정 모니터링 원시 데이터 파일의 예라고 할 수 있습니다. 0 분에서 홀로 RBP는 함께 STRA6 막 (반응 1, 3, 5) 또는 제어 멤브레인을 포함하는 반응에 추가됩니다 EGFP-CRBP-나는 반응 (반응 2, 4, 6)를 시작합니다. 320 nm의에서 여기에 대한 동시 결투 방출 측정 510-10 방출 시간 코스로 460-10 방출 시간 코스와 푸른 추적으로 그린​​ 흔적을 공개했다. B. 마지막은 신호 단계 3.6의 방법에 따라 계산 된 초조 A.에 표시되는 반응에 대한 신호를 걱정 계산됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

RBP 생산 및 정화 절차를 제대로 접 RBP을 생성에 중요한 때문에 우리는 여기서 최적화 된 RBP 생산 프로토콜을 공유 할 수 있습니다. misfolded RBP 종의 가능성과 RBP를 세균 제작도 HPLC 정화에 세균 단백질의 추적 금액의 존재 감안할 때, 그것은 RBP에 관한 결론을 확인하기 위해 혈청에서 기본 RBP를 사용하는 도움이됩니다. 상업적으로 사용할 수 있습니다 소변 RBP는 APO-RBP와 홀로 RBP 48,49 등의 RBP의 많은 종의 복합 혼합물이다.

여기에 설명 된 실시간 모니터링 기술은 레티놀의 고유 형광을 기반으로합니다. 이러한 assays을 개발하기 위해 원래의 원동력 우리가 고전 방사성 assays 및 HPLC 기반 assays에 의해 공개 할 수있는 정보에 의해 제한였습니다. 예를 들어, 우리는 STRA6이 거의 비타민에게 비타민 A 통풍 관의 assays에서 그 자체로 이해 활동이 발견하지만, 우리가 쉽게 S의 낮은 활동을 설명 할 수비타민의 TRA6 LRAT 또는 CRBP-I 41없이 이해. retinyl 에스테르 기반 assays에서는 STRA6는 LRAT 활동이 효소 없기 때문에 그 자체로 STRA6은 retinyl 에스테르하지 않는 이해하기 쉬울 것입니다. 그러나, 레티놀 기반 assays에 STRA6은 여전히​​ 그 자체로 작은 활동이 있습니다. STRA6는 전혀 비타민에게 이해 활동이 있습니까? 그렇지 않으면, 어떻게 CRBP-I 또는 LRAT는 활동을 가속화 할 수 있습니까? 만일 그런 프로그램이 있다면, 왜 CRBP-I 또는 LRAT이 필요합니까? 방사성 assays 및 assays HPLC 기반이 질문에 답변되지 않더라도, 우리는 STRA6는 RBP의 레티놀을 발표 할 수있는 능력을 가지고 있어야한다고 판단. 우리는 또한 레티놀의 형광 분석이 활동을 공개 할 수 있다는 판단. 레티놀 형광 측정은 가능한 실시간 50,51의 시각 색소의 표백 빛을 한 후 척추의 photoreceptor 세포에서 무료로 레티놀의 움직임을 공부 만들었습니다. 어떻게 RBP 수용체 활동 레티놀 형광을 측정하여 모니터링 할 수 있습니까? 그것은에서 발견 된RBP 52,53에 바인딩 할 때 레티놀이 크게 향상되었습니다 형광있는 두 연구 그룹에 의해 1970 년대 초. 우리는 APO-RBP에 STRA6 - 촉매 레티놀 로딩은 레티놀 형광의 증가를 일으키는 동안 홀로 RBP에서 STRA6 - 촉매 레티놀 자료는 레티놀 형광의 감소를 일으키는 것으로 나타났습니다. 방사성 assays 및 HPLC 기반 assays는 비타민에게 이해를 공부하고 광범위하게 사용 된 있지만 수용체의 소스로 사용되는 내생 멤브레인은 매우 높은 배경 형광을 가지고 있기 때문에, 형광 assays 가능성이 높습니다, 최근까지 RBP 수용체의 활동을 연구하는 데 사용되지 않았 하고 어려운 각 단백질의 공헌을 해석 할 수 retinoid 구속력이 단백질 / 효소의 복합 혼합물을 갖추고 있습니다. 현재 민감한 악기는 또한 이러한 기술을 더 가능하게 무엇입니까. 형광 측정을 안내 할뿐만 아니라, 새로운 레티놀-EGFP는 동시 결투 방출 광학와 커플 링 한 쌍의 41 안달이 가능 실시간으로 동시에 여러 반응에 바인딩 단백질을 레티놀하는 레티놀 교통을 연구 할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

건강 기금 R01EY018144 국립 연구소에 의해 지원.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

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References

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플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석
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Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

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