Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Published: January 28, 2013 doi: 10.3791/50169
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Abstract

A vitamini görme için gerekli olan ve büyüme / neredeyse bütün insan organlarının farklılaşması. Plazma retinol bağlayıcı protein (RBP) A kan ilke ve vitamin belirli taşıyıcısıdır. İşte biz üretmek ve yüksek afinite RBP reseptör STRA6 tarafından A vitamini ulaşım incelemek için holo-RBP ve iki gerçek zamanlı izleme teknikleri arındırmak için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar. İlk teknik mümkün yüksek kaliteli vitamini için holo-RBP (100 retinol ile% yüklenmiştir) A ulaşım testlerinin büyük miktarda üretmek için yapar. RBP bültenleri vitamini RBP hazırlanmasında bir kolaylıkla ve bakteriyel kontaminasyon eserler neden olabilir katlanan çünkü Yüksek kalite RBP fonksiyonel testleri için gereklidir. Elektrofizyoloji gibi Gerçek zamanlı izleme teknikleri membran taşıma çalışmaları için kritik katkılarda bulunmuşlardır. RBP reseptör-aracılı retinol taşıma gerçek zamanlı olarak yakın zamana kadar analiz edilmemiştir. Burada anlatılan ikinci teknik rea olduğunuSTRA6-katalizli retinol serbest veya yükleme l-zaman analizi. Üçüncü tekniği holo-RBP gelen hücresel retinol bağlayıcı protein I (CRBP-I) STRA6-katalizli retinol taşıma gerçek zamanlı analiz. Bu teknikler RBP reseptörün A vitamini alımı mekanizmayı açıklamada, yüksek hassasiyet ve çözünürlük sağlar.

Introduction

A vitamini, insan yaşam ve hemen hemen tüm insan organlarının düzgün işleyişi için gerekli olan organik bir moleküldür. A vitamini türevleri (retinoidler) vizyon 1,2 ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda 3-6 gen ekspresyonu ve protein çeviri düzenleme için ışık algılama dahil çeşitli biyokimyasal ve hücresel etkinliklere katılır. Retinol sistemik diffüz yeteneğine sahip olsa da, evrim plazma retinol bağlayıcı protein, vitamin yüksek verim ve spesifite elde etmek ve 7-10 rastgele difüzyon ile ilişkili toksisite önlemek için kan bir ulaşım için belirli bir taşıyıcı protein ile geldi. RBP bağlanır ve vitamin alır yüksek afiniteli reseptör A 1970'lerde 11-13 varsayılmıştır. RBP reseptör 14-31 varlığını üç yıl içinde biriken kanıtlara rağmen, reseptör hipotezine nedeniyle existenc yıllarca tartışıldıHolo-RBP yanlış bir tanım e. Sanal-RBP arasında doğru bir tanımı da retinol ve RBP arasında yüksek afinite 01:01 karmaşık olmasıdır. Organik çözücü tarafından sanal-RBP Mükerrer ekstraksiyon apo-RBP üretmek için gereklidir. Bu tanım, RBP 7,9,32-35 veya RBP reseptör 14-31,36-42 okuyan hemen hemen tüm laboratuarlar tarafından kullanılır. RBP reseptörünün varlığı çürütmek için kullanılan sanal-RBP arasında yanlış tanım apo-RBP ile serbest retinol akut karışımıdır. Vitamin RBP reseptör fonksiyonu yana holo-RBP A alımını holo-RBP gelen retinol yayınlayacak retinol (as holo ve yanlış tanımı tarafından önerilen ile başlayan ücretsiz ise, RBP reseptör retinol alımını hiçbir rol oynayacak -RBP).

Bir multitransmembrane etki protein olarak RBP reseptör son tanımlama STRA636 denilen ve vitamin işlevi holo-RBP 36-43 A alımını kuvvetle RBP değil hipotezi karşı savunuyorSTRA6 hücre içinde 40 bulunan bir transmembran 9 ekstraselüler yer alan N-terminus ile etki ve C-terminali sahip olduğunu ortaya çıkarmıştır A vitamini detaylı analizler de teslim etmek için bir alıcı gereklidir. Transmembran 6 ve 7 arasında yer alan önemli bir RBP bağlayıcı alanı 39 olduğunu. STRA6 LRAT ve vitamin sanal-RBP A uptake CRBP-I hem de birleştirilmiştir, ancak LRAT, ne de CRBP-I tamamen gelişmiş bir etkinlik STRA6 41 için gereklidir. Olduğu Holo-RBP gelen retinol serbest katalize STRA6 yeteneği, onun A vitamini alımı etkinliği 41 için anahtardır. Onun retinol serbest STRA6 güvenerek, vitamin RBP A teslimat A vitamini yüksek özgüllük ve verimlilik ile periferik dokularda hücrelerin hedef taşıyabilir.

Holo-RBP tanımı ve hazırlanması büyük önem holo-RBP tanımları dif esas ilgili üç yeni makale ile de RBP reseptörünün varlığı tarihsel tartışmayı tarafından sadece gösterildiği, ancaközgün ve doğru tanımını 44-46 den ferent. İlk kağıt RBP reseptörü 44 okumak için RBP reseptörünün varlığı reddetmek için kullanılan sanal-RBP tanım kullanılır. İkinci ve üçüncü kağıtlar bile daha az retinol için çalışılması gereken RBP 45,46 ile uygun bir kompleks oluşturur yapılan sanal-RBP üçüncü bir tanımı ile geldi. Bu çalışmalar 3 H-retinol ile sanal-RBP (bile apo-RBP) karıştırılarak 3 H-retinol/RBP hazırlanmıştır. Bu testte 3 H-retinol/RBP oluşmuş ve aşırı ücretsiz 3 H-retinol 45,46 çıkarmadılar yoktu bu yana, 3 H-retinol/RBP 3 H-retinol alımı için bir test değil, ama ücretsiz bir 3 H-retinol difüzyon testi. Bu STRA6 LRAT 38 ya da CRBP-I 41 oranında serbest retinol hücre alımını artırmak olmadığı önceden gösterilmiştir. Hemen hemen tüm retinol kan içinde RBP bağlı olduğu ve hiçbir saptanabilir fre yokture retinol. RBP reseptör A ana işlevi holo-RBP 41'den retinol alımı sırasında holo-RBP gelen retinol serbest katalize etmektir. Retinol yapay olarak serbest ya da 45,46 ile başlamak için, serbest formdaki olduğu takdirde, RBP reseptör gerekli değildir. Doğru sanal-RBP RBP bu doğru hazırlanmasını göstermektedir hazırlanan esas testleri ile karşılaştırıldığında serbest retinol difüzyon testi elde ölçüde farklı sonuçlar fonksiyonel testler için çok önemlidir.

RBP insan serum den 41 arıtılmış, fakat bu işlem oldukça karmaşıktır ve düşük verim edilebilir. Alternatif bir yaklaşım, E. RBP üretmek için coli. Çünkü E. coli düzgün RBP gibi disülfid bağlarının birden fazla çift memeli salgılanan proteinler pas yeteneğine sahip değildir, katlanamayan RBP ve doğru katlanmış proteini saflaştırmak için gereklidir. Katlanan proteinleri sadece, farklı çeşitli testler giderilmiştir katlanmış RBP gelen davranmazfakat aynı zamanda saklama esnasında protein agregasyonu neden olur. Aynı nedenle, apo-RBP sadece yüksek kaliteli sanal-RBP üretilir. Biz kaliteli RBP bakteriyel ifade refolding ve HPLC arıtma yoluyla retinol ile yüklenen% 100 üretmek için burayı optimize edilmiş protokol açıklar. HPLC saflaştırma yanlış katlanmış RBP değil, aynı zamanda RBP sinyal transdüksiyon testlerin kullanılması durumunda ciddi eşya neden olabilir önemli bakteriyel kontaminasyon kaldırır sadece. Biz de STRA6 tarafından retinol ulaşım incelemek için iki hassas gerçek zamanlı izleme teknikleri anlatıyoruz. Her iki teknikler kaliteli RBP bağlıdır. Alanı sınırlamaları nedeniyle, radyoaktif retinoid tabanlı ve HPLC bazlı vitamin klasik teknikler alımını deneyleri burada yer verilmemiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Holo-RBP üretimi, refolding ve HPLC Arıtma

  1. PET3a vektör N-ucu üzerinde 6x His etiketi olan insan RBP için cDNA barındıran BL-21cells dönüştürülmesi. 600 nm'de OD kadar karbenisilin ile 40 mL LB ortamı içinde 37 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı içinde transforme BL-21 hücrelerinin büyümesini 0,5 ulaşır. 1mM için IPTG ekleyerek RBP protein ekspresyonu øndükle. 37 bakteri büyümek ° C başka bir 5 saat.
  2. E.coli 'de üretilen RBP çözünmeyen inklüzyon cisimcikleri çoğunlukla mevcuttur. 20 dakika boyunca 10.000 xg'de inklüzyon cisimcikleri, pelet hücreleri zenginleştirmek. Sonra, dondurma ve buz çözme 2 döngüsü uygulayarak proteaz inhibitörleri ile birlikte 5 ml PBS içinde buz üzerinde hücreler sonikasyon. Pelet aşağı 4 az 30 dakika süreyle 20,000 x g inklüzyon gövdelerinin ° C. Süpernatantı ve buz üzerinde pelet tutun.
  3. 10 ml 7.5 M guanidin hidroklorür sonication tarafından inklüzyon cisimciği pelet çözünür. Bir nihai C ile 25 mM Tris tamponu, pH 9.0 ve DTT bir yarım hacim (5 ml) ekleyin10 mM oncentration. Kuvvetlice tam olarak azaltmak ve proteinleri denatüre etmek için oda sıcaklığında gece boyunca bir vorteks mikseri üzerinde çözelti ilave edilir.
  4. 4 ° C'de 20 dakika süre ile 18,000 x g çözünmeyen malzemelerin ayrılması için protein çözeltisi santrifüje Sıkma sonra, yeni bir tüp için supernatant aktarmak ve buz üzerine yerleştirilir.
  5. Refolding tamponu dört hacim (60 mi) (25 mM Tris, pH 9.0, 0.3 mM sistin, 3.0 mM sistein, 1 mM EDTA) içinde hazırlayın. Degas refolding tampon. Ayrıca loş kırmızı ışık altında etanol 600 ul 10 mM retinol hazırlamak. Buz üzerinde karanlıkta saklayın. Refolding tampon ve retinol çözüm Hem taze hazırlanmış olması gerekir.
  6. Protein çözeltisi ve en az 30 dakika boyunca buz üzerinde refolding tampon her ikisi de soğutulur. Yüksek sıcaklık olasılıkla RBP refolded kalitesini azaltır. 1 ml refolding tampon damlalar halinde ve sırayla 10 ul retinol çözelti protein çözeltisi şiddetle buz üzerinde bir behere karıştırılır iken ekleyin. Tüm refolding tampon ve retinol kadar bu adımı yineleyinilave edilir. 5 saat için karanlıkta buz üzerinde reaksiyon karıştırmaya devam edin.
  7. 4 ° C'de 30 dakika süreyle 24,000 x g refolding reaksiyon aşağı Spin Bu doğru refolding reaksiyondan sonra toplamları kaldırmak için esastır.
  8. Yaklaşık 10 ml Amicon Ultra 15 konsantratör (MWCO 10 K) kullanarak süpernatant çözümü Konsantre. Bu seviyede daha refolded çözüm konsantre olmayın. Çok konsantre protein agregasyonunu yol ve doğru katlanmış RBP nihai verim ve kalitesini düşürür olacaktır. Soğuk PBS ile 100 mL'ye konsantre örnek seyreltilir. Bu adımın amacı, nikel saflaştırma ile müdahale refolding reaksiyon bileşenleri ortadan kaldırmaktır.
  9. 4 ° C'de 20 dakika süre ile 24,000 x g çözelti bir kez daha Spin Bu, herhangi bir çökelti kaldırmak için önemlidir. Iki adet 50 ml'lik tüp, PBS ile yıkandı her içeren 1 ml Ni-NTA bulamaç fazı aktarın. Bir saat boyunca 4 ° C'de tüp döndürün. Seyreltilmiş çözelti f kuluçkayaya da 1 saat kaldırılması gerekir katlanan proteinleri çökelmesini neden olabilir.
  10. 3 dakika boyunca 500 xg'de tüpler aşağı spin. Dikkatli Süpernatantı. Her şey yüzer kaldırılması gerekir. Her bir tüp için 30 ml soğuk PBS ekleyin. Yeniden Spin ve süpernatant kaldırmak. Eğer tüp ama boncuk şey görene kadar bu işlemi tekrarlayın.
  11. Boş bir sütun Ni-NTA reçine aktarın. 10 mM imidazol, PBS içinde 500 mM NaCl 20 kolon hacmi ile reçine yıkanır. PBS içinde 100 mM imidazol 5 kolon hacmi içinde His-RBP Zehir. Uzun bir süre için bu çözüm depolamak ve donma son verim ve kalitesini azaltır etmeyin. En iyi sonuç için, hemen HPLC ile RBP arındırmak.
  12. 25 mM Tris, pH 8.4, ve 120 mM NaCl karşı Ni-NTA reçinesi saflaştırıldı His-RBP Dialyze. Bir yoğunlaştırıcı, aynı zamanda tampon değişimi için de kullanılabilir. ° C sağ Her koşudan önce 4 az 10 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüj ile HPLC için Clear örnekleri.
  13. Bir iyon kullanarak HPLC üzerinde sanal-RBP Purifydeğiş tokuş 1 ml / dakika hızında mobil faz olarak 25 mM Tris, pH 8.4 NaCl kullanarak bir adım gradyanı (12 dakika 220 mM, 360 mM, 15 dakika, ve 15 dakika 1,000 mM) ile sütun AX-300. NaCl konsantrasyonu arttıkça, holo-His-RBP apo-RBP ederken yayımlanan ve RBP sütun (Şekil 1) bağlı kalmak katlanan edilir. RBP refolding en iyi şekilde yapılmadığı takdirde, RBP (örneğin, Şekil 1 'de RBP-I katlanan) tüm hazırlık ağırlıkta olabilir katlanan.
  14. 360 mM NaCl doruk fraksiyonları doğru katlanmış holo-RBP kurtarın. Dikkatle doğru katlanmış ve His-RBP katlanan ve elüsyon profili izlemek. 1.000 mM NaCl anda, çoğu His-RBP serbest bırakılmalıdır katlanan.
  15. Sanal-RBP ihtiva eden fraksiyonlar, toplanmış konsantre edildi ve 4 ° C de bir gece PBS'ye karşı diyaliz edilmiştir Spektrofotometre ile son verim ve kalite (330 nm/280 nm) kontrol edin. Doğru katlanmış ürün 1 (Şekil 1) biraz daha yüksek bir 330 nm nm/280 oranında olmalıdır.
  16. Üretimi içinE apo-RBP, saflaştırılmış holo-RBP için heptan eşit hacimde ekleyin ve 4 ° C gecede çevirerek hafifçe karıştırın 4 ° C'de 10 dakika süreyle 16,000 g de santrifüjlenir ve dikkatlice bir yeni tüpü (ara yüzeyde çökelti kaçınarak) ile alt sulu faz transfer edin. Her biri için 3 saat inkübasyon işlemi üç kez tekrarlayın. 330 nm tepe plan düzeyine inmiştir emin olmak için bir Nanodrop spektrofotometre üzerinde emilimini kontrol edin.

2. STRA6-katalizli Retinol Yayın ve Retinol Yükleniyor Gerçek zamanlı izleme

  1. 4 gecede Engelleyici Kazein (Pierce) 200 ul bir siyah 96-Microfluor-2 plaka (Thermo Scientific) Blok ° plastik holo-RBP nonspesifik yapışmasını önlemek için C. Engelleyici Kazein Denediğimiz tüm engelleme çözümlerinin iyi bloke edici etkisi verir.
  2. Taze STRA6 ya da kontrol hücreleri ifade eden hücrelerden hazırlanan Zarlar bir Hamilton şırıngası (Gasti ile PBS ile yıkanmış ve geçirilirPBS içinde üniform bir süspansiyonu elde etmek için) 6 kere # 1710 GHT. Bu reaksiyon tipik olarak her bir 100 mm tabak üzerinde yetiştirilen hücreler 1/100 ile 1/20 'dan türetilen membranlar kullanılır.
  3. 200 ul PBS ile bir kez Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce buz üzerinde plaka soğutulur.
  4. Retinol floresans Gerçek zamanlı izleme eksitasyon filtresi 320ex ve emisyon filtresi 460-10 ile POLARstar Omega (BMG Labtech) floresans optikler kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm'de 10 saniye çalkalanır.
  5. Retinol salınım testi başlatmak için, kuyular m okuma Endpoint kullanarak bir kez okunursanal-RBP önce gazel (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) 0 dak ilave edilir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir. Retinol yükleme tahlil, all-trans retinol (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlatmak için soluk kırmızı ışık altında oyuklara ilave edilir. Apo-RBP 0 dakika önce ilave edilir plaka bir kez okunur. En kısa apo-RBP eklendiğinde, reaksiyon 1-3 saat için sürekli olarak her 5-10 dakikada izlenir.
  6. Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, veri analizi için Microsoft Excel Omega Veri Analizi yazılımı (BMG Labtech) ham verileri (Şekil 2'de gösterildiği örnek) indirebilirsiniz. Her zaman noktasında tüm deneysel koşullar okumaları içeren bir dosya oluşturur. 20 kez puan varsa Örneğin, veri analizi için bir Excel dosyası içine 20 dosyaları birleştirmek.
  7. Veri analizi için, 0 dak retinol veya sanal-RBP ilave edilmeden önce flöresan sinyalleri, bir arka plan sinyali olarak kabul edilird tüm zaman noktalarında nihai flöresan sinyalleri çıkarılır. Arka sinyaller düşük çıkarılarak, holo-RBP retinol floresans kıyasla rağmen arka membranlar tarafından ışık saçılma nonspesifik etkisini ortadan kaldırır ve 0 dakika ilave holo-RBP veya retinol retinol floresans odaklanmak mümkün kılar.

3. CRBP-I Holo-RBP kaynaktan Retinol arasında STRA6-katalizli Ulaştırma Gerçek zamanlı izleme

  1. Retinol-EGFP son 41 kurulmuş yeni bir floresan rezonans transferi (FRET) çiftidir. Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I retinol EGFP ölçerek gerçek zamanlı olarak izlenir STRA6-katalizli retinol ulaşım FRET. 6XHis etiketi (EGFP-CRBP-I) ile EGFP-CRBP-I füzyon proteini, memeli hücrelerinde üretilir ve deneyden önce Ni-NTA reçinesi üzerinde saflaştırılır. EGFP-CRBP-I 4 ° C de kısa bir süre için, proteaz inhibitörleri ile PBS içinde saklanabilir Alternatif olarak, füzyon proteini is -80 ° C küçük alikotları donduruldu.
  2. Reaksiyon başlamadan önce, bir bloke edilmiş Microfluor-2 plaka ve yukarıda tarif edildiği gibi membranlar hazırlanır. Membran süspansiyonu (kuyu başına 50 ul) ilave etmeden önce 200 ul PBS ile bir kere Microfluor-2 plaka kuyucuklar yıkayın.
  3. Gerçek-zamanlı retinol-EGFP FRET simültane emisyon düello floresan optik kullanılarak uyarma filtre 320ex ve emisyon filtre 460-10 ve 510-10 ile POLARstar Omega kullanılarak ölçülür. Program Endpoint okuma moduna ayarlanır. Zaman aralıkları çeşitli takdirde Plaka Mod, aynı zamanda, bir zaman süreci ölçmek için kullanılabilir. Her bir zaman noktasında elde edilen sinyali 10 ölçüm (2 mm arasında bir çapa sahip orbital ortalama) ve ortalama ve kazanç kanal başına 1.800 ayarlanır. Plakası her ölçümden önce çift yörüngesel titreme kullanarak 500 rpm'de 10 saniye çalkalanır.
  4. Reaksiyonları, EGFP-CRBP-I (tipik olarak 1 uM nihai konsantrasyon) başlamak için kuyu ilave edilir. Plaka okunurHolo-RBP önce Endpoint okuma modunu kullanarak ce 0 dakika eklenir. En kısa sanal-RBP eklendiğinde, reaksiyon ölçüm tarafından sürekli olarak 1-2 saat için her 5-10 dakikada izlenir.
  5. Tüm ölçümler yapılır sonra, yukarıda tarif edildiği gibi veri analizi için, Microsoft Excel ile Omega veri analiz yazılımı gelen ham verileri (Şekil 3'te gösterildiği gibi örneğin) yükleyin.
  6. Retinol-EGFP alıcı / verici emisyon zirveleri 47 oranında dinamik değişimi ile tespit edilir FRET. Bu oranı hesaplamak için denklem 41'dir [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], burada 510 t, 510 b, 460 t ve 460 b reaksiyon başladıktan sonra 510 nm'de emisyon temsil ( t = zaman noktası), retinol veya sanal-RBP önce 510 nm 'de tepkime (t = zaman noktası) başlandıktan sonra 460 nm' de, (b = arka plan) ilave edilir ve retinol veya sanal-RBP önce 460 nm 'de ilave edilir (b = arka plan), sırasıyla.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz sanal-RBP ve retinol yükleme apo-RBP içine (Şekil 2) ve gerçek zamanlı analiz itibaren STRA6-katalizli retinol serbest HPLC ile sanal-RBP üretimi ve saflaştırılması (Şekil 1), gerçek zamanlı analiz için buraya temsilcisi sonuçları sunmak Holo-RBP gelen EGFP-CRBP-I STRA6-katalizli retinol taşımacılığı (Şekil 3).

Hemen hemen tamamen yanlış bir çok disülfid bağların varlığı nedeniyle katlanan bir refolding olmadan, RBP bakteriler üretilir. Dolayısıyla, ligand retinol varlığında refolding da katlanmış RBP elde etmek önem taşımaktadır. Biz refolding reaksiyonu doğru yapılmaz ise, RBP türler (örn. Şekil 1'de RBP-I katlanan) tüm hazırlık ve sanal-RBP HPLC saflaştırma sonrasında çok düşük olabilir yüksek kalitede verim hakim olabilir katlanan bulundu. Bu nedenle, HPLC yoksul refolding problemi düzeltmek edemez. De gösterildiği gibi (Şekil 1) çok daha düşük olan bir retinol tepe sahiptir. Kısmen RBP hala retinol bağlayan katlanan rağmen, retinol / RBP kompleksi daha az istikrarlı ve RBP daha kolay retinol bağlı bırakır. RBP RBP veya A vitamini türevi deneyler hatalı sonuçlara yol açabilir katlanan. Doğru katlanmış RBP arasında RBP katlanan diğer bir fark olduğunu doğru katlanmış holo-RBP 4 yıllarca istikrarlı ° PBS C'dir. EğerHolo-RBP hazırlık RBP kirlenme katlanan gelmiştir, çözünmeyen madde depolama bir süre sonra ortaya çıkacaktır. Çözünmez malzemeler 4 ° C 'de yüksek hızda eğirme solüsyonu aşağı sonra görülebilir Apo-RBP sadece yüksek kaliteli sanal-RBP üretilir.

Kullanılabilir bir yüksek-kaliteli sanal-RBP veya apo-RBP bir saflaştırılmış, bu STRA6-katalize retinol taşıma incelemek için kullanılabilir. Gerçek zamanlı retinol salınım testi ve retinol yükleme testi Hem retinol floresans izleme bağlıdır. Retinol floresans yapay düşüşün bir kaynak plastik tabak (bir kez RBP plastik duvar bağlıdır, artık çözüm ölçülebilir) için RBP ve nonspesifik bağlayıcıdır. Pek çok engelleme koşullar test edilmiş ve Engelleyici Kazein (Pierce) retinol floresans bu spesifik olmayan ve reseptör bağımsız düşüş azaltmada etkili olduğunu bulduk. Tartışıldığı gibi retinol floresans yapay düşüşün bir diğer kaynak, RBP kalitesiz olduğunuYukarıda.

STRA6-katalizli retinol serbest bırakma, retinol yükleme ve retinol taşıma olarak Şekil 2 ve 3 de gösterildiği gibi temsil eden veri nispeten yavaş etkinlikleri vardır. Her bir RBP yalnızca A ve her STRA6-katalizli reaksiyon devam RBP bağlayıcı ve RBP ayrışma her ikisi de bağlıdır vitamin bir molekül bağlar, çünkü reaksiyon nispeten yavaştır. STRA6-katalizli retinol serbest reaksiyonu devam etmek için, sanal-RBP yalnızca apo-RBP dissosiye sonra bağlayabilirsiniz. Devam etmek STRA6-katalizli retinol yükleme reaksiyonu için, apo-RBP sadece sanal-RBP dissosiye sonra bağlayabilirsiniz. Burada açıklanan tüm gerçek zamanlı izleme teknikleri için, ideal ölçüm frekansını bir ölçümü her 5 dk veya 10 dk olduğunu buldu. Daha sık ölçümler daha yüksek zamansal çözünürlük oluşturabilirsiniz, ancak her zaman noktasında bir Excel dosyası oluşturur, çünkü ortaya çıkan veri dosyaları çok büyük olacaktır.

Şekil 1 Çadır-width = "5.5 inç" fo: src = src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" / "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg">
Şekil 1. Arınma retinol ile yüklenen sanal-RBP 100% elde etmek için HPLC üzerine RBP refolded. Nikel reçine saflaştırılmış RBP bir NaCl adım gradyanı (10 dakika 220 mM, 360 mM, 15 dakika, ve 15 dakika 1,000 mM) ile iyon değişim kolonu AX-300 uygulanır refolded. Doğru katlanmış holo-His-RBP yayımlanan ve 360 ​​nM NaCl akıtılan edilir. Doğru katlanmış sanal-RBP karşılık gelen tepe absorpsiyon spektrumu (250 nm-400 nm), RBP-1 katlanan RBP-2 katlanan ve kontaminasyon da (protein tepe mavi bir dikey çizgi ile gösterilir ve retinol tepe gösterilir gösterilir Kırmızı dikey çizgi). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Şekil 2. Apo-RBP ve sanal-RBP gelen retinol sürümde STRA6-katalizli retinol yükleme Gerçek zamanlı izleme. Bu testte STRA6 LRAT veya CRBP-IA Omega Veri Analizi yazılımı gösterildiği gibi STRA6-catalzyed retinol yükleme ve retinol serbest bırakılması için ham veri dosyası örneği olmadan kendi başına neler yapabileceğini göstermesi açısından önemli bir rol oynadı. Retinol serbest bırakma reaksiyon başlatmak amacıyla sanal-RBP STRA6 zar ya da 0 dak kontrol zar eklenir. Retinol yükleme reaksiyon başlatmak üzere, retinol STRA6 zar ya da 0 dak apo-RBP ile önceden karıştırılmış bir kontrol zarı eklenir. 320 nm eksitasyon ve 460 nm emisyon Floresans ölçümleri reaksiyonların zaman ders saptandı. Reaksiyonlar 1-6 monitörü retinol apo-RBP içine yükleme (;, 2. 4, 6 ve kontrol reaksiyonları; 1, 3, 5 ve STRA6 reaksiyon vardır). Tepkiler 7 ila 12 monitör retinol apo-RBP içine yükleme (7, 9 ve 11 STRA6 tepki vardır; 8, 10, ve 12 kontrol reaksiyonları vardır). A'da gösterilen reaksiyonlar için B. Nihai hesaplanan sinyaller sol grafik 6 reaksiyonlar 1 bazında hesaplanmıştır. Sağdaki grafik 7 12 reaksiyonlara dayalı olarak hesaplanmıştır. En yüksek flüoresan sinyali sol grafik 1 olarak tanımlanır. Holo-RBP ve floresans 0 dk sağ grafikte 1 olarak tanımlanır eklendi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. Holo-RBP gelen CRBP-IA STRA6-katalizli retinol ulaşım Gerçek zamanlı izleme Omega Veri Analizi yazılımı gösterildiği gibi retinol ve EGFP arasındaki FRET izler ham veri dosyası örneği. 0 min olarak, sanal-RBP ile STRA6 membran (reaksiyon 1, 3 ve 5) veya kontrol membran içeren reaksiyonlar eklenir EGFP-CRBP-I reaksiyonları (reaksiyon 2, 4, ve 6) başlatmak için. 320 nm'de uyarılma için Eşzamanlı düello emisyon ölçümleri 510-10 emisyon zaman ders olarak 460-10 emisyon time kurs ve mavi iz olarak yeşil iz saptandı. B. Nihai sinyaller adım 3.6 yöntemlerine göre hesaplanmıştır FRET A'da gösterilen reaksiyonlar için sinyaller FRET hesaplanmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RBP Üretim ve saflaştırma prosedürleri doğru katlanmış RBP üretme açısından kritik önem taşımaktadır çünkü biz burada bir optimize RBP üretim protokolü paylaşabilirsiniz. Katlanan RBP tür olasılığı ve RBP bakteri üretimi dahi HPLC saflaştırılmış içinde bakteriyel proteinler, eser miktarda varlığı göz önüne alındığında, RBP ile ilgili bir sonuç teyit etmek için serum dan doğal RBP kullanmak yararlıdır. Piyasada mevcut İdrar RBP, apo-RBP ve sanal-RBP 48,49 dahil RBP birçok türün kompleks bir karışımıdır.

Burada açıklanan gerçek-zamanlı izleme teknikleri retinol içsel floresan dayanmaktadır. Bu testler geliştirmek için orijinal bir ivme biz klasik radyoaktif deneyleri ve HPLC-dayalı testler ortaya çıkabilmektedir bilgiler ile sınırlı olmasıydı. Örneğin, biz STRA6 küçük vitamini A vitamini alımı tayinlerde kendisi tarafından bir alımını aktiviteye sahip olduğu bulundu, ama biz kolayca S düşük aktivite açıklayamamVitamin TRA6 LRAT veya CRBP-I 41 olmadan bir tutulum. Retinil-ester bazlı deneyler, bu STRA6 LRAT aktivitesine sahip bir enzim değildir, çünkü kendisi tarafından STRA6 retinil ester yapmaz anlaşılması kolaydır. Bununla birlikte, hatta retinol bazlı deneylerde, STRA6 yine tek başına az etkiye sahiptir. STRA6 hiç bir A vitamini alımı faaliyeti var mı? Eğer değilse, nasıl CRBP-I veya LRAT faaliyet hızlandırabilir? Eğer varsa, neden CRBP-I veya LRAT gerekiyor? Radyoaktif deneyleri ve analizleri HPLC tabanlı bu sorulara cevap vermedi, ancak biz STRA6 RBP gelen retinol serbest bırakmak için yeteneğine sahip olması gerektiğini gerekçeli. Biz de retinol floresans tahlil Bu aktiviteyi ortaya olabilir gerekçeli. Retinol floresans ölçme mümkün gerçek zamanlı 50,51 görsel pigmentler beyazlatma ışığı sonra omurgalı fotoreseptör hücreleri serbest retinol hareketini incelemek için yaptı. Nasıl RBP reseptör aktivitesini retinol floresans ölçülerek izlenebilir? Bu keşfedildiRBP 52,53 bağlı olduğunda retinol dramatik floresans artırmıştır iki araştırma grubu tarafından 1970'lerin başında. Biz apo-RBP içine STRA6-katalizli retinol yükleme retinol floresans artışı neden olurken holo-RBP gelen STRA6-katalizli retinol açıklaması, retinol floresans bir azalmaya neden olduğunu buldu. Radyoaktif deneyleri ve HPLC-dayalı testler A vitamini alımı incelemek için yaygın olarak kullanılan olmasına rağmen reseptör kaynağı olarak kullanılan endojen membranlar çok yüksek arka plan floresan çünkü, floresans ölçümleri olasılıkla, yakın zamana kadar RBP reseptör aktivitesini incelemek için kullanılan olmamıştı ve zor her protein katkısı yorumlama yapar retinoid bağlayıcı proteinlerin / enzimlerin karmaşık bir karışımı var. Mevcut hassas cihazlar da bu teknikleri daha uygulanabilir kılan öğelerdir. Floresan ölçüm doğrudan ilave olarak, yeni retinol-EGFP düello eşzamanlı optik emisyon ile birleştirilmiş bir çift 41 FRETmümkün gerçek zamanlı olarak ve aynı anda birden fazla reaksiyonlar bağlayıcı proteinlerin Retinol retinol ulaşım çalışma yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Sağlık hibe R01EY018144 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Biyokimya Sayı 71 Moleküler Biyoloji Genetik Hücre Biyolojisi Anatomi Fizyoloji Oftalmoloji Proteomik Proteinler Membran Taşıma Proteinleri A vitamini retinoid RBP kompleksi membran transport membran reseptörü STRA6 retinol bağlayıcı protein
Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H.… More

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter