Summary
MicroRNAs играть значительную роль в структуре и функции мозга. Здесь мы опишем метод для обеспечения гиппокампа микроРНК сверхэкспрессию использованием стереотаксической инъекции инженерных микроРНК-экспрессирующих лентивирус. Этот подход может служить относительно быстрым способом оценки
Introduction
Роль микроРНК в частности функционирования нервной системы недавно было оспорено лентивирусный инъекций в нескольких исследованиях. MiRNAs было установлено, что важно для поддержания и повторное формирование синапсов структуры 1, 2 синаптогенез и реконструкции синапсов и техническое обслуживание 3. Эти исследования убедительно показывают, что микроРНК занимаются, через многоуровневую регуляторных эффектов как в формировании и поддержании в основном выходе нервной системы, когнитивные функции. Стереотаксической инъекции лентивирус частиц в конкретных регионах в мозге грызунов позволяет поисках изменений в морфологии и синапсов нейронной активности, и был использован для создания функционального значения сверхэкспрессированные стенограммы 4,5. Прямая инфекции нейронов, находящихся в четко определенных областях мозга с микроРНК-экспрессирующих лентивирусы могут быть причастны исследования старения, заболеваний мозга и нейродегенеративные; исследований микроРНКы в области поведенческой регуляции 6-8 находятся на гораздо менее развитые государства, и стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих лентивирус частиц последующим поведенческие тесты могут использоваться для таких целей. Значительно более трудоемкий способ индукции избыточного или недостаточного-выражение содержит генетически модифицированные нок-ин или нокаут мышей. Генетические системы может дополнительно позволить условный и временной контроль экспрессии (например Cre-Lox, Tet системы), но они вряд ли предлагать пространственной специфичности процедуры инъекции и почти всегда имеется определенное количество неплотности. Кроме того, инженерные процедуры не требуют хирургического вмешательства и может использоваться во всех лабораторий с относительно хорошей воспроизводимости, но они медленнее и требуют гораздо больше трудовых и финансовых ресурсов. Кроме того, временной контроль избыточного или недостаточного-выражение в вводили мышам является гораздо более точным по сравнению с генетически модифицированных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Лентивирус
- Grow НЕК-клетки 293FT до 90% слияния.
- В день трансфекции изменение клеточной среде в бессывороточной среде DMEM с добавлением 1 мМ глутамина и 50 мг / мл пенициллин-стрептомицина.
- Со-трансфекции клеток с pLKO.1-Puro вектор и плазмидами, кодирующими дельта R8.2 и VSV-G фрагментов и миРНК интерес, с использованием 10 мкл 1 мг / мл полиэтиленимина в качестве носителя 9.
- Сбор упакованных лентивирусов на 24 ч и 48 ч после трансфекции через фильтр 0,45 мкм фильтр.
- Концентрат лентивирусы использованием ультрацентрифугирование в 70 000 мкг, в течение 2 часов и 15 ° C, аликвоты и хранят при температуре -70 ° С.
- Измерение титра вируса путем инфицирования клеток НЕК-293Т с серийно разведенными вирусных препаратов (от 1 до 10 -6 мл вектор на лунку). Полученное титр (минимум ~ 1 × 10 9 инфекционных частиц на мл рекомендуется) вычисляется для экспрессии GEдной из интереса, используя пуромицин отбор и путем количественного выражения GFP вирусов через подсчет флуоресцентных клеток.
Для получения более подробных протоколов лентивирусом получения см. 10.
2. Подготовка животных для хирургии
- Хирурги одежде должна включать хирургический халат, стерильные перчатки, шапки и маски.
- Взвешивание животных, то обезболить его с IP-инъекции кетамина смеси, объем пропорционально веса животных, как указано для каждого препарата. Для кетамин / ксилазин смеси диапазоне доз 80-200 мг / кг кетамина и 7-20 мг / кг ксилазина обычно используется для мышей.
- Подождите, пока животное не полностью под наркозом, а затем проверить из-за отсутствия вывода рефлекс в задней конечности животного, расширив конечности, а затем нажать на него пальцем.
- Введите животного подкожно Римадила, как указано на коробке, для облегчения боли. Типичный диапазон доз для Rymadil составляет 5-10 мг.
- Место животное на грелку держать постоянную температуру тела и увлажнить глаза мазь.
- Бритье области между двумя ушами с функцией подрезки машины.
- Sanitize кожи бетадином.
3. Воздействие на череп и бурение
- Место животное внутри stereotact, регулируя стержней в щели только впереди ушей животного.
- Используйте скальпель, чтобы сделать передне-задней разрез около 1,5 см между ушами и держать его открытым с хирургии зажимов (serfines).
- Очистите поверхности черепа с помощью ватного тампона до пересечения венечного шва и сагиттального швов, т.е. брегмы и пересечение между корональной и ламбдовидный швов, т.е. лямбда, видны.
- Направьте кончик шприца, проведенного stereotact, вплоть до темени, на всех трех осях. Запишите координаты. Эта точка будет считаться нулевой POINT по всем трем осям.
- Поднимите шприц в вертикальной оси, так что плоские движения не поцарапать черепа и переместить шприц голову в нужное место. CA1 гиппокампа инъекции потребуются следующие координаты относительно брегмы в мм: -2 на передней / задней оси, ± 1,8 на боковых / срединной оси и -1,5 на спинной / вентральной оси.
- Опустите кончик шприца, пока она не коснется черепа и отметить место, с маркером. Удалите шприц назад, чтобы избежать колоть.
- Просверлите небольшие отверстия, только в кости черепа с помощью тонкой бурильщика. Держите бурильщика устойчивый поэтому он не будет продолжать сверлить под мягкие ткани. Вы можете предотвратить это, стабилизирующее одной стороны, с другой, и путем бурения в коротких импульсов.
4. Инъекции Лентивирус
- Вывод 0,5 мл концентрированного раствора лентивирусов.
- Поместите шприц над отверстием и медленно опустите ее вертикально, пока он не REAчес поверхности черепа. Продолжайте опускать шприца в мозг очень медленно. На этом этапе некоторые могут возникнуть кровотечения, которое не обязательно указывает на ложный проникновения. Если кровотечение происходит вытереть его с помощью ватного тампона.
- Установите цифровой насоса до 0,02 мл / мин (0,5 мкл бы быть введен в течение 25 минут) и начать вливания. Медленное инфузии позволяет эффективно распространение вируса в ткани и предотвращает обратный поток. В некоторых типах шприцев рассмотреть вопрос о внесении шприц за дополнительную глубину 0,5 мм перед отступлением с исходными координатами и вливания.
- После завершения вливаний ждать еще 5 мин, чтобы позволить материалу распространились в мозг, а не отступают назад в канал образован шприц.
- Удалите шприц очень медленно и следить за потоками обратно. Если обратный поток наблюдается на этом этапе часть вводимого материала, вероятно, потеряны.
5. Уплотнительная ран и восстановления
- Уплотнение йэлектронной намотаны гистоакрил. Будьте уверены, чтобы избежать утечки гистоакрил в глаза.
- Введите животным внутрибрюшинно (IP) в 1 мл предварительно нагретый солевой раствор, чтобы избежать обезвоживания.
- Место животное в клетке восстановления, который расположен на нагретой панели. Часы животных в то время как он восстанавливает в течение дополнительного часа.
В случае потеря веса, отсутствие аппетита, слабость / невозможность получения корма или воды, умирающей государственной или инфекцию, эвтаназии животных должны быть выполнены. Приемлемые методы эвтаназии грызунов барбитураты, ингаляционные анестетики, CO 2, CO, или хлорид калия в сочетании с общей анестезией.
После 4 до 6 недель, оценивать навигации памяти животного оценивали в водном лабиринте Морриса. Лентивирусов, как правило, заражают большинство клеток в области инъекции.
6. Поведенческая оценка в водном лабиринте Морриса
- Поезд животных в MИрис водный лабиринт. Для точного обучение и тестирование протокола см. 11. После каждого испытания, высушить животное с сухим полотенцем, заменить его в клетку и обновить воды в баке.
- Проверка животных в водном лабиринте Морриса течение 3 дней подряд, 4 испытания каждый день. Каждый день вставить животное в лабиринте в каждом из 4-х направлениях из лабиринта (север, юг, восток и запад) в меняющемся порядке, например один день: Восток-Запад-Север-Юг, день второй: Запад-Юг -северо-восток. Протрите животных после каждого испытания.
- Во время испытаний, отслеживать животное с системой слежения, такие как Noldus системой слежения.
- После 12-го суда теста, вставьте животных в бункер для воды без платформы в течение одной минуты. Это может быть использовано для анализа стратегии поиска животного принимает.
- Проанализируйте данные, как предложено в 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инъекция 0,5 мкл лентивирусов в области СА1 в гиппокампе мышей, с расходом указано в протоколе раздел дает инфицированные области около 1 мм в ростральной-хвостовой оси и около 0,5 мм в медиальных-боковой и передней -задней оси (рис. 3).
Рисунок 1. Брегмы точки и устройства впрыска. (А), показанного является карта-схема брегмы (фронтальной и сагиттальной пересечения швов) и лямбда (ламбдовидный и сагиттального швов пересечения), как видно после выполнения разреза. (Б) Изображение изображающий основные механические компоненты стереотаксической аппарата.
Рисунок 2. Лентивирус Principal компонентов. лентивирусов включает в себя компоненты, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам (Ампициллин, Amp R), ген-репортер (GFP), 5 'и 3' длинных концевых повторов (LTR) для эффективной интеграции и экспрессии вируса и представляющий интерес ген (микроРНК).
Рисунок 3. Месте инъекции и в трансфекции Лентивирус естественных условиях. (А) в месте инъекции в соответствии с мышью атласа. Инъекции направляется в области СА1 гиппокампа. (Б) количественное GFP в условных единицах (нормализованная мера количества «зеленых» видели в каждой области), а также 11 ломтиков, каждый толщиной 40 мкм, в ростральной-каудальном оси. (C, D, E и F). Конкретных областях на должности указаны наГрафик си. DAPI окрашивание в красный и GFP в зеленый цвет. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Поведенческие оценка мышей в MWM. (А) Среднее задержки найти скрытую платформу для мышей, которым вводили лентивирусов, экспрессирующие конкретных микроРНК (обозначенного микроРНК-Х на фигуре, красные круги, п = 10) и мышей, которым вводили скремблирования, выражающий лентивирус (зеленые треугольники, N = 10). Ошибка бары представляют SEM. ANOVA значение Р <0,05. (Б) представитель траектории последнее испытание для двух групп. (C) Среднее расстояние в 30 минут в открытом поле для мышей, которым вводили Мир выразив протестированы лентивирус (зеленый), карабкаться выразив лентивирус (красный) и ООН впрыском животных (синий). Никакой разницы в глобальной активности передвижения не была обнаружена (ANOVA P> 0.1). (Г) представитель траектории мышей из каждой группы (с).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стереотаксической инъекции лентивирус является относительно быстрый метод для прижизненного оценивать как вверх или вниз-регулирование различных генов и микроРНК. Основной альтернативой является генетически модифицированные мыши, который является намного более длительными и трудоемкими технике затем непосредственным впрыском лентивирусов. Кроме того, до регулирования, в лентивирус инъекций, происходит в определенное время у взрослых мышей и не включает любую возможность неплотности во время развития, как это чаще всего и бывает в генно-инженерных мышей, которые включают в себя временное управление. Полное временной контроль имеет важное значение при оценке актуальности различных генов при нейродегенеративных заболеваниях, в котором измененные регулирование происходит в конце жизни животного. Кроме того, лентивирусов инъекций обеспечивает точное пространственное управление, которое, опять же, в зависимости от определенного количества неплотности в генной инженерии систем. Инженерных систем мыши использовать эндогенныхNous специфику различных транскрипционных факторов, добавив вставку специфический промотор, который будет активирован только в определенном регионе или типа клеток. Для сравнения, лентивирусов инъекции могут быть ограничены в пространстве без изменения вектора. Недостатки лентивирус инъекции Требование хирургическая процедура трудоемкая и сомнительные воспроизводимость между лабораториями. После инъекции операции периода времени, от недели 3 недели должно пройти, что вирус может вызвать его влияние и на животных для восстановления, прежде чем дополнительные протоколы могут быть выполнены такие как поведенческие и биохимические оценок. Для исследований, в которых во время индукции должны быть в непосредственной близости от различных оценок вводили лентивирусов может включать в себя временные системы управления, например, Cre-Lox системы и антибиотики могут быть использованы в этом случае в качестве индуктора долго после животное полностью выздоровел. Эта техника была представлена в 13. Что касается Reproducibility между инъекциями, группы, которые выполняют этот метод регулярно показали довольно воспроизводимых адресности и доставки материала вводят между животными 13. Воспроизводимость между лабораториями является вопросом, который требует большой осторожности, так как разные лаборатории используют различные шприцы, различные типы шприца край (тупая или острая) и различные расходы, которые влияют на полученный сфере инъекции. В обоих методах позиционного эффекта за счет геномной сайт интеграции может произойти. В трансгенной линии следствием этого может быть генов во всей линейке. В лентивирусов вводили населения, с другой стороны, эффект будет ограничено небольшой части населения. Объединение микроРНК эксперименты вместе с ShRNA эксперименты в естественных условиях может пролить свет на специфику влияния определенных микроРНК на цель 6,8. Наконец, лентивирусов инъекции могут быть использованы в трансгенных мышей нокдауна для тестирования стук в действие в указанныйИК Регион мозга и служат для потери функции / спасательные функции экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Эдмонда и Лили Сафра Центр Brain Sciences (SB общение), наследие Наследие биомедицинских наук Программы партнерства Израиля научного фонда (грант № 378/11, с ГС) и немецкого израильского фонда научно Исследования и разработки (GIF) (грант № 1093-32.2/2010, чтобы HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
