Summary
小分子RNA在大脑的结构和功能有显着的作用。在这里，我们描述了一种方法来执行海马miRNA的过表达一个精心设计的miRNA表达慢病毒采用立体定向注射。这种方法可以作为一个相对快速的方式评估
Abstract
小分子RNA（miRNA）是监管小单约22个核苷酸长的双链RNA分子可能每个目标众多的mRNA转录和暗淡的整个基因表达通路诱导杀伤性和/或抑制翻译这些目标。一些miRNA的发挥关键作用，在维持神经元的结构和功能，并在更高级别的脑功能，寻求探索这些功能操作水平和方法。在这里，我们提出了一种直接在体内的方法强迫立体定向注射miRNA的编码病毒颗粒在小鼠体内多余的miRNA研究的认知后果。具体来说，目前的协议还包括海马CA1区，这有助于哺乳动物记忆的巩固，学习和应激反应，并提供了一个方便的注射部位注入。坐标测量，根据鼠标的前囟门和数字控制病毒的灌注，并保持很慢。注射后，手术伤口是密封的，动物的恢复。相应的靶mRNA编码消音服务慢病毒牵连特定miRNA /靶相互作用负责观察效果，天真的小鼠，小鼠注射用生理盐水与“空”的慢病毒载体作为对照组小鼠注射。一个月后注射，动物们检查Morris水迷宫（MWM）评估其导航的学习和记忆能力。 MWM是圆罐，充满了彩色水淹没水面1厘米以下的小平台。周围的坦克的稳态视觉线索允许空间导航（声音和地球磁场也可协助动物在导航）。视频摄像监控，使测量游的路线和时间，找到并达到平台。先教鼠标，安装隐藏的平台，提供了一个逃离强迫游泳，然后测试使用这种转义和f值为，该平台将被删除，探针测试检查，如果鼠标记得它以前的位置。连续几天的反复测试，突出改善性能测试小鼠在更短的延迟，是寻找和挂载平台，更直接的路线到达平台或位置。没有这样的代表减值改善学习记忆和/或焦虑，然后可以专门测试（ 如在高架十字迷宫）。这种方法使验证特定的miRNA在所研究的认知和/或压力相关的进程和目标成绩单。
Introduction
miRNA在神经系统功能的作用，尤其是最近已经慢病毒注射在几项研究中的挑战。已发现miRNA的维护和再塑造突触结构参数1 2，突触发生和突触重塑和维护3是至关重要的。这些研究有力地表明，miRNA的啮合时，通过多层次的调节作用，在形成和维持神经系统的主要输出，认知功能。立体定向注射慢病毒颗粒可以搜索到特定地区的啮齿类动物的大脑突触形态的改变和神经元的活动，并用于建立过表达的转录4,5的功能意义。义脑区的神经元与miRNA的表达慢病毒直接感染可能受到牵连老化，脑部疾病和神经退行性疾病的研究; miRNA的研究在行为调节6-8的境界是在一个远远低于先进国家，立体注射的miRNA表达慢病毒颗粒，然后通过行为测试等用途可能是有用的。诱导过度或不足表达相当费力的方法涉及遗传工程连锁或基因敲除小鼠。遗传系统可以进一步允许表达的条件和时间的控制（ 例如 ，春节系统CRE-LOX），但很难提供空间特异性注射过程几乎总是有一定量的泄漏。此外，工程程序并不需要手术治疗，可用于在实验室比较好的重现性，但是，他们是慢，需要更多的人力和财力。此外，时间控制的过表达小鼠注射准确得多遗传工程小鼠相比。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。慢病毒载体的制备
- HEK-293FT细胞增长到90％汇合。
- 上的天的的变动转染细胞培养基中无血清DMEM辅以用1mM谷氨酰胺和50 mg / ml的青霉素 - 链霉素。
- 共同转染的的细胞与pLKO.1迪普罗载体有质粒的编码为ΔR8.2和VSV-G部分和感兴趣的miRNA，用10微升的1毫克/毫升的聚乙烯亚胺作为载体9。
- 在24小时和48小时后转染，收集打包慢病毒过滤0.45微米的过滤器。
- 利用超速离心70,000 XG浓缩慢病毒，2小时和15℃，分装和储存在-70°C
- 测量病毒滴度感染的HEK-293T细胞与系列稀释的病毒制剂（载体，每孔1至10 -6毫升）。由此产生的滴度（最少〜1×10 9个感染性颗粒每毫升建议）评价表达锗NE的利益使用嘌呤霉素筛选，并通过量化表达GFP的病毒通过荧光细胞计数。
对于更详细的协议慢病毒制剂看到10。
2。准备进行手术的动物
- 外科医生的装束应包括手术衣，无菌手套，帽子和口罩。
- 称重动物，然后麻醉与IP-注射氯胺酮的混合物，与体积成比例的指定每种药物的动物体重。对于氯胺酮/赛拉嗪的混合物，剂量范围为80〜200毫克/千克氯胺酮和7-20毫克/公斤甲苯噻嗪通常用于老鼠。
- 等待，直到动物完全麻醉，然后检查缺乏撤退反射的动物后肢延伸肢体，然后用手指按它。
- 注入动物皮下Rimadyl，包装盒上的指定，止痛。典型剂量范围Rymadil的是5-10毫克。
- 将动物加热垫，以保持稳定的体温，用膏滋润眼睛。
- 剃须两个耳朵之间的区域，用修剪机。
- 用优碘消毒皮肤。
3。暴露的头骨和钻井
- 放置的动物内stereotact通过调整杆只是前动物的耳朵缝里。
- 使用一把手术刀使前后切口1.5厘米左右两耳之间，并保持它打开手术钳（serfines）的。
- 清洁棉签直到冠状缝和矢状缝之间的交集， 即前囟门和日冕之间的交集和人字缝， 也就是 lambda，头骨表面是可见的。
- 指向的注射器的前端，由stereotact持有，前囟点，在所有三个轴。写下的坐标。这点会被视为零婆int的所有三个轴。
- 提起注射器在垂直轴上，使平面运动不会划伤的头骨和注射器头移动到正确的位置。海马CA1区注射要求以下坐标相对毫米前囟门：-2，前/后的轴，±1.8和-1.5背/腹轴的横向/中轴。
- 放下注射器的尖端，直到它触及的头骨和标记的一个标记点。取下注射器，以避免刺伤。
- 钻一个浅洞，只能用细钻颅骨。保持稳定，所以它不会继续深入到软组织下面钻。可以防止这种稳住一方面与其他钻在很短的脉冲。
4。慢病毒注射液
- 取出0.5毫升浓缩的慢病毒溶液。
- 将注射器上面的孔，慢慢降低它垂直，直到它REACHES头骨表面。继续以降低注射器进入大脑非常缓慢。在此步骤中的一些可能发生的出血并不一定表示一个失败的渗透。如果发生出血拖把用棉签。
- 数字泵以0.02毫升/分钟（0.5微升，在25分钟内，将注入）设置，并开始输液。缓慢输注允许进行有效的病毒蔓延到组织中，并防止回流。在某些类型的注射器，注射器插入一个额外的深度为0.5毫米，前撤退到原来的坐标和泡制。
- 输液结束后等待5分钟，使材料扩散到大脑，而不是撤退到由注射器管形成。
- 取下注射器非常缓慢，并观看回流。如果在此步骤中观察到回流，注射材料的一小部分可能丢失。
5。伤口密封和恢复
- 密封THÉ伤口组织黏合剂。务必到避免泄漏histoacryl，进入眼睛。
- 注入动物腹腔（IP），预热生理盐水1毫升，以避免脱水。
- 将恢复笼中的动物，其定位在加热垫。关注的动物，而另外1小时恢复。
消瘦，食欲不振的情况下，无力/无法获得饲料或饮水中，濒死状态或感染的动物实施安乐死应该被执行。啮齿动物安乐死的可接受的方法是巴比妥类药物，吸入麻醉剂，CO 2，CO，或氯化钾与全身麻醉。
4〜6周后，评估动物的导航内存在Morris水迷宫中的评估。慢病毒通常会感染大多数细胞内注射球体。
6。在Morris水迷宫行为评估
- 训练动物在M鸢尾水迷宫。对于确切的训练和测试协议，见11。在每次试验之后，用干毛巾擦干动物，取代它在笼子里，并刷新水箱中的水。
- 连续3天，4项试验在Morris水迷宫测试动物的每一天。每天进入迷宫的4个方向的迷宫（北，南，东，西），在不断变化的顺序在每个插入的动物，例如一天：东西南北，日二：西部南北北东。每次试验后擦拭动物。
- 在试验过程中试验跟踪Noldus跟踪系统的跟踪系统，例如动物。
- 经过12 次的测试试验，插入动物到水箱一分钟而不平台。这将用于分析动物服用的搜索策略。
- 分析数据12中所建议的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
0.5微升慢病毒注射到小鼠海马CA1区的协议部分中的指示的流量，产生约1毫米的喙尾椎轴受感染的球体，大约0.5mm的内侧 - 外侧和前后的轴（ 图3）。
图1。前囟门点和喷射装置 。 （ 一 ）所示是一个示意图，地图的前囟门（冠状面和矢状面的缝合线交汇）和Lambda（人字矢状缝合路口）如执行切开后可见。 （二）有头像描绘立体定向装置的主要机械部件。
图2。慢病毒p的rincipal组件慢病毒包括组件，使抗病毒和感兴趣的基因有效地整合和表达的抗生素（Ampiciline，放大器ŗ），报道基因（GFP），5'和3'长末端重复序列（LTR） （miRNA）的。
图3。注射部位和在体内的慢病毒载体转染，（一 ）注射部位的根据鼠标图谱的。海马CA1区注射。 （二）绿色荧光蛋白定量任意单位（归在各个领域看到'绿色'的数量衡量）以及11片，每一个40微米厚，在喙尾椎轴。 （C，D，E和F）。具体领域上标明的位置图b中。 DAPI染色绿色在红色和绿色荧光蛋白。 点击这里查看大图 。
图4。 MWM。小鼠行为评估（a）平均延迟慢病毒表达一个特定的miRNA（MIR-X的身影，红色圆圈中，n = 10）和小鼠注射争夺表达的小鼠注射找到隐藏平台慢病毒（绿色三角形中，n = 10）。误差棒代表SEM。方差分析的P值<0.05。（二）（三）代表轨迹，两组的最后审判。平均距离在空旷的田野，30分钟内与米尔小鼠注射表达测试的慢病毒（绿色），争相表达慢病毒（红色）和未注射的动物（蓝色）。被确定在全局运动活性没有差异（方差分析P> 0.1），（四），（c）中从每个组小鼠的代表性轨迹。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
立体定向注射慢病毒是一个相对快速的方法，无论是向上或向下调节不同的基因和miRNA 在体内评估。主要的替代是一个遗传工程小鼠，这是一个更费时费力的技术，然后慢直喷。此外，向上调节，在慢病毒注射，在成年小鼠发生在一个特定的时间，并且不包括任何可能的泄漏在开发过程中，是最经常的情况下，包括时间控制遗传工程小鼠。不同的基因在神经退行性疾病中的调控改变的动物在生命后期发生的相关性进行评估时，完整的时间控制是必不可少的。此外，慢病毒注入提供了精确的空间控制，再次，是遗传工程系统泄漏到一定量。鼠标工程系统利用内源性理性不同的转录因子的特异性，通过添加特定的启动子的插入，只在一定的区域或细胞类型被激活。比较，慢病毒注射可以在空间的限制，不改变载体的情况下。慢病毒注射液的缺点是费力的手术过程和可疑实验室之间的重复性的要求。注射手术后，在一段时间内，一个星期和3星期之间必须通过病毒诱导的效果，动物恢复之前，可以执行额外的协议，例如行为和生化评估。在这种情况下，可以使用有关的研究中，诱导时间应该是在接近注入的慢病毒的不同的评估可以包括一个时间的控制系统，如Cre重组酶液氧系统，和抗生素作为诱导剂后动物完全恢复。这种技术，提出了在13个 。关于生殖注射ucibility之间，组执行此方法经常表现相当重复性的针对性和交付动物13之间的注射材料。实验室之间的可重复性是一个问题，需要非常谨慎，因为不同实验室使用不同的注射器，注射器边缘（钝性或锐）的不同类型，不同的流速，从而影响所得到的注射领域。在这两种方法中，由于基因的整合位点，可能会出现位置的影响。在转基因株系的后果将是整条生产线的基因沉默。另一方面，慢病毒注射人口，其影响将被限制到一个小的子集的人口。结合MIR实验一起shRNA的体内实验可以揭示其目标6,8的效果上有一定的miR的特异性。最后，慢病毒注射液可用于在转基因敲除小鼠测试敲入效果在一个具体的IC大脑区域功能/救援功能实验和服务的损失。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
这项研究已经得到了爱德蒙和莉莉·萨夫拉中心脑科学（SB奖学金），以色列科学基金会（批准号：378/11，HS）的遗产遗产生物医学科学合作计划和德国以色列科学基金会研究与发展（GIF）（批准号：1093-32.2/2010 HS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
