Summary
MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te beoordelen
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine reglementaire enkelstrengs RNA-moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang, dat kan elke doelgroep talrijke mRNA-transcripten en dim een hele genexpressie traject door het induceren van vernietiging en / of het remmen van vertaling van deze doelstellingen. Verschillende miRNAs een belangrijke rol spelen bij het handhaven van neuronale structuur en functie en in hogere hersenfuncties, en methoden worden gezocht voor het manipuleren van hun niveaus voor het verkennen van deze functies. Hier presenteren we een directe in-vivo methode voor de behandeling van de cognitieve gevolgen van gedwongen miRNAs overtollige bij muizen door stereotactische injectie van miRNA-codering virusdeeltjes. In het bijzonder, het huidige protocol omvat injectie in de hippocampus CA1 regio, wat bijdraagt aan zoogdieren geheugen consolidatie, leren, en stressrespons, en biedt een handige injectieplaats. De coördinaten worden gemeten volgens de muis bregma en virus perfusie digitaal gestuurd en zeer traag gehouden.Na injectie, wordt de operatie wond verzegeld en de dieren herstellen. Lentiviruses coderen geluiddempers van de overeenkomstige mRNA doelen dienen om de specifieke miRNA / target interactie verantwoordelijk zijn voor het waargenomen effect impliceren, met naïeve muizen, muizen geïnjecteerd met een zoutoplossing en muizen geïnjecteerd met "lege" lentivirus vectoren als controles. Een maand na de injectie worden de dieren onderzocht in het Morris Water Maze (MWM) voor het beoordelen van hun navigatie leren en geheugen capaciteiten. De MWM is een ronde tank gevuld met gekleurd water met een klein platform ondergedompeld 1 cm onder het wateroppervlak. Gestage visuele aanwijzingen rond de tank zorgen voor ruimtelijke navigatie (geluid en magnetische veld van de aarde kan ook de dieren te helpen navigeren). Videocamera controle maakt het meten van de route van zwemmen en de tijd te vinden en bedraagt het platform. De muis wordt eerst geleerd dat het monteren van de verborgen platform biedt een ontsnapping aan de gedwongen zwemmen, het wordt dan getest voor het gebruik van deze ontsnapping en fenslotte, wordt het platform verwijderd en probetesten onderzoeken of de muis onthoudt de vorige locatie. Herhaalde tests een aantal dagen achtereen markeren verbeterde prestaties van de geteste muizen op kortere wachttijden te vinden en monteren van het platform, en als meer directe routes naar het platform of de locatie te bereiken. Bij no-show dergelijke verbetering vertegenwoordigt slechtzienden leren en geheugen en / of angst, die dan specifiek kan worden getest (bv. in de verhoogde plus maze). Deze aanpak maakt validatie van specifieke miRNAs en target transcripten in de bestudeerde cognitieve en / of stress-gerelateerde processen.
Introduction
De rol van bepaalde miRNA's in het zenuwstelsel functioneren is onlangs uitgedaagd door lentivirale injectie in verschillende studies. MiRNAs zijn gevonden van cruciaal belang voor het behoud en het opnieuw vormgeven synaps structuur 1, synaptogenese 2 en synaps verbouwing en onderhoud 3 te zijn. Deze studies suggereren sterk dat miRNAs betrokken zijn, via multileveled regulerende effecten in zowel de vormgeving en het behoud van de hoofduitgang van het zenuwstelsel, cognitieve functie. Stereotactische injectie van lentivirus deeltjes in specifieke regio's in de knaagdieren hersenen in staat stelt te zoeken naar veranderingen in de synaps morfologie en neuronale activiteit, en werd gebruikt voor het vaststellen van de functionele betekenis van overexpressie gebrachte transcripten 4,5. Directe infectie van neuronen bij welbepaalde hersengebieden met miRNA-expressie lentiviruses kunnen worden betrokken bij studies van veroudering, hersenaandoeningen en neurodegeneratie; Studies van miRNAs in het gebied van 6-8 gedragregulatie zijn dan veel minder gevorderd stadium en stereotactische injectie van miRNA-expressie lentivirus deeltjes gevolgd door gedragstesten kunnen nuttig zijn voor deze doeleinden. Een aanzienlijk meer bewerkelijke methode voor het induceren van over-of onder-expressie impliceert genetisch gemanipuleerde knock-in of knock-out muizen. Genetische systemen kan verder zorgen voor voorwaardelijke en temporele controle van expressie (bijv. Cre-Lox, Tet systemen), maar deze hebben nauwelijks ruimtelijke specificiteit van de injectieprocedure en er is bijna altijd een zekere mate van lekkage. Ook moet je de technische procedures niet operatie nodig en kan over laboratoria met een relatief goede reproduceerbaarheid worden gebruikt, maar ze zijn langzamer en vereisen veel meer mankracht en financiële middelen. Bovendien, de temporele controle van de over-of onder-expressie in muizen geïnjecteerd veel nauwkeuriger vergelijking met genetisch gemanipuleerde muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lentivirus Voorbereiding
- Grow HEK-293FT cellen tot 90% confluentie.
- Op de dag van transfectie verandering celmedium aan serum-vrij DMEM aangevuld met 1 mM glutamine en 50 mg / ml penicilline-streptomycine.
- Co-transfecteren van de cellen met een pLKO.1-Puro vector en plasmiden coderend voor de delta R8.2 en VSV-G groepen en miRNA plaats, met 10 ui van 1 mg / ml polyethyleenimine als drager 9.
- Verzamel verpakte lentiviruses bij 24 uur en 48 uur na transfectie, filter door 0,45 urn filter.
- Concentreer de lentivirussen met ultracentrifuge bij 70.000 xg gedurende 2 uur en 15 ° C, hoeveelheid en bewaar bij -70 ° C.
- Maatregel virustiter door het infecteren HEK-293T cellen met serieel verdunde virus preparaten (1-10 -6 ml van vector per putje). De resulterende titer (minimaal 1 x 10 ~ 9 infectieuze deeltjes per ml wordt aanbevolen) geëvalueerd voor expressie van de gene van belang zijn, met behulp van puromycineselectie en door het kwantificeren van GFP uiten van virussen door het tellen van fluorescerende cellen.
Voor meer gedetailleerde protocol van lentivirus bereiding zie 10.
2. Voorbereiding Dieren voor Heelkunde
- Chirurgen gewaad moeten omvatten chirurgische toga, steriele handschoenen, muts en masker.
- Weeg het dier verdoven vervolgens met een IP-injectie van Ketamine mengsel, waarbij het volume evenredig met het gewicht van het dier zoals voor elk geneesmiddel. Voor een Ketamine / Xylazine mengsel wordt een dosisbereik van 80-200 mg / kg ketamine en 7-20 mg / kg xylazine meestal gebruikt voor muizen.
- Wacht totdat het dier volledig verdoofd, controleer dan bij gebrek aan terugtrekking reflex in de achterste ledematen van het dier door de uitbreiding van de ledematen en dan drukken met uw vinger.
- Injecteer het dier subcutaan met Rimadyl, zoals vermeld op de doos, voor pijnbestrijding. Typische dosisbereik voor Rymadil is 5-10 mg.
- Plaats het dier op een verwarmingselement om een constante lichaamstemperatuur te houden en bevochtig de ogen met zalf.
- Scheren het gebied tussen de twee oren met een afkortzaag.
- Ontsmetten van de huid met betadine.
3. Blootstelling van de Skull and Drilling
- Plaats het dier in de stereotact door aanpassing van de staven in de spleten anterieure oren van het dier.
- Gebruik een scalpel om een anterieure-posterieure incisie van ongeveer 1,5 cm tussen de oren te maken en open houden met chirurgie klemmen (serfines).
- Reinig het oppervlak van de schedel met een wattenstaafje schoon totdat het kruispunt tussen de coronale hechtdraad en sagittale hechtingen, namelijk het bregma en de kruising tussen de coronale en lambdoïde hechtingen, dwz lambda, zijn zichtbaar.
- Richt de tip van de injectiespuit, die de stereotact, de bregma punt bij alle drie assen. Noteer de coördinaten. Dit punt zou worden beschouwd als de nul-point in alle drie assen.
- Til de spuit in de verticale as, zodat een vlakke beweging niet zou krassen op de schedel en beweeg de spuit kop naar de juiste locatie. Hippocampus CA1 injecties nodig de volgende coördinaten ten opzichte van de bregma in mm: -2 op de voorste / achterste as, ± 1.8 aan de laterale / mediale as en -1,5 op de dorsale / ventrale as.
- Laat de punt van de spuit totdat deze tegen de schedel en markeer de plek met een marker. Verwijder de spuit weer om te voorkomen dat steken.
- Boor een ondiep gat, alleen in de schedel bot met een fijne boor. Houdt de boormeester gestage dus het zou niet blijven boren in het zachte weefsel eronder. U kunt dit voorkomen door stil houden enerzijds met de andere en door het boren in korte pulsen.
4. Injectie van de Lentivirus
- Zuig 0,5 ml van de geconcentreerde oplossing lentivirus.
- Plaats de spuit boven het gat en langzaam lager het verticale stand tot het reaches het oppervlak van de schedel. Doorgaan met de spuit laten zakken in de hersenen heel langzaam. Bij deze stap kan enige bloeding voordoen die niet noodzakelijkerwijs hoeft te houden dat mislukt penetratie. Als bloeden optreedt dweilen het met een wattenstaafje.
- Stel de digitale pomp tot 0,02 ml / min (0,5 pl worden geïnjecteerd in 25 min) en infuus starten. Langzame infusie maakt effectieve verspreiding van het virus in het weefsel en verhindert terugstroming. Bij sommige soorten spuit overwegen het plaatsen van de spuit voor een extra diepte van 0,5 mm, voordat u aan originele coördinaten en infusie.
- Na infusie voltooid wachten extra 5 minuten om het materiaal te verspreiden in de hersenen plaats terugtrekkende terug in het kanaal gevormd door de spuit.
- Verwijder de spuit heel langzaam en kijk voor terug stromen. Als een terugstroming wordt waargenomen bij deze stap, werd een fractie van de geïnjecteerde materiaal waarschijnlijk verloren.
5. Wond Afdichting en herstel
- Afdichting the wond met Histoacryl. Zorg ervoor dat u voorkomen dat lekken van de Histoacryl in de ogen.
- Injecteer het dier intraperitoneaal (IP) met 1 ml voorverwarmd zoutoplossing, om uitdroging te voorkomen.
- Plaats het dier in een herstelkooi die is geplaatst op een verwarmd kussen. Kijken naar het dier, terwijl het herstelt nog een uur.
In het geval van gewichtsverlies, gebrek aan eetlust, moet zwakte / onvermogen om voer of water, stervende toestand of infectie, euthanasie van het dier te verkrijgen worden uitgevoerd. Aanvaardbare methoden voor euthanasie van knaagdieren zijn barbituraten, inhalatie anesthetica, CO 2, CO, of kaliumchloride in combinatie met algehele anesthesie.
Na 4 tot 6 weken, beoordeelt navigatie geheugen van het dier wordt beoordeeld in de Morris Water Maze. De lentivirus meestal infecteren meeste cellen in de injectie bol.
6. Behavioral Assessment in de Morris Water Maze
- Train de dieren in de Mlis Water Maze. Voor exacte opleidingen en testprotocol zie 11. Na elke proef, droogt het dier met een droge handdoek, te vervangen in zijn kooi en verversen van het water in de tank.
- Test de dieren in de Morris Water Maze gedurende 3 opeenvolgende dagen, 4 tests per dag. Elke dag plaatst u het dier in de doolhof in elk van de 4 richtingen van het doolhof (noord, zuid, oost en west) in een veranderende volgorde, bijvoorbeeld een dag: oost-west-noord-zuid, dag twee: west-zuid -Noord-Oost. Veeg de dieren na elke proef.
- Tijdens de proef studies volgen het dier met een volgsysteem zoals Noldus volgsysteem.
- Na de 12 e proefproces, plaatst u het dier in het waterreservoir zonder het platform voor een minuut. Dit wordt gebruikt om het zoeken strategie het dier neemt analyseren.
- Analyseer de gegevens zoals voorgesteld in 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injectie van 0,5 ul lentivirus in het CA1 gebied in de muis hippocampus, de stroomsnelheid die in de paragraaf protocol levert een geïnfecteerde gebied van ongeveer 1 mm in de rostrale-caudale as en ongeveer 0,5 mm in de mediale-laterale en anterieure -posterieure as (figuur 3).
Figuur 1. Bregma point en injectie-inrichting. (A) Afgebeeld is een schematische kaart van de Bregma (coronale en sagittale hechtingen kruising) en Lambda (lambdoïde en sagittale hechtingen kruising) zoals te zien is na het uitvoeren van de incisie. (B) Picture beeltenis van de belangrijkste mechanische onderdelen van de stereotactische apparaat.
Figuur 2. Lentivirus pELANGRIJKSTE onderdelen. Het lentivirus onderdelen bevat weerstand effectieve integratie en expressie van het virus en het gen van belang in staat stellen antibiotica (ampicilline, Amp R), een reporter-gen (GFP), 5 'en 3' lange terminale herhalingen (LTR) (miRNA).
Figuur 3. Injectieplaats en in vivo Lentivirus transfectie. (A) de plaats van injectie volgens de muis atlas. Injectie wordt naar de CA1 gebied van de hippocampus. (B) GFP kwantificering in willekeurige eenheden (genormaliseerde maat voor de hoeveelheid van "groene" gezien in elk gebied) langs 11 segmenten, elk 40 urn dik, in de rostrale-caudale as. (C, d, e en f). Specifieke gebieden voor de posities die op hetgrafiek in b. DAPI kleuring in rood en GFP in het groen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Gedragsbeoordeling van muizen in de MWM. (A) gemiddelde latentie om het verborgen platform te vinden voor muizen geïnjecteerd met lentivirus expressie van een bepaalde miRNA (aangeduid miR-X in de figuur, rode cirkels, n = 10) en muizen geïnjecteerd met de scramble expressing lentivirus (groene driehoeken, n = 10). Fout balken geven SEM. ANOVA p-waarde <0,05. (B) Representatieve trajecten van de laatste proef voor de twee groepen. (C) gemiddelde afstand in 30 min in het open veld voor muizen geïnjecteerd met de miR expressie getest lentivirus (groen), klauteren uiten lentivirus (rood) en niet-geïnjecteerde dieren (blauw). Geen verschil in de globale locomotie activiteit werd geïdentificeerd (ANOVA P> 0,1). (D) Representatieve trajecten van muizen uit elke groep (c).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotactische injectie van een lentivirus is een relatief snelle methode voor in vivo evaluatie voor zowel up-of down-regulatie van verschillende genen en miRNAs. Het belangrijkste alternatief is een genetisch gemanipuleerde muis wat een veel meer arbeidsintensief en tijdrovend techniek dan direct lentivirus injectie. Bovendien, de omhoog regulering, in lentivirus injectie plaats op een bepaald tijdstip in de volwassen muis en de mogelijkheid van lekkage omvat niet tijdens de ontwikkeling, zoals meestal het geval is in de genetisch gemanipuleerde muizen die temporele controlestructuur. Volledige temporele controle essentieel bij de beoordeling van de relevantie van de verschillende genen in neurodegeneratieve ziekten waarbij de gewijzigde regeling optreedt laat in het leven van het dier. Bovendien, lentivirus injectie een nauwkeurig ruimtelijk control die nogmaals onderworpen aan een zekere lekkage in de genetisch gemanipuleerde systemen. De muis technische systemen maken gebruik van de endogenous specificiteit van verschillende transcriptiefactoren door toevoeging van een inzetstuk van een specifieke promotor die geactiveerd worden slechts in een bepaalde regio of celtype. In vergelijking, lentivirus injecties in de ruimte beperkt zonder de vector. De nadelen van lentivirus injectie zijn de vereiste van een moeizame operatie en twijfelachtige reproduceerbaarheid tussen laboratoria. Na de injectie operatie moet een periode tussen een week en 3 weken slaagden voor het virus om het effect te induceren en om het dier te herstellen, voordat aanvullende protocollen kan worden uitgevoerd zoals gedrags-en biochemische evaluaties. Voor studies waarbij de inductiefase moet in de nabijheid van de verschillende beoordelingen de geïnjecteerde lentivirus kan een tijdelijk systeem, zoals het Cre-Lox-systeem en antibiotica bevatten kunnen worden toegepast in een dergelijk geval de inductor lang na de dier volledig hersteld. Deze techniek werd in 13. Betrekking afb.ucibility tussen de injecties, hebben groepen die deze methode routinematig uitvoeren van een redelijk reproduceerbare doelgerichtheid en de levering van de geïnjecteerde materiaal tussen dieren 13 toonden. Reproduceerbaarheid tussen laboratoria is een zaak die veel zorg nodig, aangezien verschillende laboratoria maken gebruik van verschillende spuiten, verschillende soorten rand spuit (stomp of scherp), en verschillende debieten, waardoor de resulterende injectie sfeer beïnvloeden. In beide werkwijzen positioneel effect door genomische integratieplaats optreden. In de transgene lijn zou de consequentie gene silencing in de hele lijn. In het lentivirus geïnjecteerd bevolking, anderzijds, het effect zou worden beperkt tot een kleine subset van de populatie. Samen combineren miR experimenten met shRNA experimenten in vivo kan licht werpen op de specificiteit van het effect van een bepaalde miR op zijn doel 6,8. Ten slotte kan lentivirus injectie in een transgene muis knockdown voor het testen van een knock-in effect in een speic hersengebied en dienen voor een verlies van functie / rescue-experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Edmond en Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program van de Israel Science Foundation (Grant No 378/11, naar HS) en de Duitse Israëlische Stichting Wetenschappelijk Onderzoek en ontwikkeling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, naar HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
