Summary
MicroRNAs har betydande roller i hjärnans struktur och funktion. Här beskriver vi en metod för att genomdriva hippocampus miRNA överuttryck med stereotaktisk injektion av en konstruerad miRNA-uttryckande lentivirus. Detta tillvägagångssätt kan fungera som ett relativt snabbt sätt att bedöma
Abstract
MicroRNAs (miRNA) är små reglerande enda RNA-molekyler omkring 22 nukleotider långa, som kan varje avsedd många mRNA-transkript och dämpa en hel genuttryck pathway genom att inducera förstörelse och / eller hämma översättning av dessa mål. Flera miRNA spelar viktiga roller för upprätthållandet av neuronal struktur och funktion och i högre nivå hjärnfunktioner, och metoder söks för att manipulera sina nivåer för att utforska dessa funktioner. Här presenterar vi en direkt in vivo metod för att undersöka de kognitiva konsekvenserna av påtvingade miRNA överskott i möss genom stereotaktisk injektion av miRNA-kodande viruspartiklar. Konkret innebär det nuvarande protokollet injektion i hippocampus CA1 regionen, vilket bidrar till däggdjur minne konsolidering, lärande och stressreaktioner, och erbjuder en bekväm injektionsstället. Koordinaterna mäts enligt musens bregma och virus perfusion styrs digitalt och hållas mycket långsamt.Efter injektion, är operationen såret tillslöts och djuren återhämta sig. Lentiviruses kodar ljuddämpare av motsvarande mRNA målen tjänar till att blanda in den specifika miRNA / mål interaktion som ansvarar för den observerade effekten, med naiva möss, möss som injicerats med koksaltlösning och möss som injicerats med "tomma" lentivirus vektorer som kontroller. En månad efter injektion, djuren undersöks i Morris Water Maze (MWM) för att bedöma deras navigering lärande och förmågor minne. Den MWM är en rund tank fylld med färgat vatten med en liten plattform nedsänkt 1 cm under vattenytan. Steady visuella ledtrådar kring tanken möjliggöra för rumslig navigering (ljud och jordens magnetfält kan också hjälpa djuren att navigera). Video kamera övervakning gör det möjligt att mäta vilken rutt simma och tid att hitta och uppgå plattformen. Musen är först lärde att montera den dolda plattformen erbjuder en flykt från den påtvingade simma, det testas sedan för att använda denna flykt och finally är plattformen avlägsnas och probe test undersöker om musen minns sin tidigare plats. Upprepade tester under flera dagar i följd markerar förbättrad prestanda testade möss vid kortare latenser hitta och montera plattformen, och som mer direkta vägar för att nå plattformen eller dess plats. Underlåtenhet att visa sådan förbättring representerar försämrad inlärning och minne och / eller ångest, vilket sedan kan testas specifikt (t.ex. i förhöjda plus labyrint). Detta tillvägagångssätt möjliggör validering av specifika miRNA och avskrifter mål i studerade kognitiva och / eller stressrelaterade processer.
Introduction
Rollen av särskilda miRNA i nervsystemet funktion har nyligen ifrågasatts av lentiviral injektion i flera studier. MiRNA har visat sig vara avgörande för att upprätthålla och omforma synaps struktur 1, synaptogenesis 2 och synaps ombyggnad och underhåll 3. Dessa studier tyder starkt på att miRNA är engagerade, via multileveled reglerande effekter i både forma upp och bevara huvudutgång av nervsystemet, kognitiv funktion. Stereotaktisk injektion av lentivirus partiklar i specifika regioner i gnagare hjärnan kan söka efter förändringar i synaps morfologi och neuronal aktivitet, och användes för att fastställa den funktionella betydelsen av över-uttryckta transkript 4,5. Direkt smitta av nervceller vid väldefinierade hjärnområden med miRNA-uttryckande lentiviruses kan vara inblandad i studier av åldrande, sjukdomar i hjärnan och neurodegeneration, Studier av miRNAs i sfären av beteendemässiga reglering 6-8 är på en betydligt mindre framskridet, och stereotaktisk injektion av miRNA-uttryckande lentivirus partiklar följt av beteendemässiga tester kan vara användbara för sådana ändamål. En betydligt mer arbetskrävande metod för att framkalla över-eller under-uttryck inbegriper genetiskt knock-in eller möss knockout. Genetiska system kan vidare medge villkorat och temporal kontroll på uttrycket (t.ex. Cre-Lox, Tet-system), men dessa knappast erbjuda den rumsliga specificitet injektionen och det finns nästan alltid ett visst mått av läckage. Dessutom kräver de tekniska förfarandena inte kirurgi och kan användas över laboratorier med relativt god reproducerbarhet, men de är långsammare och kräver mycket mer arbetskraft och ekonomiska resurser. Dessutom, den temporal kontroll över-eller under-uttryck i injicerade möss är betydligt mer exakt jämfört med genetiskt modifierade möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Lentivirus Framställning
- Grow HEK-293FT celler till 90% konfluens.
- På dagen för transfektion förändring cellmedium till serumfritt DMEM kompletterat med 1 mM glutamin och 50 mg / ml penicillin-streptomycin.
- Co-transfektera cellerna med en pLKO.1-Puro vektor och med plasmider som kodar för delta-R8.2 och VSV-G-grupper och miRNA av intresse, med användning av 10 pl av 1 mg / ml polyetylenimin som bärare 9.
- Samla förpackade lentivirus vid 24 h och 48 h efter transfektion, filtrera genom 0,45 um filter.
- Koncentrera lentiviruses med ultracentrifugering i 70.000 xg under 2 timmar och 15 ° C, alikvot och förvara vid -70 ° C.
- Mät virustiter genom att infektera HEK-293T-celler med serieutspädda viruspreparat (1-10 -6 ml av vektor per brunn). Den resulterande titern (ett minimum av ~ 1 × 10 9 infektiösa partiklar per ml rekommenderas) utvärderas för expression av GEn av intresse, med hjälp puromycinselektion och genom att kvantifiera GFP-uttryckande virus genom att räkna fluorescerande celler.
För mer detaljerat protokoll av lentivirus framställning se 10.
2. Förbereda djur för kirurgi
- Kirurger dräkt bör omfatta Operationsrock, sterila handskar, mössa och mask.
- Väg djuret, sedan söva den med en IP-injektion av en ketamin blandning, med volymen proportionell mot djurets vikt som anges för varje läkemedel. För en ketamin / xylazin blandning, ett dosintervall av 80-200 mg / kg Ketamin och 7-20 mg / kg Xylazin vanligtvis används för möss.
- Vänta tills djuret är helt bedövad, så kolla om bristande tillbakadragande reflex i bakbenet hos djuret genom att förlänga benet och sedan trycka på det med fingret.
- Injicera djuret subkutant med Rimadyl, som anges på förpackningen, för smärtlindring. Typiska dosintervall för Rymadil är 5-10 mg.
- Placera djuret på en värmedyna för att hålla en jämn kroppstemperatur och fukta ögonen med salva.
- Raka området mellan de två öronen med en putsning maskin.
- Desinficera huden med betadin.
Tre. Exponering av Skull and Drilling
- Placera djuret inuti stereotact genom att justera stängerna in i sprickor bara anterior till djurets öron.
- Använd en skalpell för att göra en anterior-posterior snitt på ca 1,5 cm mellan öronen och hålla den öppen med kirurgi klämmor (serfines).
- Rengör ytan av skallen med en bomullstuss tills skärningspunkten mellan kronsömmen och sagittal suturer, dvs bregma och skärningspunkten mellan de frontala och lambdoid suturer, dvs lambda, är synliga.
- Rikta spetsen på sprutan, som innehas av stereotact, till bregma punkt, vid alla tre axlarna. Skriv ner koordinaterna. Denna punkt skulle betraktas som noll point i alla tre axlarna.
- Lyft sprutan i den vertikala axeln så att en plan rörelse inte skulle repa skallen och flytta sprutan huvudet till rätt plats. Hippocampus CA1 injektioner kräver följande koordinater i förhållande till bregma i mm: -2 vid främre / bakre axeln, ± 1,8 vid laterala / mediala axeln och -1.5 vid dorsal / ventral axel.
- Sänk spetsen på sprutan tills den vidrör skallen och markera platsen med en markör. Ta sprutan tillbaka för att undvika stickande.
- Borra ett grunt hål, bara i skallbenet med en fin borrare. Håll borraren stadigt så att den inte skulle fortsätta att borra i den mjuka vävnaden under. Du kan förhindra detta genom att stabiliserande ena handen med den andra och genom att borra i korta pulser.
4. Injektion av Lentivirus
- Drag upp 0,5 ml av den koncentrerade lösningen lentivirus.
- Placera sprutan ovanför hålet och sakta sänka den vertikalt tills det REAches ytan av skallen. Fortsätt att sänka sprutan i hjärnan mycket långsamt. Vid detta steg några blödningar kan uppstå vilket inte nödvändigtvis en misslyckad penetration. Om blödning uppstår tvätta det med en bomullspinne.
- Ställ in digital pumpen till 0,02 ml / min (0,5 | il skulle injiceras i 25 min) och starta infusionen. Långsam infusion möjliggör effektiv spridning av viruset in i vävnaden och förhindrar baksug. I vissa spruttyper överväga att föra in sprutan för en extra djup av 0,5 mm innan reträtt till ursprungliga koordinater och infusion.
- Efter infusionen är avslutad vänta på ytterligare 5 min för att låta materialet att sprida in i hjärnan i stället för att dra sig tillbaka tillbaka in i kanalen som bildas av sprutan.
- Ta sprutan mycket långsamt och titta för rygg flöden. Om ett tillbakaflöde observeras i detta steg, var en fraktion av det injekterade materialet förmodligen förlorat.
Fem. Försegling av sår och återställning
- Seal the lindad med Histoacryl. Var noga med att undvika läckage av Histoacryl i ögonen.
- Injicera djuret intraperitonealt (IP) med 1 ml förvärmd saltlösning, för att undvika uttorkning.
- Placera djuret i en återhämtning bur som är placerad på en uppvärmd dyna. Titta djuret medan det återvinner under ytterligare en timme.
Vid viktminskning, aptitlöshet, bör svaghet / oförmåga att erhålla foder eller vatten, döende tillstånd eller infektion, dödshjälp av djuret skall utföras. Godtagbara metoder för avlivning av gnagare är barbiturater, anestetika inhalant, CO 2, CO, eller kaliumklorid i samband med narkos.
Efter 4 till 6 veckor, bedöma djurets navigation minne bedöms i Morris Water Maze. Den lentivirus kommer oftast infektera de flesta celler i injektionen sfären.
6. Behavioral Bedömning i Morris Water Maze
- Tåg djuren i Miris Water Maze. För exakt träning och testprotokoll se 11. Efter varje försök, torka djuret med en torr handduk, byt ut den i sin bur och uppdatera vattnet i tanken.
- Testa djuren i Morris Water Maze för tre på varandra följande dagar, fyra prövningar varje dag. Varje dag sätter djuret in i labyrinten i varje av de 4 riktningarna i labyrinten (nord, syd, öst och väst) i en föränderlig ordning, till exempel dag ett: öst-väst-nord-syd, dag två: väst-syd -nordöst. Torka djuren efter varje försök.
- Under testet prövningar spåra djur med ett spårningssystem såsom Noldus spårningssystem.
- Efter 12: e Testförsöket sätter djuret i vattenbehållaren utan en plattform för en minut. Detta skulle kunna användas för att analysera söka strategin djuret tar.
- Analysera data som föreslås i 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektion av 0,5 pl lentivirus i CA1 regionen i mössens hippocampus, med flödeshastigheten anges i protokollet avsnittet ger en infekterad sfär av ca 1 mm i rostral-caudal axeln, och ca 0,5 mm i den mediala-laterala och främre -bakre axlar (Figur 3).
Figur 1. Bregma punkt och injektionsanordningen. (A) På bilden visas en schematisk karta över Bregma (koronala och sagittal suturer korsning) och Lambda (lambdoid och sagittal suturer korsning) som ses efter att utföra snittet. (B) Bilden som visar de viktigaste mekaniska komponenterna i den stereotaktiska anordningen.
Figur 2. Lentivirus pE VIKTIGASTE komponenter. lentivirus innehåller komponenter som möjliggör antibiotikaresistens (Ampiciline, Amp R), en reporter gen (GFP), 5 'och 3' långa upprepningar terminal (LTR) för en effektiv integrering och uttryck av viruset och genen av intresse (miRNA).
Figur 3. Injektionsstället och in vivo Lentivirus transfektion. (A) vid injektionsstället enligt musen atlas. Injektion är inriktad på CA1 regionen av hippocampus. (B) GFP kvantifiering i godtyckliga enheter (normaliserat mått på mängden av "gröna" sett i varje fält) längs 11 skivor, var och en 40 um tjock, i rostralt-caudal axeln. (C, d, e och f). Särskilda områden för de som markerats pågrafen i b.. DAPI färgning i rött och GFP i grönt. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Behavioral bedömning av möss i MWM. (A) Genomsnittlig latens för att hitta den dolda plattformen för möss som injicerats med lentivirus som uttrycker en viss miRNA (betecknad miR-X i figuren, röda cirklar, n = 10) och möss injicerade med scramble uttrycker lentivirus (gröna trianglar, n = 10). Felstaplar representerar SEM. ANOVA P-värde <0,05. (B) Representativa banor i sista försöket för de två grupperna. (C) Medeldistans i 30 min i det öppna fältet för möss som injicerats med MIR uttrycker testat lentivirus (grön), förvanskar uttrycker lentivirus (röd) och un-injicerade djur (blå). Ingen skillnad i den globala locomotion aktiviteten identifierades (ANOVA P> 0,1). (D) Representativa banor av möss från varje grupp i (C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaktisk injektion av en lentivirus är en relativt snabb metod för in vivo-bedömningar för både upp-eller nedreglering av olika gener och miRNA. Det främsta alternativet är en genetiskt modifierad mus som är en mycket mer mödosam och tidskrävande teknik sedan direkt lentivirus injektion. Dessutom uppreglering i lentivirus injektion, sker vid en viss tidpunkt i vuxen mus och omfattar inte någon möjlighet till läckage under utveckling, så är det oftast så i genetiskt modifierade möss som inkluderar temporal kontroll. Komplett temporal kontroll är nödvändig vid bedömningen av relevansen av olika gener i neurodegenerativa sjukdomar där den förändrade regleringen inträffar sent i livet av djuret. Dessutom erbjuder lentivirus injektion exakt rumslig kontroll som, återigen, är föremål för en viss leakiness i de genetiskt manipulerade system. Musens tekniska system utnyttja endogenous specifika dragen för olika transkriptionsfaktorer genom att lägga en insats av en specifik promotor som skulle aktiveras endast i en viss region eller celltyp. I jämförelse kan lentivirus injektioner begränsas i rymden utan att ändra vektorn. Nackdelarna med lentivirus injektion är kravet på en mödosam kirurgiska ingrepp och tvivelaktiga reproducerbarhet mellan laboratorier. Efter injektionen operation, måste en tidsperiod, mellan en vecka och tre veckor passera för viruset att inducera sin effekt och för djuret att återhämta sig, innan ytterligare protokoll kan utföras såsom beteende-och biokemiska bedömningar. För studier i vilka tiden för induktion ska finnas i nära anslutning till de olika bedömningarna den injicerade lentivirus kan innehålla en tidsmässig styrsystem, t.ex. Cre-Lox-systemet, och antibiotika kan användas i ett sådant fall som inducerare långt efter djur helt återställd. Denna teknik presenterades 13. Beträffande Reproducibility mellan injektionerna, har grupper som utför denna metod rutinmässigt visade en tämligen reproducerbar målinriktning och leverans av injicerade materialet mellan djur 13. Reproducerbarhet mellan laboratorier är en fråga som kräver stor försiktighet, eftersom olika laboratorier använder olika sprutor, olika typer av sprutan kanten (trubbig eller vass), och olika flöden, som påverkar den resulterande injektionen sfären. I båda metoderna en positionell effekt på grund av genomisk integrationsstället kan uppstå. I den transgena linjen följden skulle vara geners uttryck i hela raden. I den injicerade lentivirusen befolkning, å andra sidan, skulle effekten vara begränsad till en liten delmängd av befolkningen. Kombinera miR experiment tillsammans med shRNA experiment in vivo kan belysa specificiteten av effekten av en viss miR på sitt mål 6,8. Slutligen kan lentivirus injektion användas i en transgen knockdown mus för att testa en knock-in effekt i en specifikic hjärna region och tjäna för en förlust av funktion / räddning av funktionen experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie har fått stöd av Edmond och Lily Safra Center for Brain Sciences (SB gemenskap), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program i Israel Science Foundation (Grant nr 378/11, till HS) och den tyska israeliska Foundation for Scientific Forskning och utveckling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, till HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
