Stereotaktisk injektion av MicroRNA-uttryckande Lentiviruses till musen Hippocampus CA1 Region och bedömning av de Behavioral Utfall
Summary
MicroRNAs har betydande roller i hjärnans struktur och funktion. Här beskriver vi en metod för att genomdriva hippocampus miRNA överuttryck med stereotaktisk injektion av en konstruerad miRNA-uttryckande lentivirus. Detta tillvägagångssätt kan fungera som ett relativt snabbt sätt att bedöma<em> In vivo</em> Effekter av över-uttryckta miRNA i specifika delar av hjärnan.
Abstract
MicroRNAs (miRNA) är små reglerande enda RNA-molekyler omkring 22 nukleotider långa, som kan varje avsedd många mRNA-transkript och dämpa en hel genuttryck pathway genom att inducera förstörelse och / eller hämma översättning av dessa mål. Flera miRNA spelar viktiga roller för upprätthållandet av neuronal struktur och funktion och i högre nivå hjärnfunktioner, och metoder söks för att manipulera sina nivåer för att utforska dessa funktioner. Här presenterar vi en direkt in vivo metod för att undersöka de kognitiva konsekvenserna av påtvingade miRNA överskott i möss genom stereotaktisk injektion av miRNA-kodande viruspartiklar. Konkret innebär det nuvarande protokollet injektion i hippocampus CA1 regionen, vilket bidrar till däggdjur minne konsolidering, lärande och stressreaktioner, och erbjuder en bekväm injektionsstället. Koordinaterna mäts enligt musens bregma och virus perfusion styrs digitalt och hållas mycket långsamt.Efter injektion, är operationen såret tillslöts och djuren återhämta sig. Lentiviruses kodar ljuddämpare av motsvarande mRNA målen tjänar till att blanda in den specifika miRNA / mål interaktion som ansvarar för den observerade effekten, med naiva möss, möss som injicerats med koksaltlösning och möss som injicerats med "tomma" lentivirus vektorer som kontroller. En månad efter injektion, djuren undersöks i Morris Water Maze (MWM) för att bedöma deras navigering lärande och förmågor minne. Den MWM är en rund tank fylld med färgat vatten med en liten plattform nedsänkt 1 cm under vattenytan. Steady visuella ledtrådar kring tanken möjliggöra för rumslig navigering (ljud och jordens magnetfält kan också hjälpa djuren att navigera). Video kamera övervakning gör det möjligt att mäta vilken rutt simma och tid att hitta och uppgå plattformen. Musen är först lärde att montera den dolda plattformen erbjuder en flykt från den påtvingade simma, det testas sedan för att använda denna flykt och finally är plattformen avlägsnas och probe test undersöker om musen minns sin tidigare plats. Upprepade tester under flera dagar i följd markerar förbättrad prestanda testade möss vid kortare latenser hitta och montera plattformen, och som mer direkta vägar för att nå plattformen eller dess plats. Underlåtenhet att visa sådan förbättring representerar försämrad inlärning och minne och / eller ångest, vilket sedan kan testas specifikt (t.ex. i förhöjda plus labyrint). Detta tillvägagångssätt möjliggör validering av specifika miRNA och avskrifter mål i studerade kognitiva och / eller stressrelaterade processer.
Introduction
Rollen av särskilda miRNA i nervsystemet funktion har nyligen ifrågasatts av lentiviral injektion i flera studier. MiRNA har visat sig vara avgörande för att upprätthålla och omforma synaps struktur 1, synaptogenesis 2 och synaps ombyggnad och underhåll 3. Dessa studier tyder starkt på att miRNA är engagerade, via multileveled reglerande effekter i både forma upp och bevara huvudutgång av nervsystemet, kognitiv funktion. Stereotaktisk injektion av lentivirus partiklar i specifika regioner i gnagare hjärnan kan söka efter förändringar i synaps morfologi och neuronal aktivitet, och användes för att fastställa den funktionella betydelsen av över-uttryckta transkript 4,5. Direkt smitta av nervceller vid väldefinierade hjärnområden med miRNA-uttryckande lentiviruses kan vara inblandad i studier av åldrande, sjukdomar i hjärnan och neurodegeneration, Studier av miRNAs i sfären av beteendemässiga reglering 6-8 är på en betydligt mindre framskridet, och stereotaktisk injektion av miRNA-uttryckande lentivirus partiklar följt av beteendemässiga tester kan vara användbara för sådana ändamål. En betydligt mer arbetskrävande metod för att framkalla över-eller under-uttryck inbegriper genetiskt knock-in eller möss knockout. Genetiska system kan vidare medge villkorat och temporal kontroll på uttrycket (t.ex. Cre-Lox, Tet-system), men dessa knappast erbjuda den rumsliga specificitet injektionen och det finns nästan alltid ett visst mått av läckage. Dessutom kräver de tekniska förfarandena inte kirurgi och kan användas över laboratorier med relativt god reproducerbarhet, men de är långsammare och kräver mycket mer arbetskraft och ekonomiska resurser. Dessutom, den temporal kontroll över-eller under-uttryck i injicerade möss är betydligt mer exakt jämfört med genetiskt modifierade möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaktisk injektion av en lentivirus är en relativt snabb metod för in vivo-bedömningar för både upp-eller nedreglering av olika gener och miRNA. Det främsta alternativet är en genetiskt modifierad mus som är en mycket mer mödosam och tidskrävande teknik sedan direkt lentivirus injektion. Dessutom uppreglering i lentivirus injektion, sker vid en viss tidpunkt i vuxen mus och omfattar inte någon möjlighet till läckage under utveckling, så är det oftast så i genetiskt modifierade möss som ink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har fått stöd av Edmond och Lily Safra Center for Brain Sciences (SB gemenskap), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program i Israel Science Foundation (Grant nr 378/11, till HS) och den tyska israeliska Foundation for Scientific Forskning och utveckling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, till HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
