Summary
전신 저혈압과 함께 양측 경동맥 폐색 재현 심각도 해마에 손상 쥐 세계적인 뇌 허혈을 생산하고 있습니다. 동물의 주제는 뇌 손상의 예측 패턴 장애인, 그들은 적당하게 복구하고, 사망률은 상대적으로 낮다.
Abstract
소생 뒤에 심장 마비는 종종 허혈 뇌의 후속 재관류에 의한 극적인 뇌 손상 발생합니다. 글로벌 두뇌 국소 빈혈 빈혈 1에 매우 민감한 것으로 나타 특정 뇌 영역에 손상을 생산하고 있습니다. 해마의 뉴런은 특히 다른 세포 집단과 비교하여 허혈성 모욕 높은 감도를 가지고 해마의 CA1 지역은 허혈 / 재관류 2에 특히 취약합니다.
치료 개입, 또는 뇌 손상에 관련된 메커니즘 연구의 설계는 임상 상태와 유사한 재현 방식으로 손상을 생산하는 모델을 필요로한다. 저혈압과의 양자 경동맥 혈관 폐색 (2VOH) 심장 마비와 심폐 소생술 중에 발생할 수있는 대뇌 이벤트를 에뮬레이트 가역 전뇌 허혈을 생산하는 모델입니다. 우리는 스미스 등의 수정 모델에 대해 설명합니다. (1984) 2같은 첫 번째 샌더슨 등. (2008) 3, 선택적으로 취약한 뇌 영역 3-6 재현성 부상을 생산하고있는 현재의 형태로 제시. 이 모델의 신뢰성은 적용 성 저혈압, 허혈 기간, 주변 온도 제어, 특정 마취 요법, 그리고 근면 수술 후 치료 기간 동안 전신 혈압의 정밀 제어에 의해 결정됩니다. 덜 취약 뇌 영역이 절약되는 동안 8 분 허혈성 모욕, 재관류 6 ~ 24 시간의 과정을 통해 진행 CA1 해마 신경 세포의 죽음을 생산하고 있습니다. 이 진보적 인 세포의 죽음은 쉽게 CA1 뉴런의 가까운 완전한 손실이 시점에서 분명로서, 재관류 7-14일 후 계량입니다.
이 뇌 손상 모델 이외에, 우리는 간단하면서도 철저한 방법론을 사용 CA1 손상을 정량화하기위한 방법을 제시한다. 중요한 것은, 정량화는 간단한 카메라 장착 현미경을 사용하여 수행 할 수 있습니다다 무료 ImageJ에 (NIH) 소프트웨어 플러그인, 엄청난 비용 stereology 소프트웨어 프로그램의 필요성 및 손상 평가를위한 전동 현미경 스테이지를 미연에 방지.
Introduction
심장 마비와 뇌졸중의 결과로 뇌 손상 죽음 및 장기 장애의 주요 원인이다. 심장 마비의 피해자를위한 심폐 소생술은 환자의 60 % 이후에 병원에서 사망 적어도 광범위한 뇌 손상의 결과로 미국의 7,8에서 연간 약 70,000 환자의 자발 순환 회복에 성공하면서 만 3-10% 소생 환자의 9,10은 그들의 이전 생활을 다시 시작할 수 있습니다. 분명히, 글로벌 뇌 허혈 다음과 신경 외상을 최소화하기 위해 치료 개입을 설계 뇌 손상으로 이어질 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다.
뇌 허혈 여러 방법을 이용하여 모델링 할 수 있습니다. 가장 일반적으로, 뇌 허혈 따라서 초점 허혈성 뇌졸중 11,12 생산, 두뇌, 중대 뇌동맥의 주요 혈관을 폐색하여 설치류에서 생산된다. 임상 적으로 중요한 반면,국소 뇌 허혈은 심장 마비 / 소생술 의해 뇌 손상을 연구하는 정확한 방법이 아닙니다. 이 임상 패러다임을 모델링하기 위해 전체 뇌 허혈성 혈액 흐름의 재 도입에 선행되어야한다. 밀접하게이 임상 프레 젠 테이션을 모방하기 위해 수사관들이 실험적으로 심폐 소생술 및 제세동 13,14와 심폐 소생술 다음 심장 마비를 유도. 이 모델은 임상 적으로 관련이 있지만 예측할 수없는 심폐 소생술 시간은 변동성을 증가시킬 수하고 해석하는 데이터 분석을 어렵게 만들 수 있습니다. 또한이 모델은 더 이상 가설을 테스트하기 위해 필요한 동물의 수를 증가 높은 사망률과 연관됩니다. 더 재현성, 일관성 있고, 존속 모욕의 허혈 및 / 또는 재관류에 대한 뇌 반응을 조사하는 것이 바람직 할 수있다.
체계적 일부 혈액의 흐름을 유지하면서 허혈은 뇌에 유도 할 수 있습니다. investigatio을 허용하면서이 사망률을 감소N 뇌 2 조직 손상의 메커니즘. 세계적인 뇌 허혈을 생산하기 위해, 중단 또는 크게 뇌, 내부 경동맥 동맥과 척추 동맥을 공급하는 모든 네 개의 혈관의 흐름을 제한 할 필요가있다. 이러한 혈관 문합 루프를 형성 윌리스의 원이라는 혈관 구조를 통해 혈액의 흐름과 뇌를 제공합니다. 이 혈관 구조는 뇌가 근위부 혈관 폐색의 경우에 관류를 유지 할 수 있습니다. 따라서 모든 기여 혈관을 통해 뇌 혈류의 완전한 허혈을 유도하는 것은 발생해야합니다. 경동맥 폐색이 원하는 기간 동안 동맥류 클립의 최소 침습 복부 목 컷 아래로 응용 프로그램을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그들은 척추의 가로 foramina에 incased대로 척추 동맥을 통해 혈액의 흐름 중단이 어려울 수 있습니다. 연구자들은 경동맥 이전에 척추 동맥에게 24-48 시간을 electrocauterizing하여이를 해결했다폐색 및 뇌 허혈 (4VO 모델) 15. 이 방법과는 대조적으로, 스미스 등은. 줄임으로써 글로벌 뇌 허혈을 유도하는 혈액의 흐름이 2 손실 또는 크게 감소 점에 척추 동맥을 통해 혈류를 줄이기 위해 40 mmHg로에 체계적 동맥 혈압 (MAP)을 의미하는 방법을 개발 . 경동맥 폐색과 함께 사용할 경우,이 메소드는 밀접하게 심장 마비 생존자의를 모방 뇌 손상의 패턴의 결과로, 전뇌에 걸쳐 국소 빈혈을 생산하고 있습니다. 이 방법의 추가 정제에, 우리가 여기에 존재하는 모델은 30 mmHg로에 꽉 MAP 규제 ± 1mHg 허혈의 전체 8 분 동안 필요합니다. 우리는 스미스 등에 의해 설계된 독자적인 기술의 낮은 사망률을 유지하면서이 변경이 모델에 의해 유도 된 뇌 손상의 재현성을 향상하였습니다.
세포의 죽음과 조직 손상의 전체 범위의 정확한 표현형에 의한여기에 제시된 모델은 허혈성 기간 16 직접 따라 달라집니다. CA1 뉴런은 재관류 단계 15,17 동안 치료 적 개입에 대한 시간적 창 있다는 것을 제안, 세포 죽음을 지연 허혈 8 분을 나타내는 다음. 재관류의 발병, 신경 신속하게 기능을 회복하고 직접적인 세포의 죽음은 18 감지되지 않습니다. 그러나이 모욕 원인이 세포 죽음 계곡의 유도 (세포 사멸)는 재관류 3,19 ~ 6 시간 사이의 시토크롬 C를 포함한 미토콘드리아에서 apoptogenic 단백질의 방출에 절정에 달하다.에게 재관류 시간 6 사이 24 CA1 해마의 신경 세포 죽음에 최선을 다하고 있고, 사멸 세포 죽음 프로그램은 19 실행됩니다. 그것은 허혈성 손상에 대한 책임이 세포 사멸 표현형은 매우 논쟁 주목해야한다. 다른 사람이 apopt을보고하면서 초기 연구는 괴사는 기본 세포 사멸 표현형 20,21입니다 제안주요 메커니즘 22,23으로 OSIS. 전체에서 현재의 증거는 셀 고전 고사에서 괴사에 이르기까지 셀 죽음 표현형의 스펙트럼 죽을 것이 좋습니다. 세포 죽음의 특정 모드는 각 표현형의 기여의 정도가 다른 요인 24,25 사이, 모욕의 정도에 따라서, 여러 요인에 따라 달라집니다. 재관류 24 시간으로 죽어가는 세포 pyknotic 핵, 집계 세포 내용의 명확한 증거 응축 세포질 및 기능 미토콘드리아 형태의 손실을 가지고있다. 죽은 세포는 더욱 세분화 식세포 및 / 또는 미세 아교 세포와 같은 면역 세포에 의해 침몰하고, CA1 해마 영역에서 삭제됩니다. 재관류 4-7 일까지, 죽은 세포를 제거하고, 모든 남아 염증 세포이며, glial 세포에게 17,26을 활성화됩니다. 따라서 재관류 7 일 CA1 해마 신경 세포의 죽음에 간단한, 비 특정 세포 얼룩을 사용하여 정량화 할 수있는 최적의 시간을 나타냅니다크레 실 바이올렛 hemotoxylin - 에오신을 CLUDING 및 형태 학적 포함 기준에 따라 계산. 이 말 재관류 간격으로 나머지 세포는 따라서 뇌 손상의 인덱스를 제공, 생존 세포로 간주 될 수 있습니다.
이 모델은 치료 개입을 테스트하기 위해 활용 될 경우, 실험 설계는 계단 기준 (행정 치료 학술 산업 원탁 회의) 27를 따라하는 것이 좋습니다. 설계 및 연구를 수행 할 때 다음 지침을 준수해야한다 그러나 여기에서 설명하지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 준비하기
모든 동물 실험은 기관의 지침을 준수하고 이전에 개시하는 각각의 동물 관리위원회 승인을 받아야합니다. 여기에 제시된 모든 절차는 웨인 주립 대학 기관 동물 케어 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한과에 대한 미국 정부의 원칙에 설명서에 명시된 넣어 사용위원회에 동물의 윤리적 대우에 대한 지침을 따르되었습니다 시험, 연구 및 교육에 사용되는 척추 동물의 이용 및 관리. 수술을 시작하기 전에 필요한 수술 재료와 수술 복구 케이지를 준비합니다. 이 절차는 생존 수술이며 따라서 무균 기술을 연습 할 필요가있다.
- 혈관 카테터를 만들려면, 폴리에틸렌 50 (PE50) 튜브 8 인치 길이를 잘라 한쪽 끝으로 무딘 23 게이지 바늘을 삽입합니다. 카테터는 미리 멸균 또는 b에서 구입 개별적으로 구입하실 수 있습니다필요에 따라 ULK하고 에틸렌 글리콜과 살균.
- 세 가지 방법 조절판의 하나의 포트에이 바늘을 고정하고 반대쪽 포트에서 다른 세 가지 방법 꼭지를 놓습니다. 을 통해 헤파린 생리 식염수를 실행하여 멈춤과 카테터를 Heparinize. 마개 수직 및 도관 원위부 위에 10 ㎖ 식염수 주사기를 연결합니다. 압력 트랜스 듀서 튜브 카테터 원위부 꼭지를 연결 식염수 시스템을 작성하고 모든 공기 방울을 제거합니다.
- 동물의 이용 규정에 따라 복구 케이지를 설치. 복구 방은 조용하고 낮은 트래픽을해야한다. 증발 isoflurane을 필터링하기 위해 하강 기류 테이블 또는 이와 유사한 가스 청소 시스템에서 중요 켭 처음 수술 전.
2. 수술 준비
스프 라그 - 돌리 쥐 (300~350g)는 세계 전뇌 허혈의 2VOH 모델에 사용됩니다. 마취 유도 및 유지 isoflurane을 함께하고 한모금합니다케타민의 하위 해리 복용량 plemented. 우리는 혼자 isoflurane을에 의해 관리 마취가 수술 후 회복 기간 동안 발작의 증가 발생을 일으키는 것을 관찰했다. 발작이 모델의 재현성에 영향을 미칠 신경 손상 및 사망에 기여할 수 있습니다. 케타민과 마취를 보완하여 isoflurane을의 매우 낮은 복용량 마취의 수술 성적에 도달 할 수 있습니다. 항상성 열 담요를 사용하는 코어의 온도 엄격한 규제를 할 수 있습니다. 수술 절차는 경동맥 컷 아래로 격리 및 대퇴 동맥 컷 아래로 도관을 수반한다.
그것은 각각의 수술 중에 상세한 기록을 유지하는 것이 중요합니다. 코어 온도, 혈압, 또는 수술이나시 이전에 발생하는 다른 생리적 변수의 변화는 크게 결과를 변경할 수 있으며 기록은 개인과 그룹 간의 절차의 일관성이 보장 분석 할 수 있습니다. 일관성동물의 생리적 매개 변수를 수술하기 전에 동물을 금식 향상시킬 수 있습니다. 실험자은 가장 일관된 사전 운영 혈류 역학과 연구를위한 혈청 포도당 농도 결과하는 방법을 결정하는 것이 좋습니다.
- 유도 챔버에 쥐를 배치하여 마취를 유도하고 5 % isoflurane을에서 30 % oxygen/70 % 아산화 질소 혼합물로 채 웁니다. 2.5 % isoflurane을 가진 30 % oxygen/70 % 아산화 질소 혼합물로 설치류 후두경 및 환기를 사용하여 12 게이지 카테터 삽관. 환기 속도는 숨 당 2.5 ML에서 분당 80 호흡해야한다.
- 식염수에 케타민의 복강 주사 (20 ㎎ / ㎏)를주고 1.5 %로 isoflurane을 줄일 수 있습니다. 중요 마취의 적절한 수술 평면을 보장하기 위해 절차를 통하여 마취의 수준을 모니터링하는 것이 필수적이다. 페달 반사를 모니터링하면서, 뒷다리 사지 숫자 사이의 마취, 핀치의 깊이를 확인합니다. 휘어진 경우결석, 마취 적합합니다. 대퇴 동맥 도관 후, 혈압은 마취 수준의 지표로 사용할 수 있습니다. 포스트 허혈성 발작의 가능성을 최소화하기 위해 마취의 수술 비행기를 유지하면서 낮게 isoflurane을의 복용량이 가능 유지한다.
- 절개는 목에와 골반 지역에 만들어 질 것이다. 허벅지 복부를 충족 목, 오른쪽 골반을 면도. 동양 항상성 열 담요에 앙와위에서 쥐 및 수술 윤활제를 사용하여 직장 온도계를 삽입합니다. 눈 보호 윤활제를 적용합니다. 60w 전구 온도를 조절 할 수 있습니다. 전구 동물의 8인치보다 가까운 않을 것입니다. 정상적인 생리적 온도의 위 또는 아래에 중요 온도 (37 ° C)이 크게 최종 신경 손상에 영향을 미칠 수 있습니다. 37 코어 온도를 유지 ° C ± 0.5 ° C.
- 베타 딘과 절개 부분을 문질러, 70 % 에탄올로 씻어. 이 TW를 반복더 많은 시간을 O를. 쥐에 수술 필드를 놓고 절개 영역을 노출하는 구멍을 잘라. 중요 경동맥과 대퇴 동맥 복구 및 수술 후 진통을 위해 최소화 이후의 필요성을 향상시킬 주변의 근육, 어떤 외상을 유발하지 않고 격리 할 수 있습니다.
- 적절한 마취 보류, 퉁명스럽게 sternohyoid 근육, 기관을 덮고있는 눈에 띄는 정중선 근육 그룹을 도달 할 때까지 침샘 사이 해부 hemostats를 사용하여, 다음, 목을 따라 정중선 절개를 만들기 위해 메스 번호 10을 사용합니다. 다시주의 무딘 절개 기술을 사용하여, 양측, sternomastoid에서 sternohyoid의 주요 근육 그룹을 구분합니다. 이 두 근육 그룹은 경동맥 동맥을 포함하는 신경 혈관 다발을 찾을 명소로 사용할 수있는 삼각형의 들여 쓰기를 형성한다. 내부 및 외부 경동맥 동맥에 경동맥 분기합니다. 이중에 인접 경동맥을 분리치근.
- 조심스럽게 두 근육을 분리하고 경동맥을 찾습니다. 펄스에 대한이 배 모양을 식별하는 데 도움합니다. 용기 아래 3-0 실크 봉합사 ~ 5 인치 길이를 전달하여 양쪽 경동맥을 분리합니다. . 혈관에서 근막을 치워 미주 신경과 교감 신경 사슬은 자궁 경부 신경 혈관 번들에 포함 된주의 및 관리가 경동맥을 분리 할 때 손상을 일으키는 원인이되는 것을 피하도록주의해야한다.
- 뒷다리 사지 허벅지 근육이 복부를 충족 들여 쓰기 함께 사타구니에 두 번째 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 당신은 서혜부 인대에 도달 할 때까지 허벅지 근육을 따라 복부 근육 아래 해부. 이 대퇴 신경 혈관 다발을 노출합니다. 조심스럽게 용기 아래 3-0 실크 봉합사 ~ 5 인치 길이를 전달하여 대퇴 동맥을 격리 할 것. 노출 된 용기 5-7 mm의 떠나는 근막을 치워.
- 노출 동맥의 말단부에서 영구 매듭을 묶어.
- 가르쳐 봉합을 잡아 당겨 혈액의 흐름을 막다 동맥의 근위 끝에 봉합에 견인을 적용합니다. 안과 가위로 용기의 상단에 작은 절개를합니다. 선박에 불충분 견인 무거운 견인을 적용하여 중지 될 수있는 출혈의 원인이됩니다. 마개에 카테터를 닫습니다.
- 혈관 인트로 사용하여 혈관 절개지나 정중선을 향해 용기에 7-9mm을 카테터 튜브를 삽입합니다. 카테터가 원하는 거리에 배치되면, 그 자리에 고정 용기 및 도관 주위에 느슨한 매듭을 묶게. 용기에서 견인을 제거하고 자연스럽게 거짓말을 할 수 있습니다.
- 정맥 0.3 ML 헤파린 (생리 식염수에서 100U/ml), 관리 할 수 있습니다. 어떤 플러시응고 방지하기 위해 염분의 작은 양 카테터 혈액 중. 압력 모니터를 켜고 장비를 보정합니다. 트랜스 듀서는 혈압을 감지 할 수 있도록 멈춤을 엽니 다. 혈압의 정확한 측정을 얻으려면 시스템의 위치를 보정 한 후에 변경할 수 없습니다.
- isoflurane을 투여은 130 mmHg로 110 mmHg로의 평균 동맥 혈압 (MAP)를 산출하기 위해 조정해야합니다. 이지도는 마취의 적절한 수술 평면을 나타내는해야합니다.
3. 허혈 프로토콜
앞에서 언급 한 바와 같이, 네 개의 혈관은 뇌에 혈류를 공급한다. 척추 동맥 윌리스의 원을 보상하기 때문에 두 개의 경동맥 동맥의 근위부 폐색이 뇌의 허혈을 초래하지 않습니다. 그것은 의한 전신 저혈압과 함께 경동맥 폐색, 뇌 허혈의 결과로 척추 동맥을 통해 혈류를 제한 할 것으로 나타났습니다. 여기에 우리가 DESCR저혈압을 생산하기 위해 혈액을 철회하고 제어, 가역 국소 빈혈을 생산하는 경동맥 동맥을 클램핑 프로토콜을 IBE. 그림 1을 참조하십시오.
혈액 산소와 이산화탄소, 포도당 농도와 pH는 샘플 그룹에서 개인에 따라 다를 및 부상의 변화를 일으킬 수 있습니다. 이러한 생리적 변수를 모니터링 경색의 변동성을 줄일 수 있습니다. 언급 한 바와 같이, 온도가 혈류가 크게 실험적 허혈 28시 제한되는, 조절하지만 뇌의 온도가 코어의 온도에 일치하지 않을 수 있습니다 중요한 또 다른 매개 변수입니다. 뇌의 온도 변화에서 우리의 특정 수술 설치 결과가 허혈시 코어 온도 거울 변경됩니다. 그러나, 열전대 또는 절차를 표준화하는 다른 방법으로 뇌의 온도를 모니터링하여 경험적를 결정하는 실험을 위해 중요합니다. 코어 온도는 뇌 템을 반영하지 않는 경우의 온도합니다, 핵심 온도에 관계없이 전체 과정 중에 뇌의 온도가 normothermic 유지하는 것이 중요합니다.
랜덤 외과 의사가이 시점에서 허혈 또는 가짜 운영 한 통제 그룹에 동물을 무작위 것을 지시. 가짜 수술은 혈압 경동맥 폐색의 모든 감소를 제외 허혈 동물과 동일한 모든 절차를 따릅니다. 그것은 가짜로 작동하는 컨트롤은 허혈성 동물의 일치하는 기간 동안 마취의 동일한 용량에 따라하는 것이 중요합니다. 허혈 전이나 후에 마취를 필요로 포함 된 치료 그룹이있을 경우, 사기 및 치료 빈혈 그룹은 마취 용량과 치료 그룹의 지속 시간과 일치해야합니다.
- 준비 지혈 클립과 클립 도포. 클립이 완전히 어떤 외상을 유발하지 않고 혈관을 폐색한다. 혈역학 일관성가있을 때 허혈이 유발 될 수 있습니다. 10 ML 헤파린 syri를 연결자지, 크레인, 수직 및 도관 근위부에 NGE. 철회 혈액의 응고를 방지하기 위해 안에 주사기 헤파린 식염수 0.3 ML (30 대)이 있어야합니다.
- 1 분 타이머를 설정하고 헤파린 주사기 마개를 열고, 혈액 철회 할 수 있도록.
- 주사기 플런저를 잡아 당겨 혈액을 철회. 너무 많은 흡입이 적용되는 경우, 선박은 축소 또는 도관 개구부에 밀봉되며 혈액 그려되지 않습니다 것입니다. 그것은 1 분에 혈액의 7-9 mL를 제거 할 수 있어야한다. 이 경우가 아닌 경우, 동맥에 더 카테터를 전진하고 다시 시도하십시오. 우리는 혈액의 7-9 ML은 30 mmHg로, 허혈을 달성하기 위해 목표 혈압에 가까운 MAP를 줄이기 위해 제거해야한다는 찾을 수 있습니다. 중요 철회 혈액 ° C 혈액 수혈 중에 냉각을 방지하기 위해 37로 유지되어 있는지 확인합니다.
- 일분 혈액 무승부 (7-9 혈액의 ML 철회되어야한다)은 경동맥 동맥 지혈 클립을 적용하고 시작하면8 분 타이머. 즉시 혈압을 확인합니다. MAP이 30 mmHg로에없는 경우, 주입 또는 천천히 30 mmHg로 ± 1 mmHg로를 달성하기 위해 혈액을 철회. 30 mmHg로의 MAP을 유지하기 위해 국소 빈혈에 걸쳐이 방법을 계속합니다. 전체 허혈 프로토콜을 통해 중요 기록 혈압. 30 mmHg로 혈액의 압력을 줄이기 위해 실패 허혈을 제한 할 수 있습니다. 모니터 코어 및 / 또는 뇌의 온도가 밀접하게 상승 또는 온도의 감소로 수혈하는 동안 뇌 손상에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 8 분의 끝에, 지혈 클립을 제거하고, 천천히 분당 2 ml의 혈액을 reinfusing하여 재관류를 시작합니다.
- 혈액 reinfused되면 정맥은 대퇴 동맥에서 제거 할 수 있습니다. 동맥 절개 근위 수술 후, 보안 두 개의 별도의 매듭 중에 출혈을 방지 할 수 있습니다.
- 5-0 VICRYL 봉합, 역 절단 바늘을 사용하여 불연속 패턴으로 절개를 봉합. 이 봉합은 분해한다, 그래서 R하지 않습니다제거를 equire. 주 과정 동안 충분한 마취 isoflurane을 낮은 수준으로 도달 할 수없는 경우, 마취제의 추가 용량을 관리 할 수 있습니다.
4. 진통 및 복구
동물 복지 복구뿐만 아니라 수술 중에 우선 순위입니다. 수술 후 관리는 기관의 특정 지침을 따라야합니다. 세계적인 뇌 허혈을받을 동물 발작에 감염 될 수 있습니다. 발작의 발생을 최소화하기 위해 그것을 복구 방 최소한의 자극, 즉 소리와 시각 장애를 가지고하는 것이 중요합니다. 이 목적을 위해 외딴 방에서 72 시간 동안 우리의 동물 사용 프로토콜에 따라, 우리는 집에 수술 동물.
- 절개를 봉합 한 후 쥐 인공 호흡기 꺼져 이유가 될 수 있습니다. isoflurane을 전원을 끄고 쥐가 인공 호흡기에 호흡을 시작할 때까지 30 % oxygen/70 % 아산화 질소의 환기를 계속합니다.
- 0.5 ㎎ / K를 관리피하 견갑골 사이의 5 ML의 식염수 G의 butorphanol.
- 신속하게 혈액을 reinfusing은 우심실 예압을 증가시킬 수 있습니다. 이 폐 순환 압력을 증가하고 폐 부종의 원인이 될 수 있습니다. 이 포함의 증상은 호흡하는 동안 호흡과 지직 거리는 소리를 고심한 흔적. 긍정적 인 말에게 호기 압력을 적용하면 폐의 부종을 개선하는 데 도움이됩니다.
- 호흡의 자발적 제어가 회복되면 튜브를 빼내, 온도계를 제거하고 가열 담요를 끄십시오. 이 시점에서 동물이 복구 케이지에 배치 할 수 있습니다. 케이지의 절반 재관류 첫 24 시간 동안 물 순환 담요 (34 ° C)의 상단에 있도록 복구 케이지에 위치해야한다. 온도 유지에 도움을 가열 담요 위에 케이지 바닥 부분에 동물을 배치합니다. 동물이 마취와 진통에서 회복하기 시작하면, 그 자체 온도 조절하기 위해 새장 주위를 이동합니다. 동물은 수술 후 동안 따로 보관합니다.
- 동물은 물에 무제한 액세스 할 수 있어야합니다. 이일 후 영업 이익이 물이 4 ㎎ / ㎏ 액체 타이레놀 솔루션을 포함해야합니다. 쥐 차우 이외에, 설탕 아침 시리얼을 먹고 자극하고 체중 감소를 방지하기 위해 새장에 제공됩니다.
- 드레이프와 케이지의 절반을 커버 밀접하게 수술 후 회복을 모니터링 할 수 있습니다.
- 동물이 마취에서 회복으로 그 고통의 징후를 모니터링하는 것이 중요합니다. 수고 나 일관성 호흡이 가능 삽관시 폐 부종이나기도 염증으로 인한 고통의 징조가 될 수 있습니다. Butorphenol 그러나 가벼운 활동은 1 시간 이내에 활성을 감소 침착 동물, 복원해야합니다. 우리는 동물 취급을 먹고 발관 4 시간 이내 음주 시작합니다 찾을 수 있습니다. 12 시간으로, 정상적인 행동과 먹이 활동은 다시 시작해야합니다. 고통의 또 다른 표시는 체중 손실, 동물은 48 시간 범위에서 원래 체중의 20 % 이상을 잃게한다 과도한 체중 감량을 경우에 나는s는 동물이 안락사해야 관찰했다.
- 발작이 발생하면 인도적 개입이 필요합니다. 발작 활동의이 유형은 일반적으로 재관류 후 24 ~ 48 시간을 볼 수 있습니다. 발작 자체 허혈성 모욕 독립적으로 증가 뇌 손상을 일으킬 수 있으므로 발작 활동은 이전 연구 29 개시하는 장소에서 설정 배제 기준을 고려하여야한다. 아무도 존재하지 않는 경우 발작이 발생할 수 있으므로 징후를 인식하는 것이 중요합니다. 침구 케이지에서 교란 가능성이 추방 될 것입니다. postictal 쥐, 신속한 함께 나른한 처분을 호흡하고 /를 고심한 흔적이나 상처 나 출혈이 코를해야합니다.
통증이나 고통의 흔적을 주는 즉시 진통제로 완화된다. sympotoms은 진통제 중 하나 복용량으로 완화 나 진통제의 4 년 연속 투여 한 후 유지되지 않은 경우, 동물은 안락사와 연구에서 제외됩니다. 수술이에요unds는 8 일 지점 - 영업 이익에 대한 적절한 치료에 대한 검사를해야한다.
5. 조직의 수집 및 처리
뇌 파라 포름 알데히드의 transcardial 주입에 의해 고정됩니다. 총 절편 및 cryoprotection 후에, 우리는 그라 이오 스탯에 뇌 부분을 고정 웁니다. 이러한 뇌 섹션은 크레 실 바이올렛으로 염색하고 광학 현미경에 몇 군데 있습니다.
- 유도 챔버에 동물을 배치하고 5 % isoflurane을 가진 30 % 산소 / 70 % 질소 산화물로 작성하여 마취를 유도. 동물 삽관 5 % isoflurane을 가진 30 % 산소 / 70 % 질소 산화물에 환기.
- 관류 절차 재료를 준비합니다. 1X 인산 100 ㎖로 한 비커를 채우기 4시 (PBS) 완충 식염수 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 100 ㎖ (PFA)와 하나의 비커 ° C. PBS는 관류 펌프를 통해, PFA 다음으로 뇌가 플러시됩니다. 튜브는 각각의 비이커에 넣고에 세 방향 마개로 연결됩니다PBS에서 PFA 관류에 매끄러운 전환을 노래 졌을. 튜브에 무딘 18 게이지 바늘을 배치하고 PBS로 라인을 채 웁니다. 바늘 및 공기 등의 배관에는 기포가 없는지 확인하여 혈류를 방해 할 수 있습니다 색전증을 형성 할 수 있습니다. 또한, 뇌의 침수 고정 용 PFA와 함께 준비 작은 컨테이너입니다.
- 유체의 적어도 200 mL를 보유하기에 충분한 용량, 액체 수집 트레이를 사용합니다. 이 시점에서 동물 깊은 마취에 도달하는 (최소한 3 분) 충분히 오래 isoflurane을 가진 환기되어 있어야합니다.
- 중요 마취의 수술 비행기에 도달되어 있는지 확인합니다.
- 절개는 복부를 통해 흉강에 액세스함으로써 진행합니다. 대동맥 클램프. 마음이 노출 될 때, 대동맥으로 심장의 정점을 무디게 18 게이지 바늘을 삽입합니다. 관류는 동물을 종료 할 수 있도록 오른쪽 귓바퀴에 작은 상처를합니다.
- PBS로 시작, 50 ML / 분에서 펌프를 켭니다. pumpi 후PBS의 NG 100 mL로는 PFA 100 ㎖를 붓는다하기 위해 꼭지를 전환합니다.
- 조직을 손상하지 않도록주의하면서 머리를 제거합니다.
- 조직의 매트릭스에 뇌를 놓고 소뇌와 대뇌 사이에 잘라. 섹션 전뇌, 대뇌 피질의 앞면과 뒷면에서 ~ 3mm. 이 세 부분을 생산하고, 중간 부분은 해마를 포함합니다.
- 완전한 몰입에 대한 충분한 PFA와 함께 항아리에 뇌의 부분을 놓습니다. 집중 정확히 2 시간 동안 머리를 고정합니다.
- 동결로 인한 손상으로부터 조직을 보호하기 위해 뇌 PBS의 30 % 자당과 PFA를 대체하여 cryoproteced 있습니다. 조직 샘플은 자당 용액 (~ 48 시간) 세면대 Cryoprotection이 완료됩니다.
- 뇌의 부분을 고정 스냅, 드라이 아이스에 비커를 배치에서 10 분 2 methylbutanol로 입력합니다. 5 분 methylbutanol으로 뇌 조각을 배치 한 후 cryost 때까지 -80 밀봉 용기 및 저장 ° C로 전송단면에.
- 20 μm의에 그라 이오 스탯 섹션은 뇌, 3 뇌 아틀라스 좌표 (정위 좌표에서 쥐 뇌. 팍시 왓슨, 플레이트 섹션 29, 31, 33 또는 브레 그마 -2.8 mm, -3.3 mm, 그리고 -3.8 적어도 3 섹션 수집 mm). 섹션이 청구 현미경 슬라이드에 배치하고 -80 ° C.에 저장하기 전에 건조하도록 허용
- 크레 실 바이올렛 (산도 3.5에서 0.1 %의) 각 뇌 아틀라스 좌표에서 9 뇌 섹션 3 얼룩.
- 현미경 40X에서 해마의 이미지 CA1 영역은 카메라를 탑재하고 CA1 신경 평면 300 μm의 스케일 바 평행 삽입합니다. TIFF 파일로 이미지를 저장합니다.
6. 뇌 손상의 정량화
ImageJ에, 건강의 국립 연구소에서 제공하는 무료 프로그램은 뇌 손상의 정도를 나타냅니다 가능한 신경을 계산하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
- ImageJ에의 '셀 카운터'플러그인을 오픈 현미경 TIFF 이미지. 를 선택합니다눈금 막대의 경계 안에 색깔과 수의 뉴런을 표시. 뉴런은 성상 / 미세 아교 형태 (작은 원형 또는 긴 관 모양)에 대한 연결을 형태 (대형 피라미드 모양) 또는 제외 기준에 따라 간단한 포함 기준에 따라 계산됩니다.
중요 포함 / 배제 슬라이드 사이에 기준과 뉴런을 계산 개인과 일치합니다. - 기록 신경 세포 수와 세포 카운터 창을 저장합니다.
- 신경 세포의 개수가 일치 정확한 신경 세포의 수를 달성하기 위해 별도의 두 사람에 의해 완성되어야한다.
- 각 동물에서 모든 9 이미지의 평균은 통계 분석에 사용되는 CA1 해마 손상의 정량적 측정 한 평균 "신경 세포의 수를"제공합니다. 그룹은 정적으로 정상 테스트가 실패 Tukey의 HSD 사후 분석을 위해 테스트 또는, 던의 PO 다음 순위에 Kruskal-월리스 편도 ANOVA 다음 편도 ANOVA를 사용하여 비교할 수 있습니다세인트 임시 분석은 통계적으로 집단 간의 차이를 알아보고자 하였다. 특정 통계 분석은 개별 연구 설계에 의해 결정되어야하며, 여기에 제시 한 테스트중인 특정 가설에 적합하지 않을 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
세계적인 뇌 허혈 / 재관류 2VOH 모델은 해마의 CA1 영역에서 신경 세포의 죽음의 원인이됩니다. 그림 2이 14 일 재관류 후 처리 세계적인 뇌 허혈 8 분에 의해 생성 부상을 나타냅니다. 그림 2A와 2B는 가짜의 해마를 비교하고 크레 실 바이올렛으로 염색 후 허혈성 뇌. 그림 2A는 그대로 CA1 등 정상적인 형태를 전시 가짜로 작동하는 쥐의 해마를 보여줍니다. 그림 2B는 허혈 / 재관류에 해마 주제를 보여줍니다 곳 이가있는 이랑, CA2와 CA3 최소한의 형태에 영향을. CA1 해마 선택적으로 취약한 신경 허혈 / 재관류 손상을 생존하지 만 흩어져 신경이 남아있다. 그러나 침투 대식 세포 및 / 또는 미세 아교 세포 (이바-1), 종양 세포와 반응성 성상 세포 (GFAP-양성 세포)의 극적인 증가는 CA1 H에 분명ippocampal 필드입니다. 노이 앤, 대식 세포 / 미세 아교 세포 이바-1 라벨 및 GFAP와 성상 라벨과 뉴런의 특정 면역 형광 라벨은이 연구 결과를 확증.
그림 2C는 40X 배율 CA1의 현미경 이미지 창을 계산 예제 신경을 선물한다. 상단 패널은 가짜로 작동하는 컨트롤에서 CA1을 표시하고 하단 패널은 허혈 / 재관류 CA1 다음을 보여줍니다. 부상 CA1은 미세 아교 세포와 작은 관 또는 모양의 눈물 표시 성상 세포를 포함하는 염색을 표시합니다. 이들은 자신의 형상에 의해 신경 구별 할 수 있습니다. 그대로 해마 신경 세포는 이가있는 이랑의 여부, CA2 또는 CA1은 원형 또는 피라미드 모양 큽니다.
그림 2D는 CA1 신경 세포의 개수에 의해 정량화 2VOH에 의한 부상의 그래픽 분석이다. 그것은 2VOH 모델에 의해 빈혈의 8 분을 일으킬 수 있다는 결론을 내릴 수있다 일관된 reproducibl전자 부상은 주로 CA1 해마에 격리됩니다.
그림 1. 실험 타임 라인. 실험 타임 라인 수술 단계와 조직 처리의 표현입니다.
그림 2. 대표 결과. 치료 쥐의 해마 손상이 가짜로 작동하는 제어 쥐 (A)에 비해 I / R (B)에 노출. 크레 실 바이올렛 스테인드 해마는 (10X) [서라운드] 40X CA1의 배율, CA2, CA3, hilus, 그리고 DG (최고 leftà 시계 방향). (B) 손상은 CA1 hippoc에 지역화CA1의 ampus. (C) 신경 세포의 계산 및 손상 정량화 가짜 운영되는 제어 동물에서 (상단, 제어) 및 글로벌 뇌 허혈에 노출 된 동물에 사용되는 대표 계산 창 (바닥, I / R)의. (D) 대표 정량 출판 연구에서 해마 신경 세포의 수가 (+ 표준 편차 평균, N = 8, p <0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 설명 된 모델은 인간에서 발견 된 것과 유사한 부상을 제공, 심장 마비와 심폐 소생술의 결과로 발생할 수있는 뇌에 허혈성 모욕을 생산하고 있습니다. 세계적인 뇌 허혈을 생산하는이 방법은 여러 프로토콜 중 하나입니다. 우리는 그것의 비교적 낮은 사망률, 빠른 복구 및 재현성 결과를 제일이 프로토콜을 사용합니다. 심장 마비 / 소생 모델 그러나 기술적으로, 틀림없이 지속적으로 재현하기 가장 어려운 가장 임상 적으로 관련성이 모델입니다. 세계적인 뇌 허혈의 4VO 모델은 네 개의 기여 혈관 허혈 가려하고 있다는 사실 가치있는 또 다른 일반적으로 사용되는 프로토콜입니다. 이 모델은 여러 수술 및 신경 재관류의 가능성을 포함 단점을 가지고 있습니다. 4VO 모델은 하나의 절차를 수행하는 동안 네 개의 혈관의 일시적 폐쇄가 허혈을 생성 할 수 있도록 적응되었다, 그러나 수술 기술 유지LY 30을 요구.
2VOH에 변화는 결과 31,32의 범위를 생산하기 위해 표시되었습니다. 빈혈과 저혈압의 정도의 기간이 결과에 영향을 미칠 수있는 중요한 변수입니다. 보고서는 혈압이 충분히 감소하지 않은 경우 생성되는 부상 쥐 30에 일관성이 없거나 일방적 될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 주목할 주변 부상을 유발하지 않고 신뢰할 수있는 국소 빈혈을 생산하기 때문에 저혈압의 최적 수준으로 30 mmHg로를 발견했습니다. 이 패러다임은 그러나 우리의 프로토콜 합병증 그렇지 증가 가능성을 줄일 수 있습니다 다음, 중증으로 특징 국소 빈혈을 생산하고 있습니다. 모욕의 험난한 자연은 일반적으로 손상의 일관성에 영향을주지 않습니다 동물 사이의 생리적 매개 변수 이유는 약간의 차이가 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이익에 대한 재무 충돌이 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
References
- Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
- Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
- Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
- Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
- Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
- Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
- Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
- Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
- Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
- Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
- Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
- Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
- Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
- Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
- Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
- Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
- Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
- Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
- Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
- Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
- Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
- Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
- Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
- Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
- Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
- Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
- Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).
