2-tillukning af blodkar / Hypotension: A Rat Model of Global hjerneiskæmi

Summary

Bilateral carotis okklusion kombineret med systemisk hypotension producerer global hjerneiskæmi i rotter, hvilket resulterer i skader på hippocampus med reproducerbare sværhedsgrad. Animal fag er svækket med forudsigelige mønstre af hjerneskade, de kommer sig hensigtsmæssigt, og dødeligheden er forholdsvis lav.

Abstract

Hjertestop efterfulgt af genoplivning ofte resulterer i en dramatisk hjerneskade forårsaget af iskæmi og efterfølgende reperfusion af hjernen. Globale hjerneiskæmi producerer skade på bestemte områder af hjernen har vist sig at være meget følsomme over for iskæmi ^1. Hippocampale neuroner har højere følsomhed til iskæmiske fornærmelser forhold til andre cellepopulationer, og specifikt, CA1-regionen af hippocampus er særligt udsatte for iskæmi / reperfusion ^2.

Udformningen af ​​terapeutiske interventioner, og til undersøgelse af mekanismer involveret i cerebral skade, kræver en model, der producerer lignende skader den kliniske tilstand og på en reproducerbar måde. Bilateral carotis tillukning af blodkar med hypotension (2VOH) er en model, der producerer reversibel forhjerneiskæmi, efterligne cerebrale begivenheder, der kan opstå under hjertestop og genoplivning. Vi beskriver en model modificeret fra Smith et al. (1984) ², Som første gang præsenteret i sin nuværende form i Sanderson et al. (2008) ^3, der producerer reproducerbar skade selektivt sårbare områder af hjernen ^3-6. Pålideligheden af ​​denne model er dikteret af præcis styring af systemiske blodtryk under anvendt hypotension, varigheden af ​​iskæmi tæt temperaturkontrol, en specifik anæstesi regime, og omhyggelig postoperativ pleje. 8 minutter iskæmiske skade producerer celledød af CA1 hippocampale neuroner, der skrider i løbet af 6 til 24 timer af reperfusion, mens mindre sårbare hjerneregioner skånet. Denne progressiv celledød nemt kvantificeres efter 7-14 dage reperfusion, som et næsten komplet tab af CA1 neuroner er tydeligt på dette tidspunkt.

Ud over denne hjerneskade model præsenterer vi en metode til CA1 skade kvantificering hjælp af en simpel, men grundig, metodologi. Vigtigere, kan kvantificering opnås ved anvendelse af en simpel kameramonteret mikroskop, enda fri ImageJ (NIH) software-plugin, der ikke er behov for omkostningseffektive uoverkommelige stereologi softwareprogrammer og et motoriseret mikroskopisk scene for skadesvurdering.

Introduction

Hjerneskade som følge af hjertestop og slagtilfælde er en førende årsag til død og langvarig invaliditet. Mens genoplivningsudstyr til ofre for hjertestop lykkes at genoprette spontan cirkulation i omkring 70.000 patienter om året i USA ^7,8 mindst 60% af disse patienter efterfølgende dør på hospitalet som følge af en omfattende hjerneskade og kun 3-10% af genoplivet patienterne kan genoptage deres tidligere livsstil ^9,10. Det er klart, at forstå de mekanismer, der fører til hjerneskade efter global hjerneiskæmi og designe terapeutiske indgreb for at minimere neurologiske traumer er af afgørende betydning.

Hjerneiskæmi kan modelleres udnytte flere metoder. Mest almindeligt er hjerneiskæmi produceret i gnaver ved okkludere et større blodkar i hjernen, den midterste cerebrale arterie, hvilket frembringer en fokal iskæmisk slagtilfælde ^11,12. Mens klinisk vigtig,fokal hjerneiskæmi er ikke en præcis metode til at studere hjerneskade fremstillet ved hjertestop / genoplivning. At modellere denne kliniske paradigme hele hjernen skal gøres iskæmisk efterfulgt af genindførelse af blodgennemstrømningen. Til nøje at efterligne denne kliniske præsentation, efterforskere eksperimentelt fremkalde hjertestop efterfulgt af genoplivning med hjertemassage og defibrillering ^13,14. Denne model er klinisk relevant, kan dog uforudsigelige genoplivning tider øger variabilitet og kan gøre dataanalyse vanskeligt at fortolke. Derudover er denne model forbundet med en høj dødelighed, hvilket yderligere øger dyrenummer nødvendigt at teste en hypotese. Undersøgelse af cerebral reaktion på global iskæmi og / eller reperfusion i en mere reproducerbar, sammenhængende og levedygtige fornærmelse kan foretrækkes.

Global iskæmi kan induceres i hjernen og samtidig bevare nogle blodgennemstrømningen systemisk. Dette reducerer dødelighed, samtidig med at investigation af mekanismerne i vævsskade i hjernen ^2.. At producere globale hjerneiskæmi, er det nødvendigt at afbryde eller i høj grad begrænse strømning i alle fire blodkar, som forsyner hjernen, de interne halspulsårer og vertebrale arterier. Disse skibe forsyne hjernen med blod flow gennem en vaskulær struktur kaldet Circle of Willis, som udgør en anastomotisk løkke. Denne vaskulære arkitektur tillader hjernen at fastholde perfusion i tilfælde af proximale vaskulær okklusion. Derfor skal til at inducere fuldstændig iskæmi af hjernen blodgennemstrømning gennem alle bidragende fartøjer forekomme. Halspulsåren okklusion kan opnås ved hjælp af en minimalt invasiv ventrale hals cut-ned og anvendelse af aneurisme klip for en ønsket periode. Afbrydelse af blodgennemstrømningen via vertebrale arterier kan være vanskelig, da de er incased i tværgående huller af rygsøjlen. Efterforskere har behandlet dette ved at electrocauterizing vertebrale arterier 24-48 hr før carotisokklusion og hjerneiskæmi (4VO model) ^15. I modsætning til denne fremgangsmåde, udviklede Smith et al. En fremgangsmåde til induktion af globale hjerneiskæmi ved at reducere betyde arterielt blodtryk (MAP) systemisk til 40 mmHg at reducere perfusion gennem de vertebrale arterier til et punkt, hvor blodgennemstrømningen er tabt eller reduceres kraftigt ² . Når kombineret med carotis okklusion, denne metode giver iskæmi hele forhjernen, hvilket resulterer i et mønster af hjerneskade, der nøje efterligner hjertestop overlevende. I en yderligere forfining af denne metode kræver den model, vi præsenterer her tight MAP regulering på 30 mmHg ± 1mHg under hele 8 min af iskæmi. Vi fandt dette ændring forbedrer reproducerbarheden af hjerneskade induceret af denne model og samtidig bevare den lave dødelighed af den oprindelige teknik designet af Smith et al.

Den præcise fænotype celledød og samlede omfang af vævsskader forårsaget afden model, der præsenteres her er direkte afhængige af iskæmisk varighed ^16. Efter 8 min iskæmi, udviser CA1 neuroner forsinket celledød, hvilket antyder, at der er en tidsmæssig vindue til terapeutisk intervention i reperfusionsfasen ^15,17. Ved starten af reperfusion hurtigt neuroner genvinde funktion og ikke umiddelbart celledød er påviseligt ^18.. Men dette fornærmelse forårsager induktion af celledød kaskader (apoptose), der kulminerer med frigivelsen af apoptogenic proteiner fra mitokondrier, herunder cytochrom c, mellem 4-6 hr reperfusion ^3,19. Mellem 6 og 24 timers reperfusion, har neuroner i CA1 hippocampus forpligtet til celle død, og den apoptotiske celledød program gennemføres ^19.. Det skal bemærkes, at celledød fænotype ansvarlig for iskæmisk skade er yderst kontroversiel. Tidlige undersøgelser har antydet nekrose er den primære celledød fænotype ^20,21, mens andre andre rapporterer apoptOSIS som den vigtigste mekanisme ^22,23. I alt tyder aktuelle beviser for, at cellerne dør af et spektrum af celledød fænotyper spænder fra klassisk apoptose til nekrose. Den specifikke form for celledød er afhængig af mange faktorer, med graden af bidragene fra hver fænotype afhængigt af sværhedsgraden af den fornærmelse, blandt andre faktorer ^24,25. Ved 24 timers reperfusion, besidder døende celler pyknotiske kerner, kondenseret cytosol med klare beviser for aggregerede cellulære indhold og tab af funktionel mitokondrie morfologi. Døde celler er yderligere opdelt, opslugt af immunceller såsom makrofager og / eller mikroglia og slettes fra CA1 hippocampus region. Ved 4-7 dage reperfusion er døde celler fjernes, og alle, der er tilbage er inflammatoriske celler og aktiverede gliaceller ^17,26. Derfor 7 dages reperfusion repræsenterer en optimal tid, hvor CA1 hippocampus neuronal død kan kvantificeres ved hjælp af enkle, uspecifikke celle pletterinklusive cresylviolet eller hemotoxylin-eosin og tælles baseret på morfologiske inklusionskriterier. Celler forbliver på dette sene reperfusion interval kan regnes som overlevende celler, hvilket giver et indeks for hjerneskade.

Hvis denne model er at blive udnyttet til at teste terapeutiske indgreb, foreslås det, at den eksperimentelle design følge TRAPPE kriterier (Stroke Terapi Academic Industri Roundtable) ^27. Disse retningslinjer bør følges ved udformning og gennemførelse af en undersøgelse, der dog ikke behandles her.

Protocol

1.. Forberedelse

Alle dyreforsøg skal overholde de institutionelle retningslinjer og modtage godkendelse fra en respektiv dyrepleje udvalg forud for indledningen. Alle procedurer, der præsenteres her er blevet godkendt af Wayne State University Institutional Animal Care og brug Udvalg og følge de retningslinjer for etisk behandling af dyr, som rakte i Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og den amerikanske regering principper for Udnyttelse og pleje af hvirveldyr, der anvendes i test, forskning og uddannelse. Inden du begynder kirurgi, forberede nødvendige kirurgiske materiale og en operation opsving bur. Denne procedure er en overlevelse kirurgi, og det er derfor nødvendigt at praktisere steril teknik.

1. For at gøre en karkateteret, skæres en 8 tommers længde af polyethylen 50 (PE50) slanger og indsætte en stump 23 gauge nål i den ene ende. Katetre kan købes enkeltvis forhånd steriliseret eller købes i bulk og steriliseres derefter med ethylenglycol efter behov.
2. Sikre denne nål på én havn i en trevejs stophane og placere en anden tre vejs stophane på den modsatte port. Heparinize de stophaner og kateter ved at køre heparin saltvandsopløsning igennem. Tilslut en 10 ml saltvand sprøjte på stophanen vinkelret og distale til kateteret. Slut stophane distalt til kateteret til tryktransduceren røret fylde anlægget med saltvand og fjerne eventuelle luftbobler.
3. Opsætning inddrivelse bur i overensstemmelse med anvendelsen af ​​dyr regler. Opvågningsstuen skal være rolige og har lav trafik. VIGTIGT Tænd downdraft bordet eller lignende gas skylningssystem før du begynder operation for at filtrere fordampet isofluran.

2.. Kirurgisk Forberedelse

Sprague-Dawley-rotter (300-350 g) anvendes i 2VOH model af global forhjerneiskæmi. Anæstesi induceres og vedligeholdes med isofluran og supsuppleret med en sub-dissociativ dosis af ketamin. Vi har observeret, at anæstesi vedligeholdes af isofluran alene forårsager en øget forekomst af anfald under post-op opsving. Anfald kan bidrage til nerveskader og dødelighed, hvilket vil påvirke reproducerbarheden af ​​denne model. Supplering anæstesi med ketamin tillader en meget lavere dosis af isofluran at nå en kirurgisk grad af anæstesi. Ved hjælp af en homøostatisk termisk tæppe tillader streng regulering af kernetemperatur. Den kirurgiske procedure indebærer halspulsåren cut-ned og isolation og lårarterien cut-ned og kanyle.

OBS Det er vigtigt at holde detaljerede optegnelser i hvert enkelt kirurgisk indgreb. Ændringer i kernetemperatur, blodtryk eller andre fysiologiske variable, som opstår før eller under kirurgi kan drastisk ændre resultaterne, og registreringer kan analyseres for at sikre, at der er processuel sammenhæng mellem individer og grupper. Sammenhængi de fysiologiske parametre af dyret kan forbedres ved at faste dyrene forud for operationen. Eksperimentatorer opfordres til at bestemme den metode, der resulterer i de mest konsekvente pre-opererede hæmodynamik og serum glukose koncentration for deres studier.

1. Fremkald anæstesi ved at placere rotten i en induktion kammer og fyldes med en 30% oxygen/70% lattergas blanding ved 5% isofluran. Intubere med en 12 gauge kateter, ved hjælp af en gnaver laryngoskop og udluftes med 30% oxygen/70% lattergas blanding med 2,5% isofluran. Ventilation kurs burde være 80 vejrtrækninger per minut ved 2,5 ml pr ånde.
2. Giv en intraperitoneal injektion af ketamin (20 mg / kg) i saltvand og reducere isofluran til 1,5%. VIGTIGT Det er nødvendigt at overvåge niveauet af anæstesi hele proceduren for at sikre tilstrækkelig kirurgisk plan af anæstesi. For at kontrollere dybden af ​​anæstesi, knivspids mellem hind-lemmer cifre, mens overvågningen pedal refleks. Hvis refleks erfraværende, anæstesi er tilstrækkelig. Efter kanylering af den femorale arterie, kan blodtrykket bruges som en indikator for anæstesi niveau. Hold dosis af isofluran så lavt som muligt og samtidig opretholde en kirurgisk plan anæstesi for at minimere muligheden af ​​post-iskæmiske anfald.
3. Snit vil blive foretaget på halsen og i bækken området. Barbere halsen og retten bækken, hvor låret mødes maven. Orient rotten i liggende stilling på homøostatiske termo-tæppe og indsætte rektal termometer hjælp kirurgisk smøremiddel. Påfør beskyttende øje smøremiddel. En 60 watt pære kan hjælpe med at regulere temperaturen. Pæren bør aldrig være tættere end 8 inches fra dyret. VIGTIGE Temperaturer over eller under normal fysiologisk temperatur (37 ° C) kan have stor indflydelse den endelige neurologiske skader. Oprethold kernetemperatur ved 37 ° C ± 0,5 ° C.
4. Krat indsnit områder med Betadine og skyl med 70% ethanol. Gentag denne two gange mere. Placer en kirurgisk felt over rotten, og skæres huller til at eksponere indsnit områder. VIGTIGE carotis og lårarterier kan isoleres uden at forårsage nogen traumer til omgivende muskulatur, hvilket vil forbedre inddrivelsen og minimeres efterfølgende behov for postoperativ analgesi.
5. Afventer passende bedøvelse, en nr. 10 skalpel bruge til at lave en midtlinjeincision langs halsen, så ved hjælp af hemostats ligefremt dissekere mellem spytkirtlerne indtil den når sternohyoid muskel, den fremtrædende midterlinjen muskel gruppe dækker luftrøret. Igen bruger omhyggelig stump dissektion teknik, adskille de store muskelgrupper i sternohyoid fra sternocleidomastoideus, bilateralt. Disse to muskelgrupper danner en trekantet fordybning, der kan anvendes som en milepæl at lokalisere den neurovaskulær bundt, der indeholder halspulsåren. De fælles carotis grene ind i interne og eksterne halspulsårer. Isoler den fælles halspulsåre proximalt til bifurcation.
6. Forsigtigt adskille disse to muskler og find halspulsåren. At hjælpe med at identificere dette skib kigge efter en puls. Isoler halspulsårer på begge sider ved at føre en ~ 5 tommer længde på 3-0 silkesutur under fartøjet. Rydde fascia fra skibene. FORSIGTIG vagus nerve og sympatiske kæder er inkluderet i den cervikale neurovaskulær bundt og pleje bør tages for at undgå at forårsage skade på det, når isolere halspulsåren.
7. Brug en saks til at gøre en anden indsnit ved lysken, langs indrykning hvor hind-lemmer lårmusklerne opfylder maven. Dissekere under mavemuskel sammen lårmusklerne, indtil du når lyskeligamentet. Dette vil eksponere den femorale neurovaskulær bundt. Omhyggeligt isolere den femorale arterie ved at lede en ~ 5 tommers længde af 3-0 silke sutur under fartøjet. Rydde fascia efterlader 5-7 mm af udsatte fartøj.
8. Bind en permanent knude ved den distale ende af den eksponerede arterie.
9. Påfør trækkraft på suturen ved den proximale ende af arterien til okkludere blodgennemstrømning, ved at trække suturerne undervises. Lave et lille snit på tværs af toppen af ​​beholderen med oftalmiske saks. Utilstrækkelig trækkraft på skibet vil resultere i blødning, som kan stoppes ved at anvende tungere trækkraft. Luk kateteret på stophanen.
10. Ved hjælp af en vaskulær introducer, kateterrøret indsætte i fartøjet, 7-9 mm forbi skibet indsnit og mod midterlinjen. Når kateteret er anbragt i den ønskede afstand, binde løs knude rundt om skibet og kateteret for at fastgøre det på plads. Fjern trækkraft fra beholderen og lad den ligge naturligt.
11. Administrere 0,3 ml heparin (100U/ml i saltvand), intravenøst. Skyl eventuelleblod ud af kateteret med en lille mængde saltvand for at forhindre koagulation. Tænd pressostaten og kalibrere udstyret. Åbne stophaner at tillade transduceren at detektere blodtrykket. For at opnå præcise målinger af blodtryk, bør positionering af systemet ikke ændres efter kalibrering.
12. Isofluran dosis bør justeres for at give en gennemsnitlige arterielle blodtryk (MAP) på 110 mmHg til 130 mmHg. Dette kort skulle være vejledende for tilstrækkelig kirurgisk plan anæstesi.

3.. Iskæmi Protocol

Som tidligere nævnt, fire fartøjer leverer perfusion til hjernen. Proksimal okklusion af de to halspulsårer vil ikke resultere i hjerneiskæmi fordi de vertebrale arterier vil kompensere gennem Circle of Willis. Det har vist sig, at carotis okklusion, kombineret med induceret systemisk hypotension, vil begrænse perfusion gennem de vertebrale arterier resulterer i hjerneiskæmi. Her har vi DescrIBE protokollen for udtagning af blod til at producere hypotension og fastspænding carotidarterierne at producere kontrollerede, reversibel iskæmi. Se figur 1..

Blod ilt og kuldioxid, glucose koncentration og pH kan variere blandt individer i testgruppen og forårsage variation i skaden. Overvåge disse fysiologiske variable kan reducere variabilitet af infarkt. Som nævnt temperaturen er en anden parameter, som er vigtigt at regulere, men hjernen temperaturen kan ikke svarer til kernetemperatur, som perfusion er stærkt begrænset i løbet af eksperimentel iskæmi ^28.. Vores specifikke kirurgiske setup medfører temperaturændringer i hjernen, spejl ændringer i kernetemperatur under iskæmi. Men det er vigtigt for eksperimentatoren at afgøre dette empirisk ved at overvåge hjernens temperatur med termoelementer eller andre midler til at standardisere proceduren. Hvis kernetemperatur ikke spejler hjernen temperatur, er det vigtigt at holde hjernen temperatur normothermic under hele proceduren, uanset kernetemperatur.

Randomisering dikterer, at kirurgen tilfældig rækkefølge dyret til iskæmi eller skinopererede kontrolgruppe på dette punkt. Skinkirurgi vil følge alle procedurer nøjagtig det samme som iskæmiske dyr undtagen enhver reduktion i blodtrykket og halspulsåren okklusion. Det er vigtigt, at de sham-opererede kontroller være under den samme dosis af anæstesi i en varighed, der svarer at de iskæmiske dyr. Hvis der er en behandling inkluderet gruppe, som kræver anæstesi før eller efter iskæmi, bør fingeret og ubehandlede iskæmi grupper matche anæstesi dosis og varighed af behandlingen gruppen.

1. Ready hæmostatiske klip og klip applikator. Klippene burde helt okkludere skibet uden at forårsage nogen traumer. Iskæmi kan induceres når hæmodynamik blevet konsekvent. Tilslut en 10 ml hepariniseret SyriNSÆ på stophanen, vinkelret og proximalt til kateteret. Der bør være 0,3 ml (30 enheder) i hepariniseret saltvand inde i sprøjten for at forhindre koagulation af trukket blod.
2. Indstil en timer til 1 min og åbn stophanen til hepariniseret sprøjte, så blodet kan blive trukket tilbage.
3. Trække blod ved at trække på sprøjten stemplet. Hvis for meget sug anvendes, vil et fartøj kollapse eller tætne mod kateteret åbning, og ingen blod vil blive trukket. Det bør være muligt at fjerne 7-9 ml blod i 1 min. Hvis dette ikke er tilfældet, fremføres kateteret yderligere ind i arterien og prøv igen. Vi finder, at 7-9 ml blod skal fjernes for at reducere MAP nær 30 mmHg målet blodtryk at opnå iskæmi. VIGTIGT Sørg trukket blod holdes ved 37 ° C for at undgå afkøling under blod reinfusion.
4. Efter et minut blodprøve (7-9 ml blod bør trækkes tilbage), gælder hæmostatiske klip til carotidarterierne og begynde entimer til 8 min. Umiddelbart kontrollere blodtrykket. Hvis kortet ikke er ved 30 mmHg, indgyde eller trække blod langsomt for at opnå 30 mmHg ± 1 mmHg. Fortsætte denne praksis i hele iskæmi at opretholde MAP på 30 mmHg. VIGTIGT Record blodtryk hele iskæmi-protokollen. Manglende reducere blodtrykket til 30 mmHg kan begrænse iskæmi. Monitor kerne og / eller hjerne temperatur nøje under reinfusion som stigninger eller fald i temperaturen kan påvirke hjerneskade.
5. Ved udgangen af ​​8 min, begynder reperfusion ved at fjerne de hæmostatiske klemmer og reinfusion blodet langsomt, 2 ml per minut.
6. Når blodet er reinjiceres kanylen kan fjernes fra den femorale arterie. For at undgå enhver blødning under post-op, sikre to separate knuder proksimalt for snit på arterien.
7. Sutur indsnit med et diskontinuerligt mønster ved hjælp af en invers skærende nål, med 5-0 VICRYL sutur. Denne sutur vil opløse, så det vil ikke require fjernelse. OBS Under proceduren, hvis det er tilstrækkelig anæstesi ikke kan nås med lavere isofluran, administrere en ekstra dosis af ketamin.

4.. Analgesi og Recovery

Dyrevelfærd er prioriteten under nyttiggørelse samt den kirurgiske procedure. Postoperativ pleje bør følge de specifikke retningslinjer i institutionen. Dyr, der global hjerneiskæmi er modtagelige for anfald. For at minimere beslaglæggelse forekomst er det vigtigt, opvågningsstuen har minimal stimulation, dvs lyde og synsforstyrrelser. Under vor brug af dyr protokollen, hus, vi postoperative dyr for 72 timer i et afsides rum til dette formål.

1. Efter indsnit er sutureres rotten kan vænnes fra respiratoren. Sluk isofluran og fortsætte ventilation på 30% oxygen/70% dinitrogenoxid indtil rotten begynder at ånde mod ventilatoren.
2. Indgiv 0,5 mg / kg butorphanol i 5 ml saltvand, subkutant mellem skulderbladene.
3. Hurtigt reinfusion blodet stige højre ventrikel forbelastning. Dette øger lungekredsløbet pres og kan forårsage lungeødem. Tegn på dette omfatter anstrengt respiration og knitrende lyde under respiration. Anvendelse positivt sluteksspirationstryk vil bidrage til at forbedre lungeødem.
4. Når frivillig kontrol med respiration genvundet, extubate, fjern termometer og slukke for varmetæppet. På dette punkt kan dyret anbringes i et opsving bur. Det opsving bur bør placeres så halvdelen af ​​buret er på toppen af ​​en vand cirkulerende tæppe (34 ° C) i de første 24 timer af reperfusion. Placer dyret på den del af buret gulvet over varmetæppet til støtte i temperatur vedligeholdelse. Når dyret begynder at komme fra anæstesi og analgesi, vil det bevæge sig rundt i buret for at thermoregulate selv. Dyrene vil blive opstaldet separat under post-op.
5. Dyret bør have ubegrænset adgang til vand. I to dage post-op, bør dette vand indeholde 4 mg / kg flydende Tylenol løsning. Ud over gnaverfoder er sødet morgenmadsprodukter tilvejebragt i buret for at stimulere spise og forhindre vægttab.
6. Dække halvdelen af ​​buret med en drapere og nøje overvåge postoperative forløb.
7. Som dyret genindvinder fra anæstesi er det vigtigt at overvåge for tegn på lidelse. Anstrengt eller inkonsekvent respiration kan være et tegn på angst, muligvis forårsaget af lungeødem eller luftvejsirritation under intubation. Butorphenol vil bedøve dyret, reducere aktiviteten dog mild aktivitet skal genoprettes inden for 1 time. Vi finder dyrene vil begynde at spise godbidder og drikke inden 4 timer af extubation. Ved 12 timer, bør normal adfærd og fodring aktivitet genoptages. Et andet tegn på angst er vægttab, et dyr skulle miste mere end 20% af den oprindelige kropsvægt i enhver 48 hr span, hvis overdreven vægttab is observeret bør dyret aflives.
8. Humane indgriben er nødvendig, hvis der forekommer krampeanfald. Denne type anfald aktivitet ses generelt 24 til 48 timer efter reperfusion. Anfald kan forårsage øget hjerneskade, der er uafhængig af den iskæmiske skade sig selv, bør derfor beslaglæggelse aktivitet betragtes som en udelukkelses kriterierne på plads forud for indledningen af undersøgelsen ^29.. Anfald kan opstå, når ingen er til stede, så det er vigtigt at genkende tegnene. Bedding vil blive forstyrret og muligvis bortvist fra buret. En postictal rotte vil have et mat disposition med hurtig, besværet vejrtrækning og / eller har en sårede eller blødning næse.

BEMÆRK Eventuelle tegn på smerte eller lidelse umiddelbart afhjælpes med smertestillende midler. Hvis sympotoms ikke afhjælpes med en dosis af analgetika eller fortsætter efter den fjerde i træk dosis af analgesi, vil dyret aflives, og udelukket fra undersøgelsen. Kirurgisk wounds bør inspiceres for ordentlig heling i otte dage post-op.

5.. Tissue Indsamling og behandling

Hjernen er fastsat af transcardial infusion af paraformaldehyd. Efter grov sektionering og cryoprotection, snap vi fastfryse hjernen og afsnittet om en kryostat. Disse hjerne sektioner farves med cresylviolet og afbildes på et lysmikroskop.

1. Narkosen ved at anbringe dyret i induktion kammeret og fyldning med 30% oxygen / 70% lattergas med 5% isofluran. Intubere dyret og udlufte ved 30% oxygen / 70% lattergas med 5% isofluran.
2. Forbered materiale til perfusion procedure. Fyld den ene bæger med 100 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) ved 4 ° C og et bæger med 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 ° C. Hjernen er skyllet med PBS efterfulgt af PFA, gennem en perfusion. Slange vil blive placeret i hvert bægerglas og forbundet med en tre-vejs stophane til enllow en glidende overgang fra PBS til PFA perfusion. Placer en stump 18 gauge kanyle på slangen og fylde linjen med PBS. Sikre, at der ikke er nogen bobler i nål og slange som luft kan danne en blodprop, der kunne forhindre perfusion. Også klar en lille beholder med PFA til nedsænkning fiksering af hjernen.
3. Brug en væskeansamling bakke, med tilstrækkelig kapacitet til at holde mindst 200 ml væske. På dette tidspunkt dyret burde have været ventileret med isofluran længe nok (mindst 3 minutter) for at nå dyb anæstesi.
4. VIGTIGT Sørg kirurgisk plan anæstesi er nået.
5. Fortsæt ved at lave et snit for at få adgang til brysthulen gennem maven. Klem faldende aorta. Når hjertet udsættes, indsætte stump 18 gauge nål gennem spidsen af ​​hjertet i aorta. Lav et lille snit i højre forkammer til at tillade perfusat at forlade dyret.
6. Tænd pumpen ved 50 ml / min, begyndende med PBS. Efter pumping 100 ml PBS, skifte stophanen til perfundere 100 ml PFA.
7. Tag hjernen, pas på ikke at beskadige vævet.
8. Placer hjernen i et væv matrix og skære mellem lillehjernen og cerebrum. Sektion forhjernen, ~ 3 mm fra forsiden og bagsiden af ​​hjernebarken. Dette vil producere tre sektioner, vil den midterste sektion indeholder hippocampus.
9. Placer hjernen sektioner i en krukke med nok PFA for komplet fordybelse. Immersion fix hjernen for præcis 2 timer.
10. For at beskytte væv fra skader forårsaget af frysning, er hjernen cryoproteced ved at erstatte PFA med 30% sucrose i PBS. Cryoprotection er komplet med vævsprøver synke i rørsukkeropløsningen (~ 24-48 timer).
11. Til snap fryse hjernen sektioner placere et bæger i tøris og fyld med 2-methylbutanol i ti minutter. Placer hjerneskiver i methylbutanol i 5 minutter, derefter overføre til en forseglbar beholder og opbevares ved -80 ° C indtil cryostved skæring.
12. Kryostatsnit hjernen på 20 um, indsamling mindst 3 sektioner på 3 hjerneatlas koordinater (The Rat Brain i stereotaktisk koordinater. Paxinos og Watson, pladedele 29, 31, 33 eller Bregma -2.8 mm, -3.3 mm, og -3.8 mm). Sektionerne er placeret på ladede objektglas og fik lov at tørre før opbevaring ved -80 ° C.
13. Cresylviolet (0,1% ved pH 3,5) plet 9 hjernesnit, 3 ved hver hjerneatlas koordinat.
14. Billede CA1 regionen af ​​hippocampus på 40x med et mikroskop monteret kameraet og indsætte en 300 um Målestokken parallelt med CA1 neuronal flyet. Gem billeder som TIFF-filer.

6.. Brain Damage Kvantificering

ImageJ, et gratis program, der tilbydes af National Institute of Health, kan bruges til at tælle og kvantificere de levedygtige neuroner, som vil repræsenterer omfanget af hjerneskade.

1. Åbne mikroskop TIFF-billeder med den "cell tæller 'plugin for ImageJ. Vælgmærkning farve og tælle neuroner indenfor grænserne af skalaen baren. Neuroner tælles baseret på simple inklusionskriterier baseret på neuronal morfologi (store, pyramideform), eller udelukkelseskriterier for mikrogliale / astrocyt morfologi (små runde eller lang rørformet form).
   VIGTIGT Vær konsekvent med inklusion / eksklusion kriterier mellem dias og enkeltpersoner, når optælling neuroner.
2. Optag neuron tæller og redde celletæller vinduet.
3. Neuron tæller skal være afsluttet inden to separate folk at nå konsistente, præcise neuron tæller.
4. Gennemsnittet af alle 9 billeder fra hvert dyr vil give en enkelt middelværdi "neuron count", hvilket er den kvantitative måling af CA1 hippocampus skader, der skal anvendes i statistisk analyse. Grupper kan sammenlignes statisk ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey s HSD test for post-hoc analyse eller, hvis normalitet testen mislykkes, en Kruskal-Wallis envejs ANOVA på rækker efterfulgt af Dunns post hoc analyse statistisk vurdere forskelle mellem grupperne. Specifik statistisk analyse bør dikteres af den enkelte undersøgelse design, kan man præsenteres her ikke være passende for de specifikke hypoteser, der testes.

Representative Results

Den 2VOH model af global hjerne iskæmi / reperfusion forårsager neuronal død i CA1-regionen af hippocampus. Figur 2 repræsenterer den skade produceret af 8 min på globale hjerneiskæmi, forarbejdet 14 dage efter reperfusion. 2A og 2B sammenligne hippocampusen fra fingeret og post-iskæmiske hjerner, farvet med cresylviolet. 2A viser en hippocampus fra en skinopereret rotte, som udviser normal morfologi, herunder en intakt CA1. Figur 2B viser hippocampus genstand for iskæmi / reperfusion, hvor den tandede gyrus, CA2 og CA3 har minimalt påvirket morfologi. De selektivt sårbare neuroner i CA1 hippocampus ikke overlever iskæmi / reperfusionsskade og kun spredte neuroner tilbage. Men dramatiske stigninger i infiltrerende makrofager og / eller microglia (IBA-1-positive celler), og reaktive astrocytter (GFAP-positive celler), er tydelig i CA1 hippocampal felt. Specifik immunofluorescent mærkning af neuroner med Neun, makrofag / microglia mærkning med Iba-1 og astrocyt mærkning med GFAP bekræfter disse resultater.

Figur 2C viser prøve neuron tælle vinduer til mikroskop billeder af CA1 ved 40x forstørrelse. Det øverste panel viser CA1 fra en skinopereret kontrol og den nederste panel viser CA1 følgende iskæmi / reperfusion. Den sårede CA1 viser en farvning, der omfatter microglia og astrocytter, som vises små og rørformet eller dråbeformede. Disse kan skelnes fra neuroner ved deres form. Intakte hippocampale neuroner, uanset i tandede gyrus er CA2 eller CA1, store med en cirkulær eller pyramideform.

Figur 2D er en grafisk analyse af 2VOH induceret skade kvantificeret ved CA1 neuronale tæller. Det kan konkluderes, at 8 min iskæmi produceret af 2VOH modellen kan forårsage en konsekvent og reproducible skade, der primært isoleres til CA1 hippocampus.

Figur 1. Eksperimentel Timeline. Den eksperimentelle tidslinje er en repræsentation af de kirurgiske trin og vævsbehandling.

Figur 2. Repræsentative resultater. Hippocampus skade i en ubehandlet rotte underkastes I / R (B) sammenlignet med en skinopereret styring rotte (A). Cresylviolet farves hippocampus (10X) [Surround] 40x forstørrelser CA1, CA2, CA3, hilus og GD (top leftà uret). (B) Skader er lokaliseret til CA1 hippocAmpus. (C) Repræsentative tælle vinduer anvendes til neuron tælling og skader kvantificering i en skinopereret kontrol dyr (top, kontrol) og et dyr udsat for global hjerneiskæmi (bund, I / R). (D) repræsentant kvantificering af CA1 hippocampus neuron tæller fra et upubliceret forsøg (gennemsnitlig + standardafvigelse n = 8, p <0,05).

Discussion

Den her beskrevne model giver en iskæmisk fornærmelse til hjernen, der kan opstå som følge af hjertestop og genoplivning, giver en skade svarende til den, der findes hos mennesker. Denne fremgangsmåde til fremstilling af den globale hjerneiskæmi er en af ​​flere protokoller. Vi bruger denne protokol fremmest for sin forholdsvis lav dødelighed, hurtig genopretning og reproducerbare resultater. Den hjertestop / genoplivning model er velsagtens den mest klinisk relevant model, men teknisk set den mest vanskelige at konstant at reproducere. Den 4VO model for globale hjerneiskæmi er en anden almindeligt anvendte protokol, værdifuld i den kendsgerning, at alle fire medvirkende fartøjer okkluderet under iskæmi. Denne model har også ulemper, som omfatter flere operationer og mulighed for neuroprotektiv prækonditionering. Den 4VO model er blevet tilpasset, så forbigående okklusion af alle fire skibe i løbet af en procedure for at producere iskæmi, men operationen er stadig tekniskely kræver ^30.

Variationer på 2VOH har vist sig at producere en række resultater ^31,32. Varigheden af ​​iskæmi og graden af ​​hypotension er de vigtigste variabler, der kan påvirke resultatet. Rapporter har vist, at hvis blodtrykket ikke reduceres nok producerede skade kan være inkonsekvent eller ensidige hos rotter ^30.. Vi har fundet 30 mmHg at være en optimal grad af hypotension, fordi den producerer pålidelige iskæmi uden at forårsage bemærkelsesværdige perifer skade. Det paradigme producerer iskæmi karakteriseres som alvorlige, men efter vores protokol vil reducere den ellers øgede chancen for komplikationer. Den alvorlige karakter af fornærmelse kan være årsagen lille variation i fysiologiske parametre mellem dyr, ikke påvirker typisk skade konsistens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
Software
ImageJ	NIH