Occlusion 2 Navire / Hypotension: un modèle de rat d'ischémie cérébrale globale

Summary

Occlusion carotidienne bilatérale associée à une hypotension systémique produit ischémie globale du cerveau chez le rat, causant des dommages à l'hippocampe avec sévérité reproductible. sujets animaux sont altérées avec des modèles prévisibles de lésions cérébrales, ils récupèrent opportunément, et les taux de mortalité sont relativement faibles.

Abstract

L'arrêt cardiaque suivi d'une réanimation se traduit souvent par des dommages au cerveau dramatique causée par l'ischémie et la reperfusion subséquente du cerveau. Ischémie globale du cerveau produit des dommages à des régions spécifiques du cerveau révélés être très sensible à l'ischémie ^1. Neurones de l'hippocampe ont une plus grande sensibilité aux agressions ischémiques par rapport à d'autres populations de cellules, et en particulier, la région CA1 de l'hippocampe est particulièrement vulnérable à l'ischémie / reperfusion ^2.

La conception des interventions thérapeutiques, ou l'étude des mécanismes impliqués dans la lésion cérébrale, nécessite un modèle qui produit des dommages semblables à l'état clinique et de façon reproductible. Occlusion du vaisseau carotide bilatérale avec hypotension (2VOH) est un modèle qui produit une ischémie du cerveau antérieur réversible, imitant les événements cérébraux qui peuvent survenir lors de l'arrestation et de réanimation cardiaque. Nous décrivons un modèle modifié de Smith et al. (1984) ², En tant que premier présenté sous sa forme actuelle en ³ Sanderson et al. (2008), qui produit des blessures reproductible sélectivement les régions du cerveau vulnérables ^3-6. La fiabilité de ce modèle est dicté par un contrôle précis de la pression artérielle systémique pendant hypotension appliquée, la durée de l'ischémie, un contrôle étroit de la température, un régime d'anesthésie spécifique, et diligent soins post-opératoires. Un accident ischémique 8 minutes produit la mort cellulaire des neurones CA1 hippocampique qui progresse au cours de 6 à 24 heures de reperfusion, tandis que les régions du cerveau les moins vulnérables sont épargnés. Cette mort cellulaire progressive est facilement quantifiable après 7-14 jours de reperfusion, comme une perte presque complète des neurones CA1 est évident en ce moment.

En plus de ce modèle de lésion cérébrale, nous présentons une méthode de quantification des dommages CA1 l'aide d'un simple, mais complète, de la méthodologie. Surtout, la quantification peut être réalisée à l'aide d'un simple microscope caméra montée, unda gratuit ImageJ (NIH) plugin, éliminant ainsi la nécessité pour les logiciels stéréologie coûts prohibitifs et une scène microscopique motorisé pour l'évaluation des dommages.

Introduction

Les lésions cérébrales à la suite d'une arrestation et d'AVC cardiaque est une cause majeure de décès et d'invalidité à long terme. Alors que la réanimation cardiorespiratoire pour les victimes d'un arrêt cardiaque réussit à rétablir la circulation spontanée dans environ 70.000 patients par an aux Etats-Unis ^7,8 au moins 60% de ces patients décèdent par la suite à l'hôpital à la suite d'importants dommages au cerveau et seulement 3-10% des patients réanimés peuvent reprendre leurs anciens modes de vie ^9,10. De toute évidence, la compréhension des mécanismes qui conduisent à des lésions cérébrales suite à une ischémie globale du cerveau et de concevoir des interventions thérapeutiques visant à minimiser le traumatisme neurologique est d'une importance critique.

ischémie cérébrale peut être modélisée en utilisant plusieurs méthodes. Le plus souvent, l'ischémie cérébrale est produite chez le rongeur par occlusion d'un vaisseau sanguin dans le cerveau, l'artère cérébrale moyenne, produisant ainsi un accident vasculaire cérébral ischémique focal ^11,12. Bien que cliniquement importante,ischémie cérébrale focale n'est pas une méthode précise pour étudier les lésions cérébrales produites par arrêt / réanimation cardiaque. Pour modéliser ce paradigme clinique le cerveau entier doit être effectué ischémique suivie par la réintroduction du flux sanguin. Pour imiter étroitement cette présentation clinique, les chercheurs induisent expérimentalement arrêt cardiaque suivi d'une réanimation avec RCR et la défibrillation ^13,14. Ce modèle est cliniquement pertinente, les temps de réanimation cependant imprévisibles peuvent augmenter la variabilité et peuvent faire l'analyse des données difficiles à interpréter. En outre, ce modèle est associé à un taux de mortalité élevé, augmentant encore nombre d'animaux nécessaires pour tester une hypothèse. Etude de la réponse cérébrale à une ischémie globale et / ou de reperfusion dans une insulte plus reproductible, cohérente et survivre peut être préféré.

Ischémie globale peut être induite dans le cerveau, tout en préservant une certaine circulation sanguine systémique. Cela permet de réduire la mortalité, tout en permettant investigation des mécanismes de lésions tissulaires dans le cerveau ^2. Pour produire une ischémie globale du cerveau, il est nécessaire d'interrompre ou de limiter considérablement l'écoulement dans les quatre vaisseaux qui irriguent le cerveau, les artères carotides internes et les artères vertébrales. Ces navires alimentent le cerveau avec le flux sanguin à travers une structure vasculaire appelé le Cercle de Willis, qui forme une boucle anastomotique. Cette architecture permet vasculaire du cerveau à retenir perfusion en cas d'occlusion vasculaire proximale. Par conséquent, pour induire une ischémie complète du cerveau, le flux sanguin à travers tous les navires de cotisation doit se produire. Carotide occlusion peut être accompli en utilisant un cou ventral minimalement invasive coupe-bas et l'application de clips anévrisme pendant une période désirée. Interruption de la circulation sanguine à travers les artères vertébrales peut être difficile, car ils sont incased dans les trous transversale de la colonne vertébrale. Les enquêteurs se sont penchés sur cette electrocauterizing par les artères vertébrales 24-48 heures avant carotideocclusion et l'ischémie cérébrale (4VO modèle) ^15. Contrairement à cette approche, Smith et al. Développé une méthode pour induire une ischémie globale du cerveau en réduisant signifie la pression artérielle (MAP) systémique à 40 mmHg pour réduire perfusion à travers les artères vertébrales à un point où le débit sanguin est perdue ou fortement réduit ² . Lorsqu'il est couplé avec l'occlusion carotidienne, cette méthode produit tout au long de l'ischémie du cerveau antérieur, résultant en un modèle de lésion cérébrale qui imite étroitement que des survivants d'arrêt cardiaque. Dans un autre raffinement de cette méthode, le modèle que nous présentons ici nécessite une réglementation MAP serré à 30 mmHg ± 1mHg pendant toute la 8 min d'ischémie. Nous avons trouvé cette modification améliore la reproductibilité des lésions cérébrales induites par ce modèle tout en préservant le faible taux de mortalité de la technique originale conçue par Smith et al.

Le phénotype précise de la mort cellulaire et de l'étendue globale de dommages aux tissus causés parLe modèle présenté ici est directement dépendante de la durée ischémique ^16. Après 8 minutes d'ischémie, neurones CA1 présentent des retardé la mort cellulaire, suggérant qu'il existe une fenêtre temporelle pour l'intervention thérapeutique au cours de la phase de reperfusion ^15,17. Au début de la reperfusion, les neurones retrouver rapidement la fonction et pas de mort cellulaire immédiate est détectable ^18. Cependant, cette insulte provoque l'induction de cascades de mort cellulaire (apoptose) qui aboutissent à la libération de protéines apoptogènes des mitochondries, y compris cytochrome c, entre 4-6 heures de reperfusion ^3,19. Entre 6 et 24 heures de reperfusion, les neurones de l'hippocampe CA1 se sont engagés à mort de la cellule, et le programme de mort cellulaire par apoptose est exécutée ^19. Il convient de noter que le phénotype de mort cellulaire responsable de la lésion ischémique est très controversée. Les premières études ont suggéré nécrose est la principale phénotype de mort cellulaire ^20,21, tandis que d'autres d'autres rapportent apoptosis comme le principal mécanisme de ^22,23. Au total, les données actuelles suggèrent que les cellules meurent d'un spectre de phénotypes de mort cellulaire allant de l'apoptose classique à la nécrose. Le mode précis de la mort cellulaire dépend de nombreux facteurs, avec le degré de contribution de chaque phénotype en fonction de la gravité de l'insulte, parmi d'autres facteurs ^24,25. En 24 heures de reperfusion, les cellules meurent possèdent noyaux pycnotiques, cytosol condensée avec une preuve claire de contenus cellulaires globales, et la perte de la morphologie mitochondriale fonctionnel. Les cellules mortes sont ventilés, engloutis par les cellules immunitaires comme les macrophages et / ou de la microglie, et effacées de la région hippocampique CA1. En 4-7 jours de reperfusion, les cellules mortes sont éliminées, et tout ce qui reste sont des cellules inflammatoires et les cellules gliales activées ^17,26. Par conséquent, les 7 jours de reperfusion représente un moment optimal où CA1 mort neuronale hippocampique peut être quantifiée en utilisant des taches de cellules simples, non spécifiques, eny compris Le violet de crésyl ou hématoxyline-éosine et comptés sur la base de critères d'inclusion morphologiques. Les cellules restantes à cet intervalle de reperfusion tardive peuvent être considérés comme des cellules survivantes, fournissant ainsi un indice de lésions cérébrales.

Si ce modèle doit être utilisé pour tester des interventions thérapeutiques, il est suggéré que le protocole expérimental suivi des critères d'escalier (Stroke Therapy Industrie Académique Table ronde) ^27. Ces directives doivent être suivies lors de la conception et la réalisation d'une étude, mais ne sont pas discutés ici.

Protocol

1. Préparation

Tous les expérimentations animales doivent être conformes aux directives institutionnelles et obtenir une approbation par un comité respectif de protection des animaux avant l'initiation. Toutes les procédures présentées ici ont été approuvés par la Wayne State University Institutional Animal Care et utiliser Comité et suivre les lignes directrices sur le traitement éthique des animaux mis en avant dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et les Principes du Gouvernement des États-Unis pour le l'utilisation et l'entretien des animaux vertébrés utilisés dans les essais, de recherche et de formation. Avant de commencer la chirurgie, préparer le matériel chirurgical nécessaire et une cage de récupération de la chirurgie. Cette procédure est une chirurgie de survie et il est donc nécessaire de pratiquer une technique stérile.

1. Pour faire un cathéter vasculaire, couper une longueur de 8 pouces de tuyaux en polyéthylène 50 (PE50) et insérer une aiguille de calibre 23 émoussée dans une extrémité. Cathéters peuvent être achetés individuellement pré-stérilisé ou achetés en bULK puis stérilisés avec de l'éthylène glycol au besoin.
2. Fixez cette aiguille sur un port d'un robinet à trois voies et placer un autre robinet à trois voies sur le port en face. Hépariner les robinets et le cathéter en exécutant solution saline par l'héparine. Connecter une seringue de 10 ml sérum physiologique sur le robinet d'arrêt perpendiculaire et distale de la sonde. Raccorder le robinet d'arrêt en aval de la sonde dans le tube de capteur de pression, remplir le système avec une solution saline et de supprimer les bulles d'air.
3. Configurez la cage de récupération conformément à la réglementation de l'utilisation des animaux. La salle de réveil doit être calme et avoir un faible trafic. Tournant important sur ​​la table aspirante ou un système d'évacuation des gaz similaire avant la chirurgie de début de filtrer vaporisé isoflurane.

2. Préparation chirurgicale

Des rats Sprague-Dawley (300-350 g) sont utilisés dans le modèle 2VOH de l'ischémie du cerveau antérieur mondiale. L'anesthésie est induite et maintenue avec de l'isoflurane et supplemented avec une dose sous-dissociative de kétamine. Nous avons observé que l'anesthésie entretenue par isoflurane seul entraîne une fréquence accrue de saisie lors de la récupération post-op. Les crises peuvent contribuer à des dommages et de la mortalité neuronale, ce qui aura un impact sur la reproductibilité de ce modèle. Complétant l'anesthésie à la kétamine permet une dose beaucoup plus faible de l'isoflurane à atteindre un niveau chirurgical de l'anesthésie. En utilisant une couverture thermique homéostatique permet une régulation stricte de la température centrale. La procédure chirurgicale implique l'artère carotide coupe-bas et l'isolement, et l'artère fémorale coupée vers le bas et une canule.

REMARQUE Il est important de garder des registres détaillés lors de chaque intervention chirurgicale individu. Les variations de la température centrale, la pression artérielle, ou d'autres variables physiologiques qui surviennent avant ou pendant la chirurgie peut modifier radicalement les résultats, et les dossiers peuvent être analysés afin de s'assurer de la cohérence procédurale entre les individus et les groupes. Cohérencedans les paramètres physiologiques de l'animal peut être améliorée par le jeûne des animaux avant l'intervention chirurgicale. Les expérimentateurs sont encouragés à déterminer la méthode qui donne de l'hémodynamique pré-exploités les plus cohérents et les concentrations de glucose sérique pour leurs études.

1. Induire une anesthésie en plaçant le rat dans une chambre d'induction et de remplir avec un mélange d'oxyde nitreux oxygen/70% de 30% à 5% d'isoflurane. Intuber avec un cathéter de calibre 12, en utilisant un laryngoscope de rongeurs et ventiler avec un mélange d'oxyde nitreux oxygen/70% 30% avec 2,5% d'isoflurane. Le taux de ventilation devrait être de 80 respirations par minute à 2,5 ml par respiration.
2. Faire une injection intra-péritonéale de kétamine (20 mg / kg) dans une solution saline et de réduire l'isoflurane à 1,5%. IMPORTANT Il est impératif de surveiller le niveau de l'anesthésie tout au long de la procédure afin d'assurer plan chirurgical adéquat d'anesthésie. Pour vérifier la profondeur de l'anesthésie, de pincement entre les chiffres des membres postérieurs, tout en surveillant la pédale réflexe. Si le réflexe estabsent, l'anesthésie est suffisante. Après cannulation de l'artère fémorale, la pression sanguine peut être utilisé comme un indicateur de niveau d'anesthésie. Gardez la dose d'isoflurane aussi bas que possible tout en maintenant un plan chirurgical de l'anesthésie pour minimiser le risque de convulsions post-ischémique.
3. Incisions seront faites sur le cou et dans la région pelvienne. Rasage du cou et le bassin droit, où la cuisse se réunit l'abdomen. Orientez le rat dans une position couchée sur le homéostatique thermo-couverture et insérez le thermomètre rectal utiliser un lubrifiant chirurgicale. Appliquer du lubrifiant pour protéger les yeux. Une ampoule de 60 watts peut aider à réguler la température. L'ampoule ne doit jamais être plus proche de 8 pouces à partir de l'animal. Températures IMPORTANTES ci-dessus ou en dessous de la température physiologique normale (37 ° C) peuvent grandement influencer les dommages neurologiques final. Maintenir la température à coeur de 37 ° C ± 0,5 ° C.
4. Frotter les zones d'incision avec de la bétadine et rincer avec de l'éthanol à 70%. Répétez cette two plus de temps. Placez un champ opératoire sur le rat, et percer des trous pour exposer les zones d'incision. Artères carotides et fémorales importantes peuvent être isolés sans causer de traumatisme à la musculature environnante, ce qui permettra d'améliorer la récupération et réduit le besoin subséquent de l'analgésie post-opératoire.
5. En attendant une anesthésie adéquate, utiliser un scalpel n ° 10 de faire une incision médiane le long du cou, puis, à l'aide hémostatiques carrément disséquer entre les glandes salivaires jusqu'à atteindre le muscle sterno, le groupe de muscles de la ligne médiane de premier plan couvrant la trachée. Encore une fois en utilisant la technique de dissection minutieuse, séparer les principaux groupes musculaires du sterno du sterno, bilatéralement. Ces deux groupes de muscles forment une échancrure triangulaire qui peut être utilisée comme un point de repère pour localiser le faisceau vasculo-nerveux qui contient l'artère carotide. Les branches carotides communes dans les artères carotides internes et externes. Isoler l'artère carotide commune à proximité de la bifurcation.
6. Séparez délicatement les deux muscles et de localiser l'artère carotide. Pour aider à identifier ce regard de navire pour une impulsion. Isoler les artères carotides des deux côtés par le passage d'un ~ 5 pouces de longueur de 3-0 suture de soie sous le navire. Dégagez fascia des vaisseaux. ATTENTION Le nerf vague et chaînes sympathiques sont inclus dans le paquet vasculo-nerveux col de l'utérus et des précautions doivent être prises pour éviter de l'endommager lors de l'isolation de l'artère carotide.
7. Utilisez des ciseaux pour faire une deuxième incision à l'aine, le long de l'indentation où les muscles de la cuisse membre postérieur répond l'abdomen. Disséquer sous le muscle abdominal, ainsi que les muscles de la cuisse jusqu'à ce que vous atteignez le ligament inguinal. Cela permettra d'exposer le paquet vasculo-nerveux fémoral. Isoler soigneusement l'artère fémorale par le passage d'un ~ 5 pouces de longueur de 3-0 suture de soie sous le navire. Dégagez fascia laissant 5-7 mm de navire exposé.
8. Faire un nœud permanent à l'extrémité distale de l'artère exposée.
9. Appliquer une traction sur le fil de suture à l'extrémité proximale de l'artère pour occlure le flux sanguin, en tirant les fils de suture enseignées. Faire une petite incision dans la partie supérieure de la cuve avec des ciseaux ophtalmiques. Traction insuffisante sur le navire entraîner des saignements, qui peut être arrêté par une traction plus lourd. Fermez le cathéter au robinet d'arrêt.
10. Utilisation d'un introducteur vasculaire, insérer le tube de cathéter dans le vaisseau, 7-9 mm après l'incision de la cuve et vers la ligne médiane. Une fois le cathéter est placé à la distance souhaitée, attacher le noeud lâche autour du navire et le cathéter pour le fixer en place. Retirer traction du navire et lui permettre de s'allonger naturellement.
11. Administrer 0,3 ml d'héparine (100U/ml dans une solution saline), par voie intraveineuse. Rincer toutle sang hors du cathéter avec une petite quantité de solution saline pour empêcher la coagulation. Allumez le moniteur de pression et calibrer l'équipement. Ouvrir les robinets d'arrêt pour permettre au transducteur pour détecter la pression sanguine. Pour obtenir des mesures précises de la pression artérielle, le positionnement du système ne doit pas être modifié après calibration.
12. L'isoflurane dosage doit être ajusté pour obtenir une pression artérielle moyenne (PAM) de 110 mmHg à 130 mmHg. Cette carte devrait être indicative d'avion chirurgical adéquat d'anesthésie.

3. Protocole d'ischémie

Comme mentionné précédemment, quatre navires fournissent perfusion au cerveau. Occlusion proximale des deux artères carotides n'aboutira pas à une ischémie cérébrale parce que les artères vertébrales seront compenser par le polygone de Willis. Il a été montré que l'occlusion carotidienne, associée à une hypotension systémique induite, limitera perfusion à travers les artères vertébrales entraînant une ischémie cérébrale. Ici, nous descrBIE le protocole pour prélever du sang pour produire une hypotension et le serrage des artères carotides pour produire contrôlée, ischémie réversible. Voir Figure 1.

l'oxygène du sang et le dioxyde de carbone, la concentration de glucose et le pH peuvent varier selon les individus dans le groupe de l'échantillon et de provoquer une variation de la blessure. La surveillance de ces variables physiologiques peut réduire la variabilité de l'infarctus. Comme mentionné précédemment, la température est un autre paramètre qui est important de réglementer, mais la température du cerveau peut ne pas correspondre à la température de base, comme la perfusion est fortement limitée au cours de l'ischémie expérimentale ^28. Nos résultats d'installation chirurgical spécifiques à des changements de température dans le cerveau qui change de miroir à la température à coeur au cours de l'ischémie. Cependant, il est important pour l'expérimentateur de déterminer ce empiriquement en surveillant la température du cerveau avec des thermocouples ou par d'autres moyens à uniformiser la procédure. Si la température du noyau ne reflète température du cerveautempérature, il est important de maintenir la température du cerveau normothermiques pendant toute la procédure, quelle que soit la température à cœur.

Randomisation dicte que le chirurgien rend aléatoire l'animal à l'ischémie ou d'un groupe de contrôle opérés de manière fictive à ce point. Sham chirurgie suivra toutes les procédures exactement les mêmes que les animaux ischémiques à l'exclusion de toute réduction de la pression artérielle et l'occlusion de l'artère carotide. Il est important que les contrôles opérés de manière fictive être sous la même dose d'anesthésie pour une durée qui correspond à celle des animaux ischémiques. S'il ya un groupe de traitement inclus, ce qui nécessite une anesthésie avant ou après une ischémie, une imposture et groupes d'ischémie non traités doivent correspondre à la dose d'anesthésie et la durée du groupe de traitement.

1. Prêt pinces hémostatiques et applicateurs de clips. Clips devrait complètement occulter le navire sans causer de traumatisme. L'ischémie peut être induite lorsque l'hémodynamique sont devenus cohérente. Connectez un ml héparine Syri 10ESN sur le robinet d'arrêt, perpendiculairement et proximale au cathéter. Il doit être de 0,3 ml (30 unités) de sérum physiologique hépariné à l'intérieur de la seringue pour empêcher la coagulation du sang prélevé.
2. Réglez une minuterie pendant 1 min et ouvrir le robinet à la seringue héparine, afin que le sang peut être retirée.
3. Retirer le sang en tirant sur le piston de la seringue. Si trop d'aspiration est appliquée, le navire va s'effondrer ou sceller contre l'ouverture du cathéter et le sang ne sera établi. Il devrait être possible de retirer 7-9 ml de sang en 1 min. Si ce n'est pas le cas, le cathéter avancé plus loin dans l'artère et réessayez. Nous constatons que 7-9 ml de sang doit être enlevée pour réduire le MAP près de 30 mmHg, la pression artérielle cible pour atteindre l'ischémie. IMPORTANT S'assurer que le sang prélevé est maintenue à 37 ° C pour éviter le refroidissement pendant la réinjection de sang.
4. Après une prise de sang minute (7-9 ml de sang devrait être retiré), s'applique pinces hémostatiques pour les artères carotides et de commencer uneminuterie pour 8 min. Vérifier immédiatement la pression artérielle. Si la carte n'est pas à 30 mmHg, infuser ou prélever du sang lentement pour atteindre 30 mmHg ± 1 mmHg. Continuer cette pratique tout au long de l'ischémie de maintenir MAP de 30 mmHg. Enregistrement IMPORTANT pression artérielle tout au long du protocole d'ischémie. Le défaut de réduire la pression artérielle de 30 mmHg peut limiter l'ischémie. Moniteur noyau et / ou de la température du cerveau étroitement pendant réinjection que des augmentations ou des diminutions de température peuvent influer sur les lésions cérébrales.
5. A la fin de 8 min, commencer reperfusion en enlevant les pinces hémostatiques et réinjecter le sang lentement, 2 ml par minute.
6. Quand le sang a été réinjectées la canule peut être retirée de l'artère fémorale. Afin d'éviter tout saignement pendant la post-op, sécurisées deux noeuds distincts à proximité de l'incision sur l'artère.
7. Suturer les incisions avec un motif discontinu à l'aide d'une aiguille de coupe inverse, avec 5-0 suture Vicryl. Cette suture va se dissoudre, afin de ne pas rEquire enlèvement. NOTE Durant la procédure, si suffisamment d'anesthésie ne peut être atteint avec des niveaux inférieurs de l'isoflurane, administrer une dose supplémentaire de kétamine.

4. Analgésie et de récupération

La protection des animaux est une priorité lors de la récupération ainsi que la procédure chirurgicale. Les soins post-opératoires doivent suivre les directives spécifiques de l'institution. Les animaux qui subissent une ischémie globale du cerveau sont sujettes aux crises. À minimiser l'apparition des crises, il est important que la salle de récupération ont une stimulation minimale, c'est à dire des bruits et des troubles visuels. Selon notre protocole d'utilisation des animaux, nous maison des animaux post-opératoires pendant 72 heures dans une chambre isolée à cet effet.

1. Après les incisions ont été suturé le rat peut être sevré du ventilateur. Éteignez l'isoflurane et poursuivre la ventilation à 30% oxygen/70% de protoxyde d'azote jusqu'à ce que le rat commence à respirer contre le ventilateur.
2. Administrer 0,5 mg / kg butorphanol dans 5 ml de solution saline, par voie sous cutanée entre les omoplates.
3. Réinjecter rapidement le sang peut augmenter la précharge ventriculaire droite. Cela augmente la pression de la circulation pulmonaire et pourrait provoquer un oedème pulmonaire. Les signes de cette include respiration laborieuse et craquements lors de la respiration. Application pression expiratoire positive contribuera à améliorer l'œdème pulmonaire.
4. Lorsque le contrôle volontaire de la respiration est retrouvé, l'extubation, retirez le thermomètre et éteindre la couverture chauffante. A ce stade, l'animal peut être placé dans une cage de récupération. La cage de récupération doit être positionné de façon moitié de la cage est au-dessus d'une couverture de circulation d'eau (34 ° C) pendant les 24 premières heures de reperfusion. Placer l'animal sur la partie du plancher de la cage sur la couverture chauffante pour faciliter le maintien de la température. Une fois que l'animal commence à se remettre de l'anesthésie et l'analgésie, il se déplace autour de la cage pour se thermorégulation. Les animaux seront logés séparément au cours de post-op.
5. L'animal doit avoir un accès illimité à l'eau. Pendant deux jours post-opératoires, cette eau doit contenir 4 Tylenol solution liquide mg / kg. En plus de rongeur, sucré céréales de petit déjeuner est fourni dans la cage pour stimuler la consommation et prévenir la perte de poids.
6. Couvrir la moitié de la cage avec un drap et suivre de près la récupération post-opératoire.
7. Comme l'animal se remet de l'anesthésie, il est important de surveiller les signes de détresse. Travaillé ou respiration incompatible peut être un signe de détresse, peut-être causée par un oedème pulmonaire ou une irritation des voies respiratoires lors de l'intubation. Butorphenol seront endormir l'animal, réduction de l'activité, mais légère activité devrait être rétabli à 1 h. Nous trouvons des animaux vont commencer à manger des friandises et boire dans les 4 heures de l'extubation. En 12 heures, un comportement normal et l'activité d'alimentation doivent être repris. Un autre signe de détresse est la perte de poids, un animal ne doit pas perdre plus de 20% du poids corporel initial de quelque 48 heures la durée, si la perte de poids excessive is observé l'animal devrait être euthanasié.
8. Intervention humaine est nécessaire si les crises se produisent. Ce type d'activité épileptique est généralement considérée de 24 à 48 heures après la reperfusion. Les crises peuvent entraîner une augmentation des dommages au cerveau, qui est indépendante de la lésion ischémique en soi, donc l'activité de saisie doit être considérée comme un critère d'exclusion mis en place avant le début de l'étude ^29. Les crises peuvent se produire lorsque personne n'est présent, il est donc important de reconnaître les signes. Literie sera perturbée et peut-être expulsé de la cage. Un rat postictal aura une disposition langoureux avec rapide, une respiration difficile et / ou avoir un nez cassé ou des saignements.

Remarque Les signes de douleur ou de détresse sont immédiatement atténués par des analgésiques. Si sympotoms ne sont pas soulagés par une dose d'analgésiques ou persistent après la quatrième dose consécutive de l'analgésie, l'animal sera euthanasié et exclus de l'étude. Wo chirurgicaleunds doivent être inspectés pour une bonne cicatrisation pendant huit jours post-opératoires.

5. Collection de tissus et de traitement

Le cerveau est fixé par perfusion transcardial de paraformaldéhyde. Après sectionnement brut et cryoprotection, nous cassons geler le cerveau et la section sur un cryostat. Ces sections du cerveau sont colorées avec du violet de crésyl et imagés sur un microscope optique.

1. Induire une anesthésie de l'animal en le plaçant dans la chambre d'admission et de remplissage de 30% d'oxygène / 70% de protoxyde d'azote à 5% d'isoflurane. Intuber et ventiler l'animal à 30% d'oxygène / protoxyde d'azote de 70% avec 5% d'isoflurane.
2. Préparer le matériau pour la procédure de perfusion. Remplissez un bécher avec 100 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C et un bécher avec 100 ml de paraformaldéhyde 4% (PFA) à 4 ° C. Le cerveau est rincé avec du PBS suivi par PFA, par l'intermédiaire d'une pompe de perfusion. Tubing sera placé dans chaque bécher et reliée par un robinet à trois voies pour uneermettez une transition en douceur à partir de PBS à PFA perfusion. Placer une aiguille de calibre 18 émoussée sur le tube et remplissez la ligne avec PBS. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans l'aiguille et le tube que l'air peut former une embolie, ce qui pourrait empêcher la perfusion. Aussi, prête un petit récipient avec PFA pour une immersion fixation du cerveau.
3. Utilisation d'un bac de collecte de fluide, avec une capacité suffisante pour contenir au moins 200 ml de liquide. A ce stade, l'animal doit avoir été ventilé avec de l'isoflurane pendant assez longtemps (au moins 3 min) pour atteindre une anesthésie profonde.
4. IMPORTANT Assurez plan chirurgical de l'anesthésie est atteint.
5. Continuez en faisant une incision pour accéder à la cavité thoracique à travers l'abdomen. Fixer l'aorte descendante. Quand le cœur est exposé, insérer le aiguille de calibre 18 émoussée par la pointe du cœur dans l'aorte. Faire une petite incision dans l'oreillette droite pour permettre à perfusion pour sortir l'animal.
6. Mettre la pompe à 50 ml / min, en commençant par PBS. Après Pumping 100 ml de PBS, mettez le robinet pour perfuser 100 ml de PFA.
7. Retirez le cerveau, en prenant soin de ne pas endommager le tissu.
8. Placez le cerveau dans une matrice de tissu et couper entre le cervelet et le cerveau. Section du cerveau antérieur; ~ 3 millimètres de l'avant et à l'arrière du cortex cérébral. Ceci va produire trois sections, la section du milieu contiendra l'hippocampe.
9. Placez les coupes de cerveau dans un bocal avec assez de PFA pour une immersion totale. Immersion réparer le cerveau pendant exactement 2 heures.
10. Pour protéger les tissus contre les dommages causés par le gel, le cerveau est cryoproteced en remplaçant la PFA avec 30% de saccharose dans du PBS. Cryoprotection est complète avec les échantillons de tissu s'enfoncent dans la solution de saccharose (24-48 ~ h).
11. Pour accrocher geler les coupes de cerveau, placez un bol de glace sèche et remplir avec 2 méthylbutanol pendant dix minutes. Placer les tranches de cerveau dans le méthylbutanol pendant 5 min, puis les transférer dans un récipient hermétique et conserver à -80 ° C jusqu'à ce que cryostà la coupe.
12. Section cryostat du cerveau à 20 um, recueillir au moins 3 sections à 3 cerveau atlas coordonnées (le cerveau du rat en coordonnées stéréotaxiques. Paxinos et Watson, sections de plaques 29, 31, 33 ou Bregma -2.8 mm, -3.3 mm, et -3.8 mm). Les sections sont placées sur des lames de microscope chargées et laisser sécher avant de les stocker à -80 ° C.
13. Le violet de crésyl (0,1% à pH 3,5) tache 9 coupes de cerveau, 3 à chaque cerveau atlas coordonnées.
14. L'image de la région CA1 de l'hippocampe à 40x avec un microscope monté caméra et insérer une échelle 300 um barre parallèle au plan de neurones CA1. Enregistrer des images au format TIFF.

6. Brain Damage Quantification

ImageJ, un programme gratuit offert par l'Institut national de la santé, peut être utilisée pour compter et quantifier les neurones viables, qui représenteront l'étendue des dommages au cerveau.

1. Ouvert microscope images TIFF avec le «compteur de cellules« plug-in de ImageJ. Sélectionnez unele marquage couleur et les neurones de comptage dans les limites de la barre d'échelle. Les neurones sont comptabilisés sur la base des critères d'inclusion simples basées sur la morphologie neuronale (grande forme pyramidale) ou des critères d'exclusion pour les microglies / astrocyte morphologie (petite forme ronde ou longue tubulaire).
   IMPORTANT Soyez cohérent avec inclusion / exclusion critères entre les diapositives, et les individus lors du comptage des neurones.
2. Les comptes d'enregistrements de neurones et sauver la fenêtre de compteur de cellules.
3. Compte neurones doivent être complétées par deux personnes distinctes pour atteindre, compte de neurones précis et homogènes.
4. La moyenne de tous les 9 images provenant de chaque animal fournira une moyenne unique "count neurone", qui est la mesure quantitative des lésions hippocampiques CA1 à être utilisés dans l'analyse statistique. Les groupes peuvent être comparés statique en utilisant une ANOVA à un facteur suivie par un test de Tukey HSD pour une analyse post hoc, ou, le cas test de normalité échoue, une analyse de variance à sens unique Kruskal-Wallis sur les rangs suivie po de Dunnanalyse st hoc pour évaluer statistiquement les différences entre les groupes. Analyse statistique spécifique devrait être dicté par la conception de l'étude individuelle, celle présentée ici peut ne pas être appropriée pour les hypothèses spécifiques testés.

Representative Results

Le modèle 2VOH d'ischémie / reperfusion cérébrale globale provoque la mort des neurones dans la région CA1 de l'hippocampe. Figure 2 représente la blessure produite par 8 min d'ischémie globale du cerveau, traitement 14 jours après la reperfusion. Figures 2A et 2B comparer les hippocampes d'imposture et cerveaux post-ischémiques, colorées avec du violet de crésyl. Figure 2a montre un hippocampe d'un rat opération fictive qui présente une morphologie normale, y compris une CA1 intact. Figure 2B montre l'hippocampe soumis à une ischémie / reperfusion, où le gyrus denté, CA2 et CA3 ont très peu touchés morphologie. Les neurones sélectivement vulnérables de la CA1 hippocampe ne survivent pas à une ischémie / reperfusion et que les neurones dispersés restent. Cependant, une augmentation spectaculaire de l'infiltration des macrophages et / ou de la microglie (cellules Iba-1-positifs), et les astrocytes réactifs (cellules GFAP-positifs) sont évidents dans le CA1 hippocampal domaine. Étiquetage immunofluorescence spécifique de neurones avec NeuN, macrophages / microglie étiquetage avec Iba-1, et à l'étiquetage des astrocytes GFAP avec corroborer ces conclusions.

La figure 2C présente échantillon comptant fenêtres pour des images au microscope du CA1 à un grossissement de 40x neurone. Le panneau supérieur montre CA1 d'un contrôle opérés de manière fictive et le panneau du bas montre le CA1 suite à une ischémie / reperfusion. Les blessés CA1 affiche une coloration qui comprend la microglie et les astrocytes, qui semblent petites et tubulaires ou en forme de larme. Ceux-ci peuvent être distingués des neurones par leur forme. Neurones de l'hippocampe intact, que ce soit dans le gyrus denté, CA2 ou le CA1, sont grandes avec une forme circulaire ou pyramidal.

Figure 2D est une analyse graphique de la blessure provoquée par 2VOH quantifiée par CA1 compte neuronales. Il peut être conclu que 8 min d'ischémie produite par le modèle 2VOH peut causer une approche cohérente et reproducible blessure qui est principalement isolé au CA1 hippocampe.

Figure 1. Chronologie expérimentale. L'échéancier expérimentale est une représentation des étapes chirurgicales et le traitement des tissus.

Figure 2. Les résultats représentatifs. lésions hippocampiques chez un rat non traité soumis à l'I / R (B) par rapport à un rat de contrôle opérés de manière fictive (A). Crésyl violet, teinté hippocampe (10X) [Surround] grossissement 40X du CA1, CA2, CA3, hile, et la DG (en haut Lefta aiguilles d'une montre). (B) Dommages est localisée à la CA1 hippocAmpus. (c) représentant des fenêtres de comptage utilisées pour neurone comptage et de quantification des dommages à un animal témoin opération fictive (en haut, contrôle) et un animal exposé à une ischémie globale du cerveau (en bas, I / R). (D) représentant la quantification de CA1 nombre de neurones hippocampiques d'une étude inédite (moyenne ± écart-type, n = 8, p <0,05).

Discussion

Le modèle décrit ici produit un accident ischémique dans le cerveau qui peuvent survenir à la suite de l'arrestation et de réanimation cardiaque, fournissant une blessure similaire à celle trouvée chez l'homme. Ce procédé de fabrication ischémie globale du cerveau est l'un des protocoles multiples. Nous utilisons ce protocole avant tout pour son taux relativement bas de mortalité, une récupération rapide et des résultats reproductibles. Le modèle d'arrêt / réanimation cardiaque est sans doute le modèle le plus cliniquement pertinente, mais techniquement le plus difficile à reproduire en permanence. Le modèle 4VO d'ischémie globale du cerveau est un autre protocole couramment utilisé, précieux dans le fait que les quatre bateaux sont occlus contribuant cours de l'ischémie. Ce modèle présente aussi des inconvénients, qui incluent de multiples interventions chirurgicales et possibilité de préconditionnement neuroprotecteur. Le modèle 4VO a été adapté, permettant l'occlusion transitoire de quatre navires au cours d'une procédure pour produire une ischémie, mais la chirurgie reste techniquement exigeant ^30.

Variations sur 2VOH ont été montré pour produire une gamme de résultats ^31,32. Durée de l'ischémie et le degré d'hypotension sont les principales variables qui peuvent affecter les résultats. Des rapports ont montré que si la pression artérielle n'est pas suffisamment réduit la blessure produite peut être incompatible ou unilatérale chez des rats ^30. Nous avons trouvé 30 mmHg être un degré optimal d'hypotension, car elle produit une ischémie fiable sans causer de préjudice notable périphérique. Ce paradigme produit ischémie caractérisé comme sévère, mais à la suite de notre protocole permettra de réduire le risque par ailleurs accru de complications. La nature grave de l'insulte peut être la raison légère variation de paramètres physiologiques entre animaux n'affecte généralement pas la cohérence des blessures.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
Software
ImageJ	NIH