Summary
Bilateralt halspulsådern ocklusion kombination med systemisk hypotension producerar globala hjärnischemi i råtta, vilket resulterar i skador på hippocampus med reproducerbar svårighetsgrad. Djurförsök är nedsatt med förutsägbara mönster av hjärnskada, återkräva de ändamålsenligt, och dödligheten är jämförelsevis låga.
Abstract
Hjärtstillestånd följt av återupplivning resulterar ofta i dramatisk hjärnskador orsakade av ischemi och efterföljande reperfusion av hjärnan. Global hjärnischemi producerar skador på specifika delar av hjärnan visat sig vara mycket känsliga för ischemi 1. Hippocampus nervceller har högre känslighet för ischemiska skador jämfört med andra cellpopulationer, och specifikt är CA1 regionen av hippocampus särskilt utsatta för ischemi / reperfusion 2.
Utformningen av terapeutiska ingripanden, eller för att studera mekanismer som är involverade i cerebral skada, kräver en modell som ger skador som liknar den kliniska tillstånd och på ett reproducerbart sätt. Bilateral carotid kärlocklusion med hypotension (2VOH) är en modell som ger reversibel framhjärna ischemi, efterlikna de cerebrala händelser som kan inträffa under hjärtstillestånd och återupplivning. Vi beskriver en modell modifierad från Smith et al. (1984) 2, Som presenterades för första gången i sin nuvarande form i Sanderson et al. (2008) 3, vilket ger reproducerbar skada att selektivt sårbara hjärnregioner 3-6. Tillförlitligheten i denna modell styrs av exakt styrning av det systemiska blodtrycket under tillämpad hypotension, varaktighet ischemi, nära temperaturkontroll, en specifik anestesi regim, och flitig postoperativ vård. En 8-minuters ischemisk insult producerar celldöd av CA1 hippocampus nervceller som fortskrider under loppet av 6 till 24 timmar av reperfusion, medan mindre känsliga områden i hjärnan skonas. Denna progressiva celldöd är lätt kvantifieras efter 7-14 dagar av reperfusion, som en nära total förlust av CA1 neuroner är uppenbart vid denna tid.
Utöver detta hjärnskada modell presenterar vi en metod för CA1 skada kvantifiering med hjälp av en enkel men noggrann, metodik. Viktigt kan kvantifiering åstadkommas med hjälp av en enkel kamera monterad på mikroskop, enda gratis ImageJ (NIH) software plugin, vilket undanröjer behovet av kostsamt program stereology programvara och ett motoriserat mikroskopisk scen för skadebedömning.
Introduction
Hjärnskador till följd av hjärtstillestånd och stroke är en ledande dödsorsak och långvarig funktionsnedsättning. Även hjärt-lungräddning till offer för hjärtstillestånd lyckas återställa spontan cirkulation i ca 70.000 patienter per år i USA 7,8 minst 60% av dessa patienter senare dör på sjukhuset till följd av omfattande hjärnskador och endast 3-10% av resuscitated patienter kan återuppta sin tidigare livsstil 9,10. Tydligt, att förstå de mekanismer som leder till hjärnskador efter global hjärnischemi och utforma terapeutiska interventioner för att minimera neurologiska trauma är av avgörande betydelse.
Hjämischemi kan modelleras använda flera metoder. Vanligast är hjämischemi produceras i gnagare genom att blockera ett större blodkärl i hjärnan, den mellersta cerebral artär, vilket ger en fokal ischemisk stroke 11,12. Medan kliniskt betydelsefull,fokal hjärnischemi är inte en exakt metod för att studera hjärnskador produceras av hjärtstillestånd / lungräddning. För att modellera detta kliniska paradigm hela hjärnan måste göras ischemisk följt av återinförande av blodflödet. För att efterlikna detta kliniska presentation, utredare framkallar experimentellt hjärtstillestånd följt av återupplivning med HLR och defibrillering 13,14. Denna modell är kliniskt relevant, kan dock oförutsägbara återupplivning tider ökar variabilitet och kan göra dataanalys svårtolkad. Dessutom är denna modell förknippad med en hög dödlighet, vilket ytterligare ökar djur antal som krävs för att testa en hypotes. Undersökning den cerebrala svar på den globala ischemi och / eller reperfusion i en mer reproducerbar, konsekvent och överleva förolämpning kan föredras.
Global ischemi kan induceras i hjärnan samtidigt bevara några blodflödet systemiskt. Detta minskar dödligheten, samtidigt som investigation av mekanismerna för vävnadsskador i hjärnan 2. För att producera globala hjärnischemi, är det nödvändigt att avbryta eller kraftigt begränsa flödet i alla fyra fartyg som försörjer hjärnan, de interna halspulsåder och vertebrala artärerna. Dessa blodkärl förser hjärnan med blod flöde genom en vaskulär struktur som kallas Circle of Willis, som bildar en anastomotisk loop. Denna vaskulära arkitektur tillåter hjärnan att behålla perfusion i händelse av proximala vaskulär ocklusion. Därför måste för att inducera fullständig ischemi i hjärnan, blodflödet genom alla bidragande fartyg inträffa. Carotid artärocklusion kan åstadkommas med användning av en minimalt invasiv ventral hals nerskuret och tillämpning av aneurism klipp för en önskad period. Avbrott av blodflödet genom de vertebrala artärerna kan vara svårt, eftersom de är incased i tvärgående foramina av ryggraden. Utredarna har tagit upp detta genom att electrocauterizing de vertebrala artärerna 24-48 h före carotidocklusion och hjämischemi (4VO modell) 15. I motsats till denna metod som utvecklades Smith et al. Ett förfarande för inducering av global hjärnischemi genom att minska det genomsnittliga arteriella blodtrycket (MAP) systemiskt till 40 mmHg för att reducera perfusion genom de vertebrala artärerna till en punkt där blodflödet går förlorad eller kraftigt minskas 2 . När den kombineras med halspulsådern ocklusion, producerar denna metod ischemi hela framhjärnan, vilket resulterar i ett mönster av hjärnskada som nära efterliknar det av hjärtstopp överlevande. I en ytterligare förfining av denna metod, kräver den modell vi presenterar här tight MAP reglering vid 30 mmHg ± 1mHg under hela 8 minuter av ischemi. Vi hittade denna förändring förbättrar reproducerbarhet av hjärnskada inducerad av denna modell samtidigt som den låga dödligheten för den ursprungliga tekniken designad av Smith et al.
Den exakta fenotypen av celldöd och allmänt omfattningen av vävnadsskada orsakad avden modell som presenteras här är direkt beroende av ischemisk varaktighet 16. Efter 8 minuter av ischemi, uppvisar CA1 nervceller fördröjd celldöd, vilket tyder på att det finns en tidsmässig fönster för terapeutisk intervention under reperfusionsfasen 15,17. Vid början av reperfusion, neuroner återfå snabbt funktion och ingen omedelbar celldöd är detekterbar 18. Men denna förolämpning orsakar induktion av kaskader celldöd (apoptos) som kulminerar i frisättning av apoptogenic proteiner från mitokondrier, däribland cytokrom c, mellan 4-6 tim reperfusion 3,19. Mellan 6 och 24 timmar av reperfusion, har nervceller i CA1 hippocampus åtagit sig att cellens död, och den apoptotiska celldöd exekveras 19. Det bör noteras att celldöd fenotyp ansvarar för ischemisk skada är mycket kontroversiell. Tidiga studier har antytt nekros är den primära celldöd fenotyp 20,21, medan andra andra rapporterar apoptOsis som den huvudsakliga mekanismen 22,23. Totalt aktuellt bevis tyder på att cellerna dör av ett spektrum av fenotyper celldöd sträcker sig från klassiskt apoptos till nekros. Det specifika läget av celldöd är beroende av många faktorer, med graden av bidraget från varje fenotyp beroende på svårighetsgraden av förolämpning, bland andra faktorer 24,25. Av 24 h av reperfusion, döende celler besitter pyknotiska kärnor, kondenserad cytosolen med tydliga tecken på aggregerade cellulära innehåll, och förlust av funktionell mitokondriell morfologi. Döda celler delas upp ytterligare, uppslukas av immunceller såsom makrofager och / eller mikroglia, och rensat från CA1 hippocampus regionen. Genom 4-7 dagar reperfusion, är döda celler avlägsnas, och allt som återstår är inflammatoriska celler och aktiverade gliaceller 17,26. Därför representerar 7 dagar av reperfusion en optimal tid där CA1 hippocampus nervcellsdöd kan kvantifieras med hjälp av enkla, icke-specifika celler fläckar isive kresylviolett eller hemotoxylin-eosin och räknade utifrån morfologiska inklusionskriterier. Celler kvar vid denna sena reperfusion intervall kan räknas som överlevande celler, vilket ger ett index av hjärnskador.
Om denna modell är att användas för att testa terapeutiska åtgärder, föreslås det att den experimentella designen följer TRAPPOR kriterier (Stroke Terapi Academic Industri Roundtable) 27. Dessa riktlinjer bör följas vid utformning och genomförande av en studie, som dock inte diskuteras här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Framställning
Alla djurförsök måste följa institutionens riktlinjer och få ett godkännande av en respektive djurvård utskott före initiering. Alla förfaranden som presenteras här har godkänts av Wayne State University Institutional Animal Care och användning kommittén och följa riktlinjerna för etisk behandling av djur som tas fram i Guide för skötsel och användning av försöksdjur samt till den amerikanska regeringen Principer för Utnyttjande och skötsel av ryggradsdjur som används i testning, forskning och utbildning. Innan operation, förbereda nödvändiga kirurgiska material och en operation återhämtning bur. Detta förfarande är en överlevnad operation och det är därför nödvändigt att öva steril teknik.
- För att göra en vaskulär kateter, klippa en 8 tums längd av polyeten 50 (PE50) slangen och sätt en trubbig 23 gauge nål i ena änden. Katetrar kan köpas individuellt försteriliserade eller köpas i bulk och steriliserades därefter med etylenglykol som behövs.
- Säkra denna nålen på en öppning i en tre vägs kranen och placera en annan tre vägs kranen på den motsatta porten. Heparinisera kranarna och kateter genom att köra heparin saltlösning igenom. Anslut en 10 ml koksaltlösning sprutan kranen vinkelrätt och distalt till katetern. Anslut kranen distalt till katetern till tryckomvandlaren rör, fyll systemet med saltlösning och avlägsna eventuella luftbubblor.
- Setup återhämtningen buren i enlighet med föreskrifter djur. Uppvakningsavdelningen ska vara tyst och har låg trafik. VIKTIGT Slå på utsugsbordet eller liknande gas spolningssystem innan börjar operation för att filtrera förångas isofluran.
2. Kirurgisk Framställning
Sprague-Dawley-råttor (300-350 g) används i den 2VOH modell av global framhjärnan ischemi. Anestesi induceras och underhålls med isofluran och supkompletteras med en sub-dissociativa dos av ketamin. Vi har observerat att anestesin underhålls av isofluran ensamt orsakar en ökad förekomst av kramper under post-op återhämtning. Kramper kan bidra till nervskador och dödlighet, vilket kommer att påverka reproducerbarhet av denna modell. Komplettering anestesi med ketamin tillåter en mycket lägre dos av isofluran att nå en kirurgisk kvalitet av anestesi. Använda en homeostatisk värmefilt tillåter strikt reglering av kärntemperatur. Det kirurgiska ingreppet innebär halspulsådern nedbantad och isolering, och femoralisartären nedbantad och kanylering.
OBS Det är viktigt att föra detaljerade register under varje enskilt kirurgiskt ingrepp. Förändringar i kärntemperatur, blodtryck eller andra fysiologiska variabler som inträffar före eller under kirurgi kan drastiskt förändra resultatet, och register kan analyseras för att se till att det finns formella överensstämmelsen mellan individer och grupper. Konsekvensi de fysiologiska parametrar hos djuret kan förbättras genom att fasta djuren före operation. Experimentatorerna uppmuntras att fastställa den metod som resulterar i de mest konsekventa pre-manövrerade hemodynamik och serum glukos koncentration för sina studier.
- Inducera anestesi genom att placera råttan i en induktionskammare och fyll med en 30% oxygen/70% dikväveoxid blandningen vid 5% isofluran. Intubation med en 12 gauge kateter, med en gnagare laryngoskop och ventilera med 30% oxygen/70% dikväveoxid blandning med 2,5% isofluran. Ventilation kursen borde vara 80 andetag per minut vid 2,5 ml per andetag.
- Ge ett intraperitonealt injektion av ketamin (20 mg / kg) i saltlösning och minska isofluran till 1,5%. VIKTIGT Det är absolut nödvändigt att övervaka nivån av anestesi under hela förfarandet för att säkerställa adekvat kirurgisk plan av anestesi. För att kontrollera djupet av anestesi, nypa mellan hind-lem siffror, medan övervakningen pedal reflex. Om reflexen ärfrånvarande, är anestesi tillräcklig. Efter kanylering av den femorala artären, kan blodtrycket användas som en indikator på anestesi-nivå. Håll dosen av isofluran så låg som möjligt samtidigt som en kirurgisk plan av anestesi för att minska risken av post-ischemiska anfall.
- Snitt görs på halsen och i bäckenområdet. Raka hals och den högra bäckenet, där låret möter buken. Orient råttan i ryggläge på homeostatic termo-filt och sätt den rektala termometern med kirurgiska glidmedel. Applicera skyddsglasögon smörjmedel. En 60 watts glödlampa kan hjälpa till att reglera temperaturen. Glödlampan ska aldrig vara närmare än 8 inches från djuret. VIKTIGA Temperaturer över eller under normal fysiologisk temperatur (37 ° C) i hög grad kan påverka slutliga neurologiska skador. Upprätthåll kärntemperatur vid 37 ° C ± 0,5 ° C.
- Scrub snittet områden med Betadine och skölj med 70% etanol. Upprepa detta two fler gånger. Placera ett kirurgiskt fält över råttan, och skär hål för att exponera snitt områden. VIKTIGT Carotid och femorala artärer kan isoleras utan att orsaka några skador på omgivande muskulatur, vilket kommer att förbättra återhämtning och minimerad efterföljande behov av postoperativ smärtlindring.
- I avvaktan adekvat anestesi, använd en nr 10 skalpell för att göra en mittlinje snitt längs halsen, sedan använda peanger rakt på sak dissekera mellan spottkörtlarna tills de når sternohyoid muskeln, den framstående mittlinjen muskelgrupp täcker luftstrupen. Igen med försiktig dissektion teknik, separera de stora muskelgrupperna i sternohyoid från sternocleidomastoideus, bilateralt. Dessa två muskelgrupper bilda en triangulär fördjupning, som kan användas som ett landmärke för att lokalisera den neurovaskulära bunt som innehåller halspulsådern. De gemensamma carotis grenar sig i de inre och yttre karotidartärema. Isolera den gemensamma halspulsådern proximalt till biFurkation.
- Försiktigt skilja dessa två muskler och lokalisera halspulsådern. För att hjälpa till att identifiera detta fartyg leta efter en puls. Isolera halspulsåder på båda sidor genom att passera en ~ 5 tums längd av 3-0 silkesutur under kärlet. Rensa bort fascia från fartygen. VIKTIGT vagusnerven och sympatiska kedjorna ingår i cervical neurovascular bunt och försiktighet bör iakttas för att undvika skador på den vid avstängning av halspulsådern.
- Använd en sax för att göra ett andra snitt vid ljumsken, längs fördjupningen där hind-lem lårmusklerna möter buken. Dissekera under buken muskler, längs lårmusklerna tills du når inguinal ligament. Detta kommer att utsätta den femorala neurovascular bunten. Försiktigt isolera femoralartären genom att en ~ 5 tums längd 3-0 silke sutur under fartyget. Rensa bort fascia lämnar 5-7 mm av utsatta fartyg.
- Binder en permanent knut vid den distala änden av den exponerade artären.
- Applicera dragkraft på suturen vid den proximala änden av artären för att täppa blodflöde, genom att dra suturerna lärs ut. Gör ett litet snitt tvärs över toppen av kärlet med oftalmiska sax. Otillräcklig dragkraft på fartyget kommer att resultera i blödning, som kan stoppas genom att applicera tyngre dragkraft. Stäng katetern vid kranen.
- Använda en vaskulär introduktör, föra in katetern slangen i kärlet, 7-9 mm förbi fartyget snitt och mot mittlinjen. När katetern är placerad på önskad avstånd, knyt den löst knuten runt fartyget och kateter för att säkra det på plats. Ta dragning från kärlet och låt det ligga naturligt.
- Administrera 0,3 ml heparin (100 U i saltlösning), intravenöst. Spola någonblod ut ur katetern med en liten mängd av koksaltlösning för att förhindra koagulering. Slå på tryckvakt och kalibrera utrustningen. Öppna kranarna att låta givaren att detektera blodtrycket. För att få exakta mätningar av blodtryck, bör placeringen av systemet inte ändras efter kalibrering.
- Isofluran dosen justeras för att ge en genomsnittliga arteriella blodtrycket (MAP) av 110 mmHg till 130 mmHg. Den här kartan bör vara vägledande för adekvat kirurgisk plan av anestesi.
Tre. Ischemi Protokoll
Som nämnts tidigare, fyra fartyg levererar perfusion till hjärnan. Proximal ocklusion av de två halspulsåder kommer inte att resultera i hjärnischemi eftersom de vertebrala artärerna kommer att kompensera genom Circle of Willis. Det har visats att carotid ocklusion, i kombination med inducerad systemisk hypotoni, kommer att begränsa perfusion genom de vertebrala artärerna som leder till hjärnan ischemi. Här vi descrIBE protokollet för att återkalla blod att producera hypotension och fastspänning halspulsåder att producera kontrollerade, reversibel ischemi. Se figur 1.
Blod syre och koldioxid, glukos koncentration och pH kan variera mellan individer i provgruppen och orsaka variation i skadan. Övervakning av dessa fysiologiska variabler kan minska variabiliteten av infarkt. Som nämnts, är temperaturen en annan parameter som är viktig att reglera, men hjärnan temperaturen inte kan motsvara kärntemperatur, som perfusion starkt begränsad under experimentell ischemi 28. Våra specifika kirurgiska inställning resulterar i temperaturförändringar i hjärnan som speglar förändringar i kärntemperatur under ischemi. Det är dock viktigt för försöksledaren att bestämma detta empiriskt genom att övervaka hjärntemperaturen med termoelement eller på annat sätt till standardisera förfarandet. Om kärntemperatur inte speglar hjärnans TEMperatur, är det viktigt att bibehålla hjärnan temperatur normotermisk under hela förfarandet, oavsett kärntemperatur.
Randomisering dikterar att kirurgen randomiserar djuret till ischemi eller skenopererade kontrollgruppen vid denna punkt. Sham kirurgi kommer att följa alla rutiner exakt samma som ischemiska djur utom någon minskning av blodtryck och halspulsådern ocklusion. Det är viktigt att de skenopererade kontroller vara under samma dos av anestesi under en tid som motsvarar den hos ischemiska djur. Om det finns en behandlingsgrupp ingår, vilket kräver narkos före eller efter ischemi, bör bluff och obehandlade grupper ischemi matcha anestesi dosen och behandlingstiden gruppen.
- Ready hemostatiska klämmor och klipp applikator. Clips bör helt täpper till kärlet utan att orsaka några skador. Ischemi kan induceras när hemodynamik har blivit konsekvent. Anslut en 10 ml hepariniserat SyriNBE på avstängningskranen, vinkelrätt och proximalt till katetern. Det bör finnas 0,3 ml (30 enheter) av hepariniserad saltlösning inuti sprutan för att förhindra koagulering av uttaget blod.
- Ställ in en timer för 1 min och öppna kranen till hepariniserade sprutan, så att blodet kan dras tillbaka.
- Återkalla blod genom att dra på sprutans kolv. Om för mycket sug appliceras, kommer fartyget kollapsa eller täta mot katetern öppning och inget blod kommer att dras. Det bör vara möjligt att ta bort 7-9 ml blod i en min. Om detta inte är fallet, avancerade katetem längre in i artären och försök igen. Vi finner att 7-9 ml blod måste avlägsnas för att reducera MAP nära 30 mmHg, målet blodtrycket att uppnå ischemi. VIKTIGT Se tillbaka blodet hålls vid 37 ° C för att undvika nedkylning under blod återinfusion.
- Efter en minut bloddragningen (7-9 ml blod bör återkallas), tillämpas hemostatiska klämmor till halspulsåder och påbörja entimer för 8 min. Omedelbart kontrollera blodtrycket. Om kartan inte vid 30 mmHg, ingjuta eller återkalla blod långsamt att nå 30 mmHg ± 1 mmHg. Fortsätt denna praxis i hela ischemi för att upprätthålla MAP av 30 mm Hg. VIKTIGT Record blodtryck hela ischemi protokollet. Underlåtenhet att sänka blodtrycket till 30 mmHg kan begränsa ischemi. Övervaka core och / eller hjärnan temperaturen noggrant under återinfusion som ökar eller minskar i temperatur kan påverka hjärnskador.
- Vid slutet av 8 min, börja reperfusion genom att avlägsna de hemostatiska klämmor och reinfusion blodet långsamt, 2 ml per minut.
- När blodet har återinfuseras kanylen kan avlägsnas från den femorala artären. För att undvika blödning under post-op, säkra två separata knutar proximalt snittet på artären.
- Sutur snitt med diskontinuerligt mönster med ett omvänt skärande nål, med 5-0 VICRYL sutur. Denna sutur löses, så det kommer inte require borttagning. OBS Under förfarandet, om tillräcklig anestesi inte kan nås med lägre nivåer av isofluran, administrera en extra dos av ketamin.
4. Smärtlindring och återhämtning
Djurens välbefinnande är prioritet under återhämtning samt det kirurgiska ingreppet. Postoperativ vård bör följa särskilda riktlinjer för institutionen. Djur som genomgår globala hjärnischemi är mottagliga för anfall. För att minimera beslag händelse är det viktigt att uppvakningsavdelningen har minimal stimulans, dvs ljud och visuella störningar. Under vår djuranvändning protokoll, huset vi postoperativa djur i 72 timmar i ett avskilt rum för detta ändamål.
- Efter snitten har sys råttan kan avvänjas från ventilatorn. Stäng av isofluran och fortsätta ventilation på 30% oxygen/70% lustgas tills råttan börjar andas mot fläkten.
- Administrera 0,5 mg / kg butorfanol i 5 ml saltlösning, subkutant mellan skulderbladen.
- Snabbt reinfusion blod kan öka höger kammare förspänning. Detta ökar lungcirkulationen tryck och kan orsaka lungödem. Tecken på detta är ansträngd andning och sprakande ljud under andning. Tillämpa positiv slututandningstryck kommer att förbättra lungödem.
- När frivillig kontroll av andning återfås, extubera, ta bort termometern och stänga av värme filt. Vid denna punkt djuret kan placeras i en återhämtning bur. Återhämtningen bur bör placeras så hälften av buren är på toppen av en vatten cirkulerande filt (34 ° C) under de första 24 h av reperfusion. Placera djuret på den del av buren våningen över värme filt till stöd i temperatur underhåll. När djuret börjar återhämta sig från anestesi och analgesi, kommer den att flytta runt buren att thermoregulate själv. Djur ska hållas separat under post-op.
- Djuret ska ha obegränsad tillgång till vatten. För två dagar efter op, bör detta vatten innehåller 4 mg / kg flytande Tylenol lösning. Förutom gnagarfoder är sötad frukostflingor anordnad i buren för att stimulera äta och förhindra viktminskning.
- Täck hälften av buren med en drapering och noga övervaka postoperativ återhämtning.
- Eftersom djuret återhämtar sig från anestesi är det viktigt att övervaka tecken på ångest. Ansträngd eller inkonsekvent andning kan vara ett tecken på ångest, möjligen orsakad av lungödem eller irritation i luftvägarna under intubation. Butorphenol kommer stillsam djuret, reducerande aktivitet, men mild aktivitet bör återställas inom 1 timme. Vi hittar djuren börjar äta godis och dricka inom 4 tim av extubation. Av 12 tim, bör normalt beteende och näring återupptas. Ett annat tecken på ångest är viktminskning, ett djur bör inte förlora mer än 20% av ursprunglig kroppsvikt i varje 48 hr span, om överdriven viktminskning is observerade djuret bör avlivas.
- Humane ingripande är nödvändigt om du får kramper. Denna typ av krampanfall är generellt sett mellan 24 och 48 timmar efter reperfusion. Kramper kan orsaka ökad hjärnskador som är oberoende av ischemisk skada i sig, bör därför krampanfall betraktas som en uteslutning kriterierna på plats före initieringen av studien 29. Kramper kan uppstå när ingen är närvarande, så det är viktigt att känna igen tecken. Sängkläder kommer att störas och eventuellt utvisas ur buren. En postictal råtta kommer att ha en slapp läggning med snabb, ansträngd andning och / eller har en blåmärken eller blödning näsa.
OBS Eventuella tecken på smärta eller lidande omedelbart lindras med smärtstillande medel. Om sympotoms inte lindras med en dos av analgetika eller kvarstår efter fjärde raka dos smärtlindring, kommer djuret avlivas och uteslutna från studien. Kirurgisk wounds ska kontrolleras för korrekt läkning för åtta dagar efter op.
Fem. Tissue Insamling och behandling
Hjärnan fixeras genom transcardial infusion av paraformaldehyd. Efter grov snittning och kryoskydd, knäppa vi frysa hjärnan och avsnittet om en kryostat. Dessa hjärnan sektioner färgas med kresylviolett och avbildas på ett ljusmikroskop.
- Inducera anestesi genom att placera djuret i induktionskammare och fyllning med 30% syre / 70% dikväveoxid med 5% isofluran. Intubera djuret och ventilera vid 30% syre / 70% dikväveoxid med 5% isofluran.
- Förbered material för perfusion. Fyll en bägare med 100 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C och en bägare med 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) vid 4 ° C. Hjärnan spolas med PBS följt av PFA, genom en perfusion pump. Slangar ska placeras i varje bägare och ansluts med en trevägskran till enllow en smidig övergång från PBS till PFA perfusion. Placera en trubbig 18 gauge nålen på slangen och fyll linje med PBS. Se till att det inte finns några bubblor i nålen och slangen som luft kan bilda en blodpropp, vilket skulle kunna förhindra perfusion. Också, redo en liten behållare med PFA för nedsänkning fixering av hjärnan.
- Använd en flytande samling bricka, med tillräcklig kapacitet för att hålla minst 200 ml vätska. Vid denna punkt djuret borde ha ventilerat med isofluran under tillräckligt lång tid (minst 3 minuter) för att nå djup anestesi.
- VIKTIGT Säkerställ kirurgisk plan av anestesi uppnås.
- Fortsätt genom att göra ett snitt för att komma brösthålan genom buken. Kläm nedåtgående aorta. När hjärtat är utsatt, sätter trubbiga 18 gauge nål genom spetsen av hjärtat in i aorta. Gör ett litet snitt i högra förmaket att tillåta perfusat att lämna djuret.
- Sätt på pumpen vid 50 ml / min, med början med PBS. Efter pumping 100 ml PBS, byter kranen för att BEGJUTA 100 ml av PFA.
- Ta hjärnan, noga med att inte skada vävnaden.
- Placera hjärnan i en vävnad matris och skär mellan lillhjärnan och storhjärnan. Avsnitt framhjärnan, ~ 3 millimeter från framsidan och baksidan av hjärnbarken. Detta kommer att producera tre sektioner, kommer den mellersta sektionen innehåller hippocampus.
- Placera hjärnan sektioner i en burk med tillräckligt PFA för fullständig nedsänkning. Immersion fixa hjärnan för exakt 2 timmar.
- För att skydda vävnaden från skador orsakade av frysning, är hjärnan cryoproteced genom att ersätta PFA med 30% sackaros i PBS. Kryoskydd är komplett med vävnadsprover sjunka i sackaroslösningen (~ 24-48 timmar).
- Att snäppa frysa hjärnan sektioner, placera en bägare i torr is och fyll med 2-metylbutanol i tio minuter. Placera hjärnan skivor in i metylbutanol under 5 min, sedan överföra in i en förslutbar behållare och förvara vid -80 ° C tills cryostvid sektionering.
- Kryostat avsnitt hjärnan vid 20 um, samla minst 3 sektioner på 3 hjärnan atlas koordinaterna (The Rat Brain i stereotaktisk koordinater. Paxinos och Watson, plattsektioner 29, 31, 33 eller Bregma -2.8 mm, -3.3 mm, och -3,8 mm). Sektionerna är placerade på laddade objektglas och får torka innan förvaring vid -80 ° C.
- Kresylviolett (0,1% vid pH 3,5) stain 9 hjärnan sektioner, 3 på varje hjärna atlas koordinat.
- Bild CA1 regionen i hippocampus vid 40x med ett mikroskop monterat kameran och sätter en 300 pm parallell skala bar med CA1 neuronala planet. Spara bilder som TIFF-filer.
6. Brain Damage Kvantifiering
ImageJ, ett gratis program som erbjuds av National Institute of Health, kan användas för att räkna och kvantifiera de livsdugliga nervceller, som kommer att representera omfattningen av hjärnskador.
- Öppna mikroskop TIFF-bilder med "cellräknaren" plugin i ImageJ. Välj ettmärkning färg och nervceller räkna inom gränserna för skalan baren. Nervceller räknas utifrån enkla inklusionskriterier baserade på neuronal morfologi (stor, pyramidform) eller uteslutningsgrunder för microglial / astrocyte morfologi (små runda eller långa rörformade form).
VIKTIGT Var konsekvent med inkludering / exkludering kriterier mellan bilderna, och individer när man räknar nervceller. - Rekord neuron räknas och spara fönstret cellräknaren.
- Neuron räknas bör kompletteras med två separata människor att uppnå konsekventa, korrekta neuron räknas.
- Medelvärdet av alla nio bilder från varje djur kommer att ge en enda medelvärde "neuron count", som är den kvantitativt mått på CA1 hippocampus skada som skall användas i en statistisk analys. Grupper kan jämföras statiskt med en envägs ANOVA följt av en Tukeys HSD test för post hoc-analys, eller, där normalitet misslyckas, en Kruskal-Wallis envägs ANOVA på leden följt av Dunns post hoc analys för att statistiskt utvärdera skillnader mellan grupperna. Specifik statistiska analysen bör styras av den individuella studieplanen utformning, kan den som presenteras här är inte lämplig för de specifika hypoteser som testas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den 2VOH modell av global hjärnischemi / reperfusion orsakar nervcellsdöd i CA1 regionen av hippocampus. Figur 2 representerar den skada som produceras av 8 min av global hjärnischemi, bearbetas 14 dagar efter reperfusion. Figurerna 2A och 2B jämför hippocampi från bluff och post-ischemiska hjärnor, färgade med kresylviolett. Figur 2A visar en hippocampus från en skenopererade råtta som uppvisar normal morfologi, inklusive ett intakt CA1. Figur 2B visar hippocampus föremål för ischemi / reperfusion, där gyrus gyrus, CA2 och CA3 har minimalt påverkat morfologi. De selektivt sårbara nervceller i CA1 hippocampus överlever inte ischemi / reperfusion och endast spridda neuroner kvar. Men dramatiska ökningar i infiltrerande makrofager och / eller mikroglia (IBA-1-positiva celler), och reaktiva astrocyter (GFAP-positiva celler) är tydliga i CA1 hippocampal fält. Specifik immunofluorescens märkning av nervceller med NeuN, makrofag / mikroglia märkning med IBA-1, och astrocyter märkning med GFAP bekräfta dessa rön.
Figur 2C visar prov neuron räkna fönster för mikroskop bilder av CA1 vid 40x förstoring. Den övre panelen visar CA1 från en skenopererade kontroll och den nedre panelen visar CA1 efter ischemi / reperfusion. Den skadade CA1 visar en färgning som inkluderar mikroglia och astrocyter, som förefaller små och tubformade eller droppformad. Dessa kan skiljas från nervceller genom sin form. Intakt hippocampus nervceller, vare sig i gyrus gyrus, CA2 eller CA1, är stora med en cirkulär eller pyramidform.
Figur 2D är en grafisk analys av 2VOH inducerad skada kvantifieras genom CA1 neuronala räknas. Man kan dra slutsatsen att 8 min av ischemi produceras av 2VOH modell kan orsaka en konsekvent och reproducible skada som i första hand är isolerat till CA1 hippocampus.
Figur 1. Experimentell tidslinjen. Den experimentella tidslinje är en representation av de kirurgiska åtgärder och vävnad bearbetning.
Figur 2. Representativa resultat. Hippocampus skador i en obehandlad råtta utsattes för I / R (B) jämfört med en skenopererade kontroll råtta (A). Kresylviolett färgas hippocampus (10X) [Surround] 40X förstoringar av CA1, CA2, CA3, hilus och GD (överst leftà medurs). (B) Skada är lokaliserad till CA1 hippocAmpus. (C) Representativa räkna fönster som används för neuron räkning och skada kvantifiering i en skenopererade kontroll djur (topp, kontroll) och ett djur utsätts för global hjärnischemi (botten, I / R). (D) Representant kvantifiering av CA1 hippocampus neuron räknas från en opublicerad studie (medelvärde + standardavvikelse, n = 8, p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den modell som beskrivs här ger en ischemisk skada på hjärnan som kan uppstå som en följd av hjärtstillestånd och återupplivning, vilket ger en skada liknande den som finns hos människor. Denna metod för att producera globala hjärnischemi är en av flera protokoll. Vi använder det här protokollet främst för dess jämförelsevis låg dödlighet, snabb återhämtning, och reproducerbara resultat. Den hjärtstillestånd / återupplivning modell är utan tvekan den mest kliniskt relevant modell, men tekniskt är svårast att ständigt reproducera. Den 4VO modell av globala hjärnischemi är en annan vanligt förekommande protokoll, värdefull i det faktum att alla fyra bidragande fartyg blockerad under ischemi. Denna modell har också nackdelar, som omfattar flera operationer och möjlighet neuroprotektivt preconditioning. Den 4VO modellen har anpassats så att övergående ocklusion av alla fyra fartyg under en procedur för att producera ischemi, men operationen är teknisktly krävande 30.
Variationer på 2VOH har visat sig ge en rad resultat 31,32. Varaktighet för ischemi och graden av hypotoni är de stora variabler som kan påverka resultatet. Rapporter har visat att om blodtrycket inte sänks tillräckligt skadan produceras kan vara inkonsekvent eller ensidig i råttor 30. Vi har funnit 30 mmHg till vara en optimal grad av hypotoni eftersom den producerar pålitlig ischemi utan att orsaka noterbar perifer skada. Detta paradigm producerar ischemi karakteriseras som allvarlig, men efter våra protokoll kommer att minska det annars ökad risk för komplikationer. Den allvarliga karaktär förolämpning kan vara orsaken liten variation i fysiologiska parametrar mellan djur brukar oftast inte påverkar skadan konsistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga finansiella intressekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
References
- Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
- Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
- Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
- Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
- Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
- Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
- Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
- Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
- Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
- Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
- Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
- Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
- Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
- Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
- Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
- Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
- Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
- Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
- Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
- Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
- Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
- Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
- Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
- Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
- Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
- Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
- Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).
