Summary
Bilateral carotis okklusjon kombinert med systemisk hypotensjon produserer global hjerne iskemi hos rotte, noe som resulterer i skader på hippocampus med reproduserbare alvorlighetsgrad. Er dyr fag svekket med forutsigbare mønstre av hjerneskade, gjenopprette de hensiktsmessig, og dødelighet er relativt lave.
Abstract
Hjertestans etterfulgt av gjenoppliving ofte resulterer i dramatisk hjerneskade forårsaket av ischemi og påfølgende reperfusjon av hjernen. Global hjerne iskemi produserer skade på bestemte områder av hjernen vist seg å være svært følsomme for iskemi en. Hippokampale neuroner har høyere følsomhet for ischemiske fornærmelser sammenlignet med andre cellepopulasjoner, og spesielt er den CA1 regionen av hippocampus særlig utsatt for ischemi / reperfusjon 2..
Utformingen av terapeutiske intervensjoner, eller studie av mekanismene som er involvert i cerebral skade, krever en modell som produserer skade lik den kliniske tilstand, og på en reproduserbar måte. Bilateral carotis fartøy okklusjon med hypotensjon (2VOH) er en modell som produserer reversibel forhjerne iskemi, etterligning cerebrale hendelser som kan oppstå under hjertestans og gjenopplivning. Vi beskriver en modell modifisert fra Smith et al. (1984) 2, Som først ble presentert i sin nåværende form i Sanderson et al. (2008) 3, som produserer reproduserbar skade selektivt sårbare områder av hjernen 3-6. Påliteligheten av denne modellen er diktert av presis kontroll av systemisk blodtrykk under anvendt hypotensjon, varigheten av iskemi, tett temperaturkontroll, en bestemt anestesi diett, og flittig postoperativ omsorg. 8 minutters iskemisk fornærmelse produserer celledød av CA1 hippocampus nevroner som utvikler seg i løpet av 6-24 timer av reperfusjon, mens mindre sårbare områder av hjernen er spart. Denne progressive celledød enkelt kvantifisert etter 7-14 dager med reperfusjon, som et nesten fullstendig tap av CA1-neuroner er tydelig på dette tidspunktet.
I tillegg til dette hjerneskade modell, presenterer vi en metode for CA1 skade kvantifisering ved hjelp av en enkel, men grundig, metodikk. Viktigere, kan kvantifisering oppnås ved hjelp av et enkelt kamera montert mikroskop, enda gratis ImageJ (NIH) programvare plugin, obviating behov for kostnadseffektive uoverkommelige stereology programmer og en motorisert mikroskopisk scene for skadevurdering.
Introduction
Hjerneskade som følge av hjertestans og hjerneslag er en ledende årsak til død og langsiktig uførhet. Mens hjerte-lungeredning for ofre for hjertestans lykkes i å gjenopprette spontan sirkulasjon i ca 70 000 pasienter per år i USA 7,8 minst 60% av disse pasientene senere dør på sykehuset som følge av omfattende hjerneskade og bare 3-10% av gjenopplivet pasienter kan gjenoppta sin tidligere livsstil 9,10. Åpenbart forstå mekanismene som fører til hjerneskade etter global hjerne iskemi og utforme terapeutiske intervensjoner for å redusere nevrologiske traumer er av avgjørende betydning.
Hjerne-ischemi kan modelleres benytte flere metoder. Det vanligste er at hjerne-ischemi produsert i gnagere ved å blokkere en vesentlig blodkar i hjernen, den midtre cerebralarterie, og dermed produsere en focal ischemisk slag 11,12. Mens klinisk viktig,fokal hjerne-ischemi er ikke en nøyaktig metode for å studere hjerneskade produsert av hjertestans / lunge-redning. For å modellere denne kliniske paradigmet hele hjernen må gjøres iskemisk etterfulgt av gjeninnføring av blodstrøm. Å nøye etterligne denne kliniske presentasjon, etterforskere eksperimentelt indusere hjertestans etterfulgt av gjenoppliving med HLR og defibrillering 13,14. Denne modellen er klinisk relevant, kan imidlertid uforutsigbare gjenoppliving ganger øke variasjon og kan gjøre dataanalyse vanskelig å tolke. I tillegg er denne modellen forbundet med en høy dødelighet, som ytterligere øker antall dyr er nødvendig for å teste en hypotese. Gransker cerebral respons på global iskemi og / eller reperfusion i en mer reproduserbar, konsekvent og survivable fornærmelse kan bli foretrukket.
Global ischemi kan induseres i hjernen og samtidig bevare noen blodstrøm systemisk. Dette reduserer dødeligheten, samtidig som investigation av mekanismene for vevsskade i hjernen to. For å produsere den globale hjerne-ischemi, er det nødvendig å avbryte eller i stor grad begrense strømning i alle fire kar som forsyner hjernen, den indre karotid-arteriene og vertebrale arterier. Disse fartøyene forsyne hjernen med blod flyte gjennom en vaskulær struktur kalt Circle of Willis, som danner en anastomotisk loop. Denne vaskulære arkitekturen gjør hjernen for å beholde perfusjon i tilfelle proksimale vaskulær okklusjon. Derfor må for å indusere fullstendig iskemi i hjernen, blodstrømmen gjennom alle medvirkende fartøyer forekommer. Halspulsåren okklusjon kan oppnås ved hjelp av en minimal invasiv ventral utsnitt ned og anvendelse av aneurisme klipp for en ønsket periode. Avbrudd av blodstrømmen gjennom de vertebrale arterier kan være vanskelig, slik de er incased i tverrgående foramina av virvelsøylen. Etterforskerne har adressert dette ved electrocauterizing ryggvirvel arteries 24-48 hr før carotisokklusjon og hjerne iskemi (4VO modell) 15. I motsetning til denne metode, som er utviklet Smith et al. Metode for å indusere en global hjerne-ischemi ved å redusere det gjennomsnittlige arterielle blodtrykk (MAP) systemisk til 40 mmHg for å redusere perfusjon gjennom de vertebrale arterier til et punkt hvor blodstrømmen er tapt eller sterkt redusert 2 . Når kombinert med carotis okklusjon, produserer denne metoden iskemi hele forhjerne, noe som resulterer i et mønster av hjerneskade som etterligner det av hjertestans overlevende. I en videreutvikling av denne fremgangsmåte, krever modellen presenterer vi her tett MAP regulering ved 30 mmHg ± 1mHg under hele 8 min av iskemi. Vi fant denne endring forbedrer reproduserbarhet av hjerneskade indusert av denne modell og samtidig bevare den lave dødeligheten av den opprinnelige teknikk utviklet av Smith et al.
Den nøyaktige fenotype av celledød og totale omfanget av vevsskader forårsaket avden modellen som er presentert her er direkte avhengige av iskemisk varighet 16.. Etter åtte minutter av iskemi, utstillingsområde CA1 nevroner forsinket celledød, noe som tyder på at det er en temporal vindu for terapeutisk intervensjon under reperfusjon fase 15,17. Ved utbruddet av reperfusjon, nevroner raskt gjenvinne funksjon og ingen umiddelbar celledød er synlig 18. Men denne fornærmelse fører til induksjon av celledød kaskader (apoptose) som kulminerer i utgivelsen av apoptogenic proteiner fra mitokondriene, inkludert cytokrom c, mellom 4-6 timer av reperfusjon 3,19. Mellom 6 og 24 timer av reperfusjon, har nevroner av CA1 hippocampus forpliktet til celle død, og celledød ved apoptose programmet kjøres 19. Det bør bemerkes at celledød fenotype ansvarlig for iskemisk skade er svært kontroversiell. Tidlige studier har antydet nekrose er den primære celledød fenotype 20,21, mens andre andre rapporterer apoptosis som rektor mekanismen 22,23. Totalt gjeldende bevis tyder på at celler dør av et spekter av celledød fenotyper som spenner fra klassisk apoptose til nekrose. Den spesifikke modusen for celledød er avhengig av mange faktorer, med graden av bidraget fra hver fenotype, avhengig av alvorlighetsgraden av fornærmelse, blant andre faktorer 24,25. Ved 24-timers av reperfusjon, døende celler besitter pyknotic kjerner, kondensert cytosol med klare bevis for aggregerte cellulære innholdet, og tap av funksjonelle mitokondrie morfologi. Døde celler er videre brutt ned, omsluttet av immunceller som makrofager og / eller microglia, og fjernes fra CA1 hippocampus regionen. Ved 4-7 dager reperfusion, er døde celler fjernes, og alt som gjenstår er betennelsesceller og aktivert gliaceller 17,26. Derfor representerer syv dager reperfusion en optimal tid hvor CA1 hippocampus neuronal død kan kvantifiseres ved hjelp av enkle, ikke-spesifikke celle flekker icluding Cresyl fiolett eller hemotoxylin-eosin og telles basert på morfologiske inklusjonskriteriene. Celler gjenværende på dette sene reperfusion intervall kan regnes som overlevende celler, og dermed gi en indeks for hjerneskade.
Ved denne modell er å bli utnyttet for å teste terapeutiske intervensjoner, er det foreslått at den eksperimentell design følge trappetrinn kriterier (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) 27. Disse retningslinjer skal følges ved utforming og gjennomføring av en studie, er imidlertid ikke diskutert her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse
Alle dyreforsøk må følge institusjonelle retningslinjer og motta godkjenning av en respektiv dyr omsorg komité før oppstart. Alle prosedyrer som presenteres her har blitt godkjent av Wayne State University Institutional Animal Care og bruk komité og følge retningslinjene på etisk behandling av dyr som fremsatt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og den amerikanske regjeringen Prinsipper for Utnyttelse og vedlikehold av virveldyr som brukes i testing, forskning og opplæring. Før du begynner kirurgi, utarbeide nødvendig kirurgisk materiell og kirurgi utvinning bur. Denne prosedyren er en overlevelse kirurgi, og det er derfor nødvendig å øve steril teknikk.
- For å gjøre en vaskulær kateter, kuttet en 8 tommers lengde av polyetylen 50 (PE50) rør og sette inn en avstumpet 23 gauge nål i en ende. Katetre kan kjøpes enkeltvis pre-sterilisert eller kjøpt i bulk og deretter sterilisert med etylenglykol etter behov.
- Sikre denne nålen på en port av en treveis stoppekran og plassere en annen treveis stoppekran på motsatt port. Heparinize de stoppekraner og kateter ved å kjøre heparin saltvann gjennom. Koble en 10 ml saltvann sprøyte inn på stoppekran vinkelrett og distalt til kateteret. Koble stoppekran distal til kateteret til trykkmåleomformer tube, fyll systemet med saltvann og fjerne eventuelle luftbobler.
- Setup restitusjonsmerd i samsvar med dyr bruk forskrifter. Postoperativ avdeling bør være stille og har lav trafikk. VIKTIG Slå på downdraft bord eller lignende gass avsugsystem før begynnelsen kirurgi for å filtrere fordampet isofluran.
2. Kirurgisk Forberedelse
Sprague-Dawley-rotter (300-350 g) blir brukt i den 2VOH modell av global iskemi forhjerne. Anestesi indusert og vedlikeholdes med isofluran og supplemented med en sub-dissosiativ dose ketamin. Vi har observert at anestesi vedlikeholdes av isofluran alene fører til en økt forekomst av anfall i løpet av post-op utvinning. Beslagene kan bidra av nerveskade og mortalitet, noe som vil påvirke den reproduserbarheten av denne modellen. Supplering anestesi med ketamin tillater en mye lavere dose av isofluran å nå et kirurgisk kvalitet av anestesi. Ved hjelp av en homeostatic varmeteppe tillater streng regulering av kjernetemperatur. Den kirurgiske prosedyren innebærer halspulsåren cut-down og isolasjon, og lårarterien cut-down og kanylering.
NOTE Det er viktig å holde detaljerte poster under hvert enkelt kirurgisk inngrep. Endringer i kjernetemperatur, blodtrykk, eller andre fysiologiske variabler som oppstår før eller under operasjonen kan drastisk forandre resultatene, og poster kan bli analysert for å sikre at det er prosessuelle konsistens mellom individer og grupper. Konsistensi den fysiologiske parametere av dyret kan bli forbedret ved å faste dyrene før operasjonen. Forskere oppfordres til å bestemme hvilken metode som resulterer i de mest konsekvente pre-opererte hemodynamics og serum glukose konsentrasjon for sine studier.
- Indusere anestesi ved å plassere rotten i en induksjonsovn og fylle kammeret med en 30% oxygen/70% lystgass blandingen ved 5% isofluran. Intubere med en 12 gauge kateter, ved hjelp av en gnager laryngoskop og ventilere med 30% oxygen/70% lystgass blanding med 2,5% isofluran. Ventilasjonen bør være 80 pust per minutt ved 2,5 ml per pusten.
- Gi en intra-peritoneal injeksjon av ketamin (20 mg / kg) i fysiologisk saltvann og redusere isofluran og 1,5%. Viktig det er viktig å overvåke nivået av anestesi i løpet av prosedyren for å sikre tilstrekkelig kirurgisk planet av anestesi. For å sjekke anestesidybden, klype mellom hind-lem sifre, mens overvåking pedal refleks. Hvis refleks erfraværende, er anestesi tilstrekkelig. Etter kanylering av den femorale arterie, kan blodtrykket bli brukt som en indikator på anestesi nivå. Hold den dose av isofluran så lav som mulig og samtidig opprettholde en kirurgisk planet av anestesi for å begrense faren for post-ischemiske anfall.
- Snitt vil bli gjort på halsen og i bekken-området. Barbere nakken og høyre bekkenet, der låret møter magen. Orientere rotte i ryggleie på homeostatic termo-teppe og sett rektal termometer med kirurgisk smøremiddel. Påfør beskyttende øye smøremiddel. En 60 watts lyspære kan bidra til å regulere temperaturen. Pæren bør aldri være nærmere enn 8 inches fra dyret. VIKTIGE Temperaturer over eller under normal fysiologisk temperatur (37 ° C) i stor grad kan påvirke endelig nevrologiske skader. Oppretthold kjernetemperatur på 37 ° C ± 0,5 ° C.
- Skrubb snittet områder med betadine og skyll med 70% etanol. Gjenta dette two flere ganger. Plasser en kirurgisk felt over rotte, og skjære hull for å eksponere snittet områder. VIKTIGE carotis og femoral arteries kan bli isolert uten å forårsake noen skade på omliggende muskulaturen, noe som vil øke utvinningen og minimert påfølgende behov for postoperativ smertelindring.
- Venter tilstrekkelig anestesi, bruk en nr. 10 skalpell til å lage en midtlinjesnitt langs halsen, deretter bruke hemostats omsvøp dissekere mellom spyttkjertler inntil nå sternohyoid muskel, den prominente midtlinjen muskel gruppe som dekker luftrøret. Igjen bruker forsiktig stump disseksjon teknikk, skille de store muskelgruppene i sternohyoid fra sternokleidomastoideus, bilateralt. Disse to muskelgrupper dannes et trekantformet hakk som kan brukes som et landemerker å lokalisere den neurovascular bunt som inneholder halspulsåren. Den vanlige carotis grener i de interne og eksterne carotis. Isoler arteria carotis communis proksimalt for den bifurcation.
- Forsiktig skille disse to musklene og finn halspulsåren. For å bidra til å identifisere dette fartøyet se etter en puls. Isoler halspulsårene på begge sider ved å føre en ~ 5 tommers lengde på 3-0 silke sutur undersiden av fartøyet. Fjerne dashbordet fra skipene. FORSIKTIG er det vagus nerve og sympatisk kjedene inkludert i cervical nevrovaskulære bunt og omsorg bør tas for å unngå å forårsake skade på den når du vil isolere halspulsåren.
- Bruk saks til å foreta et nytt snitt i lysken, langs innrykk der hind-lem lårmusklene møter magen. Dissekere under abdominal muskler, sammen lårmusklene til du kommer til inguinal ligament. Dette vil utsette femoral nevrovaskulære bunt. Nøye isolere lårarterien ved å føre en ~ 5 tommers lengde på 3-0 silke sutur undersiden av fartøyet. Fjerne konseptet forlater 5-7 mm av utsatt fartøy.
- Tie en fast knute ved den distale ende av den eksponerte arterie.
- Påfør trekkraft på suturen ved den proksimale enden av arterien for å okkludere blodstrømmen, ved å trekke suturene lært. Lag et lite snitt på tvers av toppen av beholderen, med oftalmiske saks. Utilstrekkelig trekkraft på fartøyet vil resultere i blødninger, som kan stoppes ved å bruke tyngre trekkraft. Lukk kateteret i vannkranen.
- Ved hjelp av en vaskulær innføringsenhet, føre inn katetret i motsvarende rør i fartøyet, 7-9 mm forbi fartøyet innsnitt og mot midtlinjen. Når kateteret er plassert i ønsket avstand, knytte den løs knute rundt beholderen og kateteret for å feste den på plass. Fjern trekkraft fra beholderen og la den ligge naturlig.
- Administrer 0,3 ml heparin (100U/ml i saltvann), intravenøst. Skyll alleblod ut av kateteret med en liten mengde saltvann for å forhindre koagulering. Slå på trykkvokteren og kalibrere utstyret. Skru opp vannkranene å tillate svingeren å oppdage blodtrykk. For å oppnå nøyaktige målinger av blodtrykket, bør posisjonering av systemet ikke endres etter kalibrering.
- Isofluran dose bør justeres for å gi en midlere arterielle blodtrykk (MAP) fra 110 mmHg til 130 mmHg. Dette kartet skal være en indikasjon på adekvat kirurgisk planet av anestesi.
3. Iskemi Protocol
Som nevnt tidligere, fire skip forsyne perfusjon til hjernen. Proximal okklusjon av de to halspulsårene vil ikke resultere i hjernen iskemi fordi ryggvirvel arteries vil kompensere gjennom Circle of Willis. Det har vist seg at carotis okklusjon, kombinert med indusert systemisk hypotensjon, vil begrense perfusjon gjennom den vertebrale arterier som fører til hjerne-ischemi. Her har vi beskrIbe protokollen for uttak av blod for å produsere hypotensjon og klemming carotis å produsere kontrollert, reversibel iskemi. Se figur 1.
Blod oksygen og karbondioksid, glukosekonsentrasjon og pH kan variere mellom individer i prøven gruppe og resultere i variasjoner i skaden. Overvåking disse fysiologiske variabler kan redusere variabiliteten av infarkt. Som nevnt er temperaturen en annen parameter som er viktig å regulere imidlertid hjernen temperatur ikke kan tilsvare kjernetemperatur, som perfusjon er sterkt redusert utover eksperimentell iskemi 28. Våre spesifikke kirurgiske oppsett resulterer i temperaturendringer i hjernen som speil endringer i kjernetemperatur under iskemi. Det er imidlertid viktig for experimenter å bestemme denne empirisk ved å overvåke temperaturen hjerne med termoelementer eller ved andre midler for å standardisere fremgangsmåten. Hvis kjernetemperatur ikke speile hjernen temperaturen, er det viktig å opprettholde hjernen temperatur normothermic under hele prosedyren, uavhengig av kjernetemperatur.
Randomisering dikterer at kirurgen randomiserer dyret til iskemi eller sham-opererte kontrollgruppe på dette punktet. Sham kirurgi vil følge alle prosedyrer nøyaktig det samme som iskemisk dyr unntatt noen reduksjon i blodtrykk og halspulsåren okklusjon. Det er viktig at de sham-opererte kontroller være under samme dose av anestesi for en varighet som samsvarer med de ischemiske dyr. Hvis det er en behandlingsgruppe inkludert, som krever bedøvelse før eller etter ischemi, bør forloren og ubehandlede grupper iskemi matche anestesi dosering og varighet av behandlingen gruppen.
- Klar hemostatic klipp og klippet applikator. Klips bør helt okkludere karet uten å forårsake noen traumer. Iskemi kan induseres når hemodynamics har blitt konsekvent. Koble en 10 ml heparinisert Syringe inn på stoppekran, vinkelrett og proksimal til kateteret. Det bør være 0,3 ml (30 enheter) av heparinisert saltoppløsning inne i sprøyten for å hindre koagulering av blod trukket tilbake.
- Sett en timer for 1 min og åpne vannkranen til heparinisert sprøyte, slik at blodet kan bli trukket tilbake.
- Trekke blod ved å trekke i stempelet. Hvis for mye sug påføres, vil fartøyet kollapse eller tette mot kateteret åpning og ingen blod vil trekkes. Det bør være mulig å fjerne 7-9 ml blod i 1 min. Hvis dette ikke er tilfelle, avanserte kateteret videre inn i arterien og prøv igjen. Vi finner at 7-9 ml blod må fjernes for å redusere MAP nær 30 mmHg, målet blodtrykket å oppnå iskemi. Viktig Sikre det uttrukne blod holdes ved 37 ° C for å unngå avkjøling under blod reinfusjon.
- Etter ett minutt blodprøvetaking (7-9 ml blod bør trekkes tilbake), gjelder hemostatic klipp til carotis og begynne entidtaker for 8 min. Umiddelbart sjekke blodtrykket. Hvis kartet ikke på 30 mmHg, sette inn eller ta ut blod sakte for å oppnå 30 mmHg ± 1 mmHg. Videreføre denne praksisen gjennom iskemi å opprettholde MAP på 30 mmHg. VIKTIG Record blodtrykk gjennom hele iskemi protokollen. Unnlatelse av å redusere blodtrykket til 30 mmHg kan begrense iskemi. Monitor kjerne og / eller hjerne temperaturen nøye under reinfusion som økning eller reduksjon i temperaturen kan påvirke hjerneskade.
- Ved slutten av 8 min, begynner reperfusjon ved å fjerne de hemostatiske klemmer og reinfusing blodet langsomt, 2 ml per minutt.
- Når blodet har blitt reinfused kanylen kan fjernes fra den femorale arterien. For å unngå blødning under post-op, sikre to separate knop proksimalt til snitt på arterien.
- Sy snittene med en usammenhengende mønster ved hjelp av en invers kutte tråden med 5-0 Vicryl sutur. Dette sutur vil oppløse, så det vil ikke require fjerning. MERK Under prosedyren, hvis tilstrekkelig anestesi ikke kan nås med lavere nivåer av isofluran, administrere en ekstra dose ketamin.
4. Smertelindring og gjenoppretting
Dyreomsorg er prioriteten under utvinning samt den kirurgiske prosedyren. Postoperativ behandling bør følge bestemte retningslinjer ved institusjonen. Dyr som global hjerne iskemi er utsatt for anfall. For å minimere anfall forekomst er det viktig at postoperativ avdeling har minimal stimulering, dvs. lyder og synsforstyrrelser. Under vår bruk av dyr protokollen, huset vi postoperative dyr for 72 timer i enerom for dette formålet.
- Etter snittene har blitt sydd rotte kan være avvent fra ventilatoren. Slå av isofluran og fortsette ventilasjon ved 30% oxygen/70% lystgass til rotte begynner å puste mot ventilator.
- Administrer 0,5 mg / kg butorfanol i 5 ml saltvann, subkutant mellom skulderbladene.
- Raskt reinfusing blodet kan øke høyre ventrikkel preload. Dette øker lunge sirkulasjon press og kan føre til lungeødem. Tegn på dette er anstrengt respirasjon og knitrende lyder under respirasjon. Søker positive enden utåndingstrykk vil bidra til å forbedre lungeødem.
- Når frivillig kontroll av respirasjon er gjenvunnet, extubate, fjerne termometeret og slå av varmeteppet. På dette punktet dyret kan bli plassert i en restitusjonsmerd. Den restitusjonsmerd bør plasseres slik at halvparten av buret er på toppen av et vann sirkulerte teppe (34 ° C) for de første 24 timer av reperfusjon. Plasser dyret på den delen av buret etasje over den varme-teppe for å hjelpe til med temperatur vedlikehold. Når dyret begynner å gjenopprette fra anestesi og analgesi, vil den bevege seg rundt i buret for å thermoregulate selv. Dyr vil bli plassert separat under post-op.
- Dyret skal ha ubegrenset tilgang til vann. For to dager post-op, bør denne inneholde vann 4 mg / kg væske Tylenol løsning. I tillegg til gnager chow, er søtet frokost kornprodukter i buret for å stimulere spising og hindre vekttap.
- Dekke halvparten av buret med en drapere og nøye overvåke postoperative.
- Som dyret kommer seg fra anestesien er det viktig å overvåke med hensyn til tegn på ubehag. Arbeidet eller inkonsekvent respirasjon kan være et tegn på nød, muligens forårsaket av lungeødem eller luftveisirritasjon under intubasjon. Butorphenol vil sedate dyret, redusere aktiviteten, men mild aktivitet bør gjenopprettes innen en time. Vi finner dyrene vil begynne å spise godbiter og drikke i løpet av fire timer av extubation. Med 12 hr, bør normal atferd og fôring aktivitet gjenopptas. Et annet tegn på nød er vekttap, et dyr skal miste mer enn 20% av opprinnelig kroppsvekt i noen 48 timers span, hvis overdreven vekttap is observerte dyret skal avlives.
- Humane intervensjon er nødvendig hvis det oppstår krampeanfall. Denne type anfallsaktivitet er generelt sett 24 til 48 timer etter reperfusjon. Beslag kan føre til økt hjerneskade som er uavhengig av iskemisk fornærmelse per se, bør derfor anfall aktivitet anses en utelukkelse kriterier satt på plass før oppstart av studien 29. Beslagene kan forekomme når ingen er tilstede, så er det viktig å gjenkjenne tegn. Sengetøy vil bli forstyrret og muligens utvist fra buret. En postictal rotte vil ha en sløv disposisjon med rask, tung pust og / eller har en forslått eller blødning nese.
Merk Eventuelle tegn på smerte eller ubehag umiddelbart lindres med smertestillende. Dersom sympotoms ikke lindres med en dose av analgetika eller vedvarer etter den fjerde påfølgende dose av analgesi, vil dyret avlives og ekskludert fra studien. Kirurgisk wounds skal inspiseres for riktig helbredelse i åtte dager post-op.
5. Tissue Innsamling og behandling
Hjernen er løst ved transcardial infusjon av paraformaldehyd. Etter brutto seksjonering og kryobeskyttelse snapper vi fryse hjernen og inndeling på en cryostat. Disse hjernen delene er farget med Cresyl violet og avbildes på en lys mikroskop.
- Indusere anestesi ved å plassere dyret inn i kammeret induksjon og fylling med 30% oksygen / 70% lystgass med 5% isofluran. Intubere dyret og ventiler på 30% oksygen / 70% lystgass med 5% isofluran.
- Forberede materialet for perfusjon prosedyren. Fyll en begerglass med 100 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C og en begerglass med 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) ved 4 ° C. Hjernen er spylt med PBS etterfulgt av PFA gjennom en perfusjon pumpe. Tubing vil bli plassert inn i hvert begerglass og forbundet med en treveis stoppekran til enllow en myk overgang fra PBS til PFA perfusjon. Plasser en avstumpet 18 gauge nål på slangen og fyll tråd med PBS. Sørg for at det ikke er noen bobler i nålen og slangen som luft kan danne en blodpropp, som kan hindre perfusjon. Også klar en liten beholder med PFA for nedsenking fiksering av hjernen.
- Bruk en væskeansamling skuffen, med nok kapasitet til å holde minst 200 ml væske. På dette punktet dyret skal ha blitt ventilert med isofluran for lenge nok (i minst 3 min) for å oppnå dyp anestesi.
- VIKTIG Sørg for kirurgisk plan for anestesi er nådd.
- Fortsett ved å gjøre et snitt for å få tilgang brysthula gjennom magen. Klem synkende aorta. Når hjertet eksponeres, setter avstumpet 18 gauge nål gjennom toppen av hjertet inn i aorta. Lag et lite snitt i høyre atriet å tillate perfusate å gå ut av dyret.
- Slå på pumpen ved 50 ml / min, som begynner med PBS. Etter pumping 100 ml PBS, slå stoppekran til perfuse 100 ml PFA.
- Fjern hjernen, tar seg ikke å skade vev.
- Sett hjernen i en vev matrise og skjær mellom lillehjernen og storhjernen. Seksjon forebrain; ~ 3 millimeter fra forsiden og baksiden av hjernebarken. Dette vil produsere tre seksjoner, vil den midtre delen inneholde hippocampus.
- Plasser hjernen seksjoner i en krukke med nok PFA for fullstendig nedsenking. Immersion fikse hjernen for nøyaktig to timer.
- For å beskytte vev mot skader forårsaket av frysing, er hjernen cryoproteced ved å erstatte PFA med 30% sukrose i PBS. Kryobeskyttelse er komplett med vevsprøvene synke i sukrose-oppløsning (~ 24-48 timer).
- Å knipse fryse hjernen seksjoner, plassere et beger i tørr is og fyll opp med 2-methylbutanol i ti minutter. Plasser hjernen skiver inn i methylbutanol i 5 min, deretter overføre til en lukket beholder og oppbevar ved -80 ° C inntil cryostved seksjonering.
- Cryostat delen av hjernen på 20 mikrometer, samle minst 3 seksjoner på tre hjernen atlas koordinater (The Rat Brain i Stereotaxic Koordinater. Paxinos og Watson, plate § § 29, 31, 33 eller Bregma -2,8 mm, -3,3 mm, og -3,8 mm). Seksjonene er plassert på ladde objektglass og tillatt å tørke før lagring ved -80 ° C.
- Cresyl fiolett (0,1% ved pH 3,5) flekk 9 hjerne seksjoner, 3 ved hver hjerne atlas koordinat.
- Bilde CA1 regionen i hippocampus på 40x med et mikroskop montert kameraet og sette en 300 mikrometer skala bar parallelt med CA1 neuronal flyet. Lagre bilder som TIFF-filer.
6. Brain Damage Kvantifisering
ImageJ, et gratis program som tilbys av National Institute of Health, kan brukes til å telle og kvantifisere levedyktige nevroner, som vil representere omfanget av hjerneskade.
- Åpne mikroskop TIFF-bilder med 'celle teller' plugin av ImageJ. Velg enmerking farge og telle nevroner innenfor grensene av skalaen bar. Nevroner telles basert på enkle inklusjonskriterier basert på neuronal morfologi (stort, pyramidal form) eller eksklusjonskriterier for microglial / astrocyte morfologi (liten rund eller lang rørformet form).
VIKTIG Vær konsekvent med inkludering / ekskludering kriterier mellom lysbildene og enkeltpersoner når telle nerveceller. - Record neuron teller og redde celletallsregner vinduet.
- Neuron teller bør være ferdig innen to separate folk til å oppnå konsistente, nøyaktige nervecellen teller.
- Gjennomsnittet av alle 9 bildene fra hvert dyr vil gi et enkelt bety "neuron count", som er den kvantitative mål på CA1 hippocampal skade for å bli brukt for statistisk analyse. Grupper kan sammenlignes statisk ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukey sin HSD test for post hoc-analyse, eller, hvor normalitet mislykkes, en Kruskal-Wallis enveis ANOVA på rekkene etterfulgt av Dunns post hoc analyse for å statistisk evaluere forskjeller mellom gruppene. Spesifikk statistisk analyse bør være diktert av den enkelte studie design, kan den som presenteres her ikke være hensiktsmessig for de spesifikke hypoteser som blir testet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den 2VOH global modell av hjerne-ischemi / reperfusjon forårsaker neuronal død i CA1-regionen av hippocampus. Figur 2 representerer skade produsert ved 8 min for global hjerne-ischemi, behandlet 14 dager etter reperfusjon. Figurene 2A og 2B sammenligner hippocampi fra og forloren post-iskemisk hjerne, farget med Cresyl fiolett. Figur 2A viser en hippocampus fra en humbug-opererte rotte som viser normal morfologi, inkludert et intakt CA1. Figur 2B viser hippocampus underlagt iskemi / reperfusjon, der dentate gyrus, CA2 og CA3 har minimalt påvirket morfologi. De selektivt sårbare nevroner av CA1 hippocampus ikke overleve iskemi / reperfusjonsskade og bare spredt nevroner forbli. Men dramatiske økninger i infiltrere makrofager og / eller microglia (Iba-1-positive celler), og reaktive astrocytes (GFAP-positive celler) er tydelig i CA1 hippocampal feltet. Spesifikk immunofluorescent merking av nevroner med Neun, makrofag / microglia merking med Iba-en, og astrocyte merking med GFAP bekrefte disse funnene.
Figur 2C presenterer sample nervecellen telle vinduer for mikroskop bilder av CA1 på 40x forstørrelse. Den øverste panelet viser CA1 fra en humbug-opererte kontroll og nedre panelet viser CA1 følgende iskemi / reperfusjon. Den skadde CA1 viser en flekker som inkluderer mikroglia og astrocytes, som vises små og rørformet eller teardrop formet. Disse kan skilles fra nevroner etter deres form. Intakt hippocampus nevroner, enten i dentate gyrus, CA2 eller CA1, er store med en sirkulær eller pyramidal form.
Fig. 2D er en grafisk analyse av den 2VOH indusert skade kvantifisert ved CA1 neuronal teller. Det kan konkluderes med at 8 min av iskemi produsert av 2VOH modellen kan føre en konsekvent og reproducible skader som hovedsakelig isolert til CA1 hippocampus.
Figur 1. Eksperimentell Timeline. Den eksperimentelle tidslinje er en representasjon av de kirurgiske trinn og vev behandling.
Figur 2. Representative resultater. Hippocampus skade hos en ubehandlet rotte utsettes for I / R (B) i forhold til en sham-opererte rotter kontroll (A). Cresyl fiolett farget hippocampus (10X) [Surround] 40X forstørrelse av CA1, Ca2, CA3, hilus og DG (topp leftà klokken). (B) Skade er lokalisert til CA1 hippocAmpus. (C) Representative telle vinduer brukes til nervecellen telling og skader kvantifisering i en humbug-opererte kontroll dyr (topp, kontroll) og et dyr utsatt for global hjerne iskemi (nederst, I / R). (D) Representant kvantifisering av CA1 hippocampus nevroner teller fra en upublisert studie (gjennomsnittlig + standardavvik, n = 8, p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen som er beskrevet her gir en iskemisk hån mot hjernen som kan oppstå som et resultat av hjertestans og gjenoppliving, noe som gir en skade lik den som finnes i mennesker. Denne fremgangsmåte for fremstilling av global hjerne-ischemi er en av flere protokoller. Vi bruker denne protokollen fremst for sin relativt lav dødelighet, rask gjenoppretting, og reproduserbare resultater. Den hjertestans / lungeredning modellen er uten tvil den mest klinisk relevant modell, men teknisk sett mest vanskelig å stadig reprodusere. Den 4VO modell av global hjerne iskemi er en annen vanlig protokoll, verdifullt i det faktum at alle fire medvirkende fartøyene er tilstoppet under iskemi. Denne modellen har også ulemper, som inkluderer flere operasjoner og mulighet for nervecellene prekondisjonering. Den 4VO modellen er blitt justert, slik at forbigående okklusjon av alle fire kar i løpet av en prosedyre for å produsere iskemi, men operasjonen forblir tekniskly krevende 30.
Variasjoner på 2VOH har vist seg å produsere et utvalg av resultater 31,32. Varigheten av iskemi og grad av hypotensjon er de viktigste variablene som kan påvirke utfallet. Rapporter har vist at hvis blodtrykket ikke reduseres tilstrekkelig skaden produsert kan være ensidig eller inkonsekvent i rotter 30. Vi har funnet 30 mmHg for å være en optimal grad av hypotensjon fordi den produserer pålitelig iskemi uten å forårsake merkbar perifer skade. Dette paradigmet produserer iskemi karakterisert som alvorlig, men etter vår protokoll vil redusere den ellers økt sjanse for komplikasjoner. Den alvorlige natur fornærmelse kan være grunnen liten variasjon i fysiologiske parametre mellom dyr ikke vanligvis påvirker skade konsistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
References
- Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
- Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
- Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
- Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
- Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
- Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
- Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
- Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
- Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
- Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
- Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
- Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
- Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
- Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
- Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
- Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
- Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
- Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
- Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
- Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
- Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
- Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
- Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
- Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
- Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
- Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
- Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).
