2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

Summary

全身性低血圧と相まって、二国間の頸動脈閉塞は再現重症度と海馬への損傷、その結果、ラットの全脳虚血を生成します。動物の被験者は脳損傷の予測可能なパターンで損なわれて、彼らは便宜上回復し、死亡率は比較的低いです。

Abstract

蘇生が続く心停止は、しばしば虚血と脳のその後の再灌流によって生じる劇的脳損傷につながる。グローバルな脳虚血、虚血¹に非常に敏感であることが示された特定の脳領域への損傷を生成します。海馬ニューロンは、具体的に他の細胞集団、とに比べて虚血性傷害に高い感度を持って、海馬のCA1領域は虚血/再灌流²に対して特に脆弱です。

治療的介入の設計、または脳損傷に関与するメカニズムの研究は、臨床症状と類似して再現可能な方法で被害を生成モデルを必要とします。低血圧との二国間頚動脈血管閉塞（2VOH）が心停止と蘇生中に発生する可能性がある脳のイベントをエミュレートする、可逆前脳虚血を生成するモデルである。私たちは、Smith らから変更モデルを記述。 ^（1984）2、第1のサンダーソンら ^{（2008）3、}選択的に脆弱な脳領域^3-6に再現可能な傷害を作り出すに現在の形で提示。このモデルの信頼性を印加低血圧、血期間、近い温度制御、特定の麻酔レジメンおよび勤勉術後ケア時に全身血圧を正確に制御することによって決定される。 8分の虚血性傷害が少なく脆弱な脳領域が免れている間、再灌流の6〜24時間の経過とともに進行CA1海馬ニューロンの細胞死を生成します。この漸進的な細胞死を容易にCA1ニューロンのほぼ完全な消失が、この時点で明らかなように、再灌流の7〜14日後に定量化される。

この脳損傷モデルに加えて、我々は、単純な、まだ完全な、方法論を用いてCA1ダメージ定量方法を提案する。重要なことに、定量化は、単純なカメラマウント顕微鏡を用いて達成することができるダ自由ImageJの（NIH）ソフトウェアプラグイン、コスト法外立体学のソフトウェアプログラムおよび損傷評価のための電動顕微鏡のステージを不要。

Introduction

心停止や脳卒中の結果として脳の損傷は、死と長期障害の主要な原因である。心停止の被害者のための心肺蘇生法は、これらの患者の60％は、その後、病院で死亡、少なくとも広範な脳損傷の結果として、米国の^7,8では年間約70,000人の患者の自発的な循環を復元することに成功している間だけ3から10パーセント蘇生患者の^9,10は彼らのかつての暮らしを再開することができます。明らかに、世界的脳虚血に続くと神経外傷を最小限に抑えるために治療的介入を設計する脳の損傷につながるメカニズムを理解することが極めて重要である。

脳虚血は、複数の方法を用いてモデル化することができる。最も一般的には、脳虚血は、このように焦点虚血性脳卒中^11,12を製造する、脳、中大脳動脈の主要な血管を閉塞することにより齧歯類で製造される。臨床的に重要ながら、局所脳虚血は、心停止/蘇生によって生成された脳の損傷を研究するための正確な方法ではありません。この臨床パラダイムをモデル化するために脳全体が虚血が血流の再導入が続く行わなければならない。密接にこの臨床症状を模倣するために、研究者が実験的にCPRや除細動^13,14と蘇生に続いて心停止を誘導する。このモデルは臨床的に関連している、しかし、予測不可能な蘇生時間が変動性を高めることができると解釈し、データ解析を困難にすることができる。また、このモデルはさらに仮説を検証するために必要な動物の数を増加させる、高い死亡率に関連付けられる。より、再現性、一貫性と存続侮辱のグローバル虚血および/または再灌流に対する脳の応答が好ましいかもしれない調査。

いくつかの全身の血流を維持しながら、全虚血は、脳内に誘導することができる。 investigatioを可能にしながら、死亡率を減少させるnは²で脳組織損傷のメカニズムである。全脳虚血を製造するためには、中断したり大幅に脳内頚動脈と椎骨動脈を供給するすべての4つの容器内での流れを制限する必要がある。これらの血管は、吻合ループを形成ウィリスのサークルと呼ばれる血管構造を通して血流と脳を供給。この血管のアーキテクチャでは、脳は、近位血管閉塞が発生した場合の血流を保持することができます。したがって、脳の完全な虚血を誘発するために、すべての拠出血管を通る血流が発生しなければなりません。頸動脈の動脈閉塞が所望の期間の動脈瘤クリップの低侵襲腹ネックカットダウン及びアプリケーションを使用して達成することができる。彼らは脊柱の横孔をでincasedれると椎骨動脈を経由して血流の中断は、困難になる可能性があります。調べでは、椎骨動脈の頸動脈の前に24〜48時間をelectrocauterizingによってこれを対処している咬合と脳虚血（4VOモデル^）15。このアプローチとは対照的に、Smith ら血流が^2を紛失したり大幅に低減される点に椎骨動脈を通って血流を低減するために40 mmHgでまで全身動脈圧（MAP）を意味低減することにより全脳虚血を誘導する方法を開発した。頚動脈閉塞と相まって場合、このメソッドは、密接に心停止の生存者のことを模倣し、脳の損傷のパターンで、その結果、脳全体に血を生成します。この方法のさらなる改良では、我々はここで紹介するモデルは30 mmHgのでタイトMAPレギュレーション±1mHg虚全体の8分の間に必要になります。我々は、Smith らのアイディア独自の技術の低い死亡率を維持しながら、この変化は、このモデルによって誘発される脳損傷の再現性を向上させる発見した。

細胞死によって引き起こされる組織損傷の全体的な程度の正確な表現型ここで紹介するモデルは、虚血性持続¹⁶に直接依存しています。 CA1ニューロンは再灌流段階^15,17間に治療的介入のための一時的なウィンドウがあることを示唆し、細胞死を遅らせ、虚血の8分を示す以下の。再灌流の開始時に、ニューロンは素早く機能を取り戻し、即時の細胞死が¹⁸検出されない。しかし、この侮辱は細胞死カスケードの誘導（アポトーシス）再灌流^3,19の4-6時間の間にシトクロム c、含むミトコンドリアからapoptogenicタンパク質のリリースでその絶頂に達するを引き起こす。再灌流の6と24時間の間に、CA1海馬のニューロンは細胞崩壊にコミットしており、アポトーシス細胞死のプログラムが^19に実行されます。これは、虚血性損傷を担当細胞死の表現型は非常に議論の余地があることに留意すべきである。他の他の人がapoptを報告しながら、初期の研究では、壊死が主細胞死の表現型^20,21で示唆されている主要メカニズム^22,23としてOSIS。合計では、現在の証拠は、細胞が、古典的なアポトーシスから壊死に至るまで細胞死表現型のスペクトルの死ぬことを示唆している。細胞死の特定のモードでは、それぞれの表現型の寄与の度合いが他の要素^24,25の中で、侮辱の重大度に応じて、多くの要因に依存しています。再灌流の24時間で、死細胞が濃縮した核、集約された携帯電話の内容の明確な証拠と凝縮された細胞質、機能ミトコンドリアの形態の損失を持っています。死んだ細胞は、さらに、分解などのマクロファージおよび/またはミクログリアなどの免疫細胞に包まれ、CA1海馬領域か​​ら消去されます。再灌流の4-7日で、死んだ細胞を除去し、すべてのことに変わりは^17,26炎症細胞および活性化グリア細胞であるされています。したがって、再灌流の7日はCA1海馬神経細胞死が単純な、非特定のセルの汚れを使用して定量化することができる最適な時間を表しクレシルバイオレットまたはヘマトキシリン​​·エオシンをcludingと形態学的包含基準に基づいてカウント。この後半の再灌流間隔で残りのセルは、このような脳損傷の指標を提供し、生存細胞としてカウントすることができます。

このモデルは、治療介入をテストするために利用される場合には、実験計画はSTAIR基準（ストローク療法論文界ラウンドテーブル^）27に従うことが示唆された。設計や研究を行う場合は、次のガイドラインに従うべきである、しかし、ここでは説明しません。

Protocol

1。準備

全ての動物実験は、機関のガイドラインに準拠し、開始する前に、それぞれの動物ケア委員会による承認を受けなければならない。すべての手順は、ウェイン州立大学制度動物のケアと使用委員会によって承認されている、ここで提示され、実験動物のケアと使用するためのガイドに出すように、動物の倫理的な処置のガイドラインに従ってくださいとのための米国政府の原則に試験、研究、研修で使用脊椎動物、動物の利用とケア。手術を開始する前に、必要な手術材料、手術の回復ケージを準備します。この手順では、生存の手術であり、それは、したがって、無菌技術を練習することが必要である。

1. 血管カテーテルを作るために、ポリエチレン50（PE50）チューブの8インチの長さをカットし、一端に鈍化23ゲージの針を挿入します。カテーテルは、あらかじめ滅菌aまたはbで購入個別に購入することができます必要に応じてULK、次いでエチレングリコールで滅菌した。
2. 三方活栓の一方のポートにこの針を固定し、反対側のポートで別の三方活栓を配置。を通してヘパリン生理食塩水を実行することにより、ストップコック、カテーテルをヘパリンで治療する。ストップコック垂直とカテーテルの遠位に上に10ミリリットル生理食塩水注射器を接続します。圧力トランスデューサチューブにカテーテルの遠位にコックを接続し、生理食塩水を使用してシステムを記入し、任意の気泡を除去。
3. 動物の使用規則に従って回復ケージをセットアップします。回復室では静かにし、低トラフィックを持っている必要がありますダウンドラフトテーブルまたは類似のガス掃気システム上重要ターンオン気化イソフルランをフィルタリングするために手術を開始する前に。

2。手術準備

のSprague-Dawleyラット（300〜350グラム）は、グローバルな前脳虚血の2VOHモデルで使用されています。麻酔が誘発され、維持イソフルランと商標とされてケタミンのサブ解離線量でplemented。我々は一人でイソフルランによって維持麻酔は術後回復時に発作の増加の発生の原因となることを観察した。発作は、このモデルの再現性に影響を与える神経損傷や死亡、に貢献することができます。ケタミン麻酔を補完するとイソフルランのはるかに低い線量が麻酔の外科等級に到達することができます。恒常サーマルブランケットを使用すると、コア温度の厳密な調節を可能にします。外科手術では、頸動脈カットダウンと分離、および大腿動脈のカットダウンとカニュレーションを伴う。

それは個々の外科手術中に詳細な記録を維持することが重要であることに注意してください 。中核体温、血圧、又は外科手術の前またはその間に発生する他の生理学的変数の変化が急激結果を変えることができ、レコードが個人とグループ間の手続き一貫性があることを確認するために分析することができる。一貫性動物の生理学的パラメータを手術前に、動物に絶食を向上させることができる。実験者は、その研究のために、最も一貫性のあるプレ操作血行動態及び血清グルコース濃度の結果、そのメソッドを決定するために奨励されています。

1. 誘導室にラットを配置することにより、麻酔を誘導し、イソフルラン5％少なくとも30％oxygen/70％亜酸化窒素の混合物でいっぱい。 2.5％イソフルランと30％oxygen/70％亜酸化窒素の混合物と齧歯類の​​喉頭鏡と換気を使用し、12ゲージのカテーテルを挿管。換気率は息当たり2.5ミリリットルで毎分80回の呼吸でなければなりません。
2. 生理食塩水でケタミンの腹腔内注射（20 mg / kg）を与えると、1.5％のイソフルラン減らす。 重要それは麻酔の適切な外科的な面を確保するために、作業中は麻酔のレベルを監視することが不可欠です。ペダルの反射を監視しながら、後肢桁間麻酔、ピンチの深さを確認するには。反射である場合欠席、麻酔で十分です。大腿動脈の挿管した後、血圧を麻酔レベルの指標として用いることができる。虚血後の発作の可能性を最小限にするため、麻酔の外科平面性を維持しながら可能な限り低くイソフルランの投与量を維持する。
3. 切開は、首にし、骨盤領域で行われる。大腿部が腹部を満たして首と右骨盤を、剃る。オリエント恒常サーモ毛布で仰臥位ラットおよび外科潤滑剤を使用して直腸の温度計を挿入します。保護目の潤滑剤を適用します。 60ワットの電球には、温度を調節するのに役立ちます。電球は動物からの8インチより近くてはいけません。上または下に正常な生理的温度（37℃）が大きく、最終的な神経損傷に影響を与えることができる重要な気温。 37℃でコア温度を維持°C±0.5℃の
4. ベタジンで切開部分をスクラブし、70％エタノールで洗い流してください。このTWを繰り返し複数回O。ラット上の手術野を置き、切開部分を露出させるための穴をカット。 重要頸動脈と大腿動脈は回復を改善し、術後鎮痛のために、その後の必要性を最小化します周囲の筋肉組織、任意の外傷を引き起こすことなく、単離することができる。
5. 十分な麻酔保留、ぶっきらぼうに胸骨舌骨筋、気管をカバー著名正中筋群に到達するまでの間の唾液腺解剖止血剤を使用して、その後、首に沿って正中切開をするメス10号を使用しています。再び慎重に鈍的切開法を用いて、二国間、胸骨乳から胸骨舌骨の主要な筋肉群を分離する。これら二つの筋肉群は、頚動脈が含まれている神経血管束を特定するランドマークとして使用することができる三角形の窪みを形成する。内部および外部の頚動脈に総頸動脈分岐する。双方向に近総頸動脈を分離分岐。
6. 静かにこれら二つの筋肉を分離し、頸動脈を見つけます。パルスは、この容器の外観を識別するのに役立つ。容器の下に3-0絹縫合糸の〜5インチの長さを渡すことで、両側の頸動脈を分離します。血管から筋膜を取り除く。迷走神経と交感神経チェーンを注意子宮頸神経血管束とケアに含まれている頸動脈を分離する際に損傷を与えないように注意する必要があります。
7. 後肢の太ももの筋肉が腹部を満たしインデントに沿って、鼠径部において第2の切開をするはさみを使用します。あなたは鼠径靭帯に到達するまで、太ももの筋肉に沿って、腹筋の下に解剖する。これは、大腿神経血管束を公開します。慎重に容器の下に3-0絹縫合糸の〜5インチの長さを渡すことによって、大腿動脈を分離。暴露容器5-7ミリメートル残し筋膜を取り除く。
8. 暴露動脈の遠位端の永久結び目を作る。
9. 教示縫合糸を引っ張ることにより、血流を閉塞する動脈の近位端に縫合糸にトラクションを適用する。眼科はさみで容器の上部に小さな切開を行います。容器に不十分なトラクションが重くトラクションを適用することにより停止することができます出血になります。コックでカテーテルを閉じます。
10. 血管のイントロデューサを使用して、7〜9ミリメートル血管切開過ぎと正中線に向けて、容器内にカテーテルチューブを挿入します。カテーテルが所望の距離に配置されたら、それを適所に確保するために容器とカテーテルの周り緩い結び目を作る。容器からトラクションを削除し、それが自然にうそをつくことができます。
11. 静脈内に0.3ミリリットルヘパリン（生理食塩水で100U/ml）、管理します。いずれかをフラッシュ凝固防ぐために生理食塩水に少量のカテーテルの血外。圧力モニターの電源を入れ、機器のキャリブレーションを行います。トランスデューサは、血圧を検出できるようにストップコックを開く。血圧の正確な測定値を得るために、システムの位置決めは、キャリブレーション後に変更されるべきではない。
12. イソフルラン投与量は、130〜110 mmHgのmmHgの平均動脈圧（MAP）を得るように調整されるべきである。このマップは、麻酔の適切な外科的平面を示すべきである。

3。虚血プロトコル

前述したように、4隻は、脳への血流を供給する。椎骨動脈はウィリスのサークルを通じて補正しますので、2頸動脈の近位閉塞は、脳虚血にはなりません。これは、誘導性全身性低血圧に結合さ頚動脈閉塞、脳虚血を生じる椎骨動脈を通って血流を制限することが示されている。ここでは、DESCR低血圧を生成するために、血液を吸引し、制御された、可逆性虚血を生成するために頚動脈をクランプするためのプロトコルをIBE。 図1を参照してください。

血中酸素および二酸化炭素、グルコース濃度及びpHは、試料グループ内の個体間で異なり、損傷の変動を引き起こす可能性があります。これらの生理学的変数を監視する梗塞のばらつきを低減することができる。灌流が大きく実験虚血²⁸の間に制限されるように説明したように、温度を調節することが重要である別のパラメータである、しかし脳の温度は、コア温度に対応しないかもしれない。脳内の温度変化に当社の特定の手術セットアップ結果は虚血時のコア温度のミラーに変化。しかしながら、熱電対またはプロシージャを標準化する他の手段によって脳温度を監視することによって、この経験的に決定するために実験者が重要である。コア温度は、脳の温度を反映していない場合温度は、コア温度に関係なく、全体の手順時の脳の温度が正常体温に維持することが重要である。

ランダム化は、外科医がこの時点で虚血または偽手術対照群と動物をランダム化するように指示。偽手術は血圧と頸動脈閉塞の減少を除く虚血動物とまったく同じすべての手順に従います。これは、偽手術コントロールは虚血動物のことと一致する期間麻酔の同じ用量であることが重要である。虚血前または後に麻酔を必要含ま治療群が存在する場合、偽および未処理虚血グループは、麻酔用量および治療群の継続時間を一致させるべきである。

1. レディ止血クリップとクリップアプリケーター。クリップは完全に任意の外傷を引き起こすことなく、血管を閉塞する必要があります。血行動態が一貫となっていたときに虚血を誘導することができる。 10ミリリットルヘパリン化シリを接続コック、垂直、カテーテルの近位にNGE。撤回血液の凝固を防ぐために、シリンジ内ヘパリン化生理食塩水0.3 mlの（30台）があるはずです。
2. 1分のタイマーを設定し、ヘパリン処理シリンジにコックを開いて、血が撤回することができるようにします。
3. シリンジプランジャを引いて血を撤回。あまりにも多くの吸引が適用される場合、容器が崩壊又はカテーテル用開口に対してシールず、血液が吸い込まれないことになる。これは、1分で血7-9ミリリットルに除去することが可能でなければなりません。これが事実でない場合は、動脈にカテーテルをさらに進めて、再試行してください。我々は、血液7-9 mlを30 mmHgで、虚血を達成するための目標血圧近いMAPを低減するために除去しなければならないことが判明。 重要引き出さ血液℃で血再注入の間に冷却を避けるために、37℃に保たれていることを確認。
4. 1分採血（7-9血液のミリリットル撤回されるべきである）は、頸動脈に止血クリップを適用し始めた後に8分間のタイマー。すぐに血圧をチェックしてください。 MAPは30 mmHgのでない場合は、注入またはゆっくりと30 mmHgの±1 mmHgのを達成するために、血液を撤回。 30 mmHgでのMAPを維持するために、虚血を通してこの練習を続けています。全体虚プロトコルを通じて重要レコード血圧。 30 mmHgのに血圧を低減する障害、虚血を制限することができる。温度の増加または減少などの再注入の間に密接コアおよび/または脳の温度を監視し、脳損傷に影響を及ぼす可能性がある。
5. 8分の終わりには、毎分2ミリリットル、止血クリップを削除し、徐々に血を再注入することにより再灌流を開始します。
6. 血液が再注入されたときにカニューレを大腿動脈から除去することができる。動脈上の切開の近位術後、セキュア2つの別々の結び目の間に任意の出血を避けるために。
7. 5-0 VICRYL縫合と、逆カッティング針を用いて不連続パターンで切開を縫合。この縫合は溶けるので、それはしませんRequire除去。NOTE手順の間には、十分な麻酔はイソフルランの下位レベルに達することができない場合には、ケタミンの付加的な用量を投与。

4。鎮痛と回復

動物福祉は回復だけでなく、外科手術時の優先事項です。術後ケアは施設の具体的なガイドラインに従う必要があります。全脳虚血を受ける動物は、発作の影響を受けやすい。発作の発生を最小限に抑えるためには、回復室、最小限の刺激、すなわちノイズや視覚障害を有することが重要である。この目的のために人里離れた部屋の中で72時間のための私たちの動物使用プロトコルの下で、我々は家術後の動物を。

1. 切開部を縫合された後、ラットは人工呼吸器をオフ離乳することができます。イソフルランをオフにして、ラットが人工呼吸器に対して息を始めるまで30％oxygen/70％亜酸化窒素で換​​気を続ける。
2. 0.5mgの/ Kの管理皮下に肩甲骨の間に5ミリリットルの生理食塩水でグラムブトルファノール、。
3. 急速に血を再注入すると、右心室前負荷を高める可能性があります。これは、肺循環の圧力を増加させ、肺水腫を引き起こす可能性があります。このインクルードの兆しが呼吸時に呼吸とパチパチ音をこじつけ。呼気終末陽圧を適用すると、肺水腫の改善に役立たせていただきます。
4. 呼吸の自発的制御が回復している場合、抜管、温度計を取り外し、加熱毛布をオフにします。この時点で、動物は回復ケージ内に配置することができる。ケージの半分は再灌流の最初の24時間のための水循環毛布（34°C）の上にありますので、回復ケージが配置されるべきである。温度維持を支援するために加熱毛布かけケージの床の一部に動物を配置します。動物が麻酔および鎮痛から回復し始めると、それは自分自身を温度調節するためにケージを移動します。動物は、術後の間に別々に収容されます。
5. 動物は、水への無制限のアクセスを持っている必要があります。二日後にオペアンプでは、この水は4 mg / kgを液体タイレノールソリューションが含まれているはずです。げっ歯類に加えて、加糖朝食用シリアルを食べる刺激し、体重減少を防ぐためにケージに設けられている。
6. ドレープとケージの半分をカバーし、密接に術後の回復を監視します。
7. 動物が麻酔から回復したように、それは苦痛の徴候を監視することが重要です。こじつけや矛盾した呼吸は多分挿管時に肺水腫や気道炎症によって引き起こされる苦痛の徴候であることができる。 Butorphenol落ち着いた動物は、活性を低下させる、しかし、軽度の活動は1時間以内に復元する必要があります。私たちは動物がお菓子を食べて、抜管の4時間以内に飲み始めます見つける。 12時間、通常の行動と摂食活動を再開すべきである。苦痛のもう一つの兆候は減量であり、動物は、任意の48時間スパンで元の体重の20％以上を失う必要があり、過度の減量場合、私はsが、動物を安楽死されるべきで観察した。
8. 発作が発生した場合、人道的介入が必要である。発作活動のこのタイプは、一般に、再灌流後24〜48時間に見られる。発作自体虚血とは無関係であるが増加脳の損傷を引き起こす可能性があり、こうして発作活動前調査²⁹の開始する場所に設定された除外基準を考慮する必要があります。誰もが存在しないとき発作が発生することがあるので、兆候を認識することが重要である。寝具が乱れ、おそらくケー​​ジから追放されます。発作後のラットは、迅速で気だるい気質を持っている呼吸および/こじつけや打撲や出血鼻を持つことになります。

痛みや苦痛の兆候注記は直ちに鎮痛薬で軽減される。 sympotomsは、鎮痛剤の1回投与で軽減や鎮痛の4年連続投与後存続していない場合は、動物は安楽死させ、試験から除外されます。外科WOundsは8日後にオペアンプのための適切な治癒のために点検してください。

5。組織の収集と処理

脳は、ホルムアルデヒドのtranscardial注入によって固定されています。総切片と凍結保護した後、我々はクライオスタットに脳やセクションを凍結スナップ。これらの脳切片をクレシルバイオレットで染色し、光学顕微鏡で結像される。

1. 誘導室に動物を配置し、5％イソフルランで30％の酸素/ 70％亜酸化窒素を充填することにより麻酔を誘発する。動物に挿管し、5％イソフルランで30％の酸素/ 70％亜酸化窒素で換​​気する。
2. 灌流手続きのための材料を準備します。 1×100mlのリン酸塩が、4℃緩衝生理食塩水（PBS）および4°Cで4％パラホルムアルデヒド（PFA）℃で100mlのビーカーを使用すると、ワン〜とビーカーを埋めるPBSで灌流ポンプを通じて、PFAが続くと脳がフラッシュされます。チューブは、それぞれのビーカーに入れ、を三方活栓によって接続されるPBSからPFA灌流へのスムーズな移行をLLOW。チューブに鈍化18ゲージの針を置き、PBSで行を埋める。空気が灌流を防ぐことができる塞栓を形成することができるように針とチューブ内に気泡がないことを確認してください。また、脳の浸漬固定用PFAと準備ができて小さな容器。
3. 流体の少なくとも200ミリリットルを保持するのに十分な容量を持つ、流体収集トレイを使用してください。この時点で、動物は深い麻酔に達するために（少なくとも3分）で十分な長さのためのイソフルランで換気されている必要があります。
4. 重要麻酔の外科平面に到達していることを確認します。
5. 腹部を通して胸腔にアクセスするために切開を行うことによって進みます。下行大動脈をクランプします。心臓を露出させたとき、大動脈内に心尖を介して平滑18ゲージの針を挿入する。灌流液は、動物を終了できるようにするため、右耳介に小さなカットを行います。
6. PBSで始まる、50ml /分でポンプの電源をオンにします。 pumpi後にPBSのngの100mlを、PFA 100mlのを灌流するコックを切り替える。
7. 組織を損傷しないように注意しながら、脳を取り外します。
8. 組織マトリックスに脳を置き、小脳や大脳の間でカット。節前脳、大脳皮質の前面と背面から〜3ミリメートル。これは3つのセクションが生成されます、真ん中のセクションでは、海馬が含まれます。
9. 完全に浸漬のために十分にPFAと瓶に脳切片を置きます。浸漬はまさに2時間脳を修正。
10. 凍結による損傷から組織を保護するために、脳をPBS中30％スクロースにPFAを置き換えることによりcryoprotecedされる。組織サンプルは、ショ糖溶液（〜24〜48時間）内にシンク付きの凍結保護が完了しました。
11. 脳切片を凍結スナップするには、ドライアイスでビーカーを置き、10分2 - メチルブタノールで記入してください。 5分間メチルブタノールに脳スライスを置き、その後cryostまで-80℃で密閉容器や店舗°Cに移す切片で。
12. 20ミクロンでクライオスタットセクションは、脳、3脳アトラス座標（定位座標におけるラット脳。Paxinosとワトソン、板部29、31、33またはブレグマ-2.8ミリメートル、-3.3ミリメートル、および-3.8で少なくとも3つのセクションを収集mm）である。切片を帯電顕微鏡スライド上に配置され、-80℃で保存する前に乾燥させる
13. クレシルバイオレット（pH3.5の0.1％）9脳切片を染色し、各脳アトラス座標における3。
14. 画像は顕微鏡で40倍で、海馬のCA1領域は、カメラマウントとCA1ニューロンの平面と300μmのスケールバーを平行に挿入します。 TIFFファイルとして画像を保存します。

6。脳損傷の定量化

ImageJは、国立衛生研究所が提供する無料のプログラムは、脳の損傷の程度を表す実行可能なニューロンを、カウントし定量化するために使用することができます。

1. ImageJのの 'セルカウンター'プラグインで開く顕微鏡TIFF画像。選択するスケールバーの境界内に色とカウントニューロンをマーキング。ニューロンはミクログリア/アストロサイト形態（小さな丸いや長い筒状）が神経形態（大、錐形状）または除外基準に基づいて、単純な選択基準に基づいてカウントされます。
   ニューロンを数えるときに重要スライド、および個人間/除外基準に一貫性を持たせます。
2. レコードニューロン数とセルカウンターウィンドウを保存します。
3. ニューロン数は一貫して、正確なニューロンの数を達成するために2つの別々の人々に完了する必要があります。
4. 各動物からのすべての9枚の平均値は、統計的分析に使用されるCA1海馬損傷の定量的尺度である単一の平均値 "ニューロンの数"を、提供する。グループは、静的に正規性テストが失敗したTukeyのHSD 事後解析のためのテスト、または、ダンのPO続いランク上のクラスカル·ウォリス一方向ANOVA続い一方向ANOVAを用いて比較することができます統計的に群間の差を評価するための聖定型分析。具体的な統計分析は、個々の研究デザインによって決定されるべきであり、ここで紹介するいずれかテストされている特定の仮説のために適切でないかもしれません。

Representative Results

グローバルな脳虚血/再灌流の2VOHモデルは、海馬のCA1領域の神経細胞死を引き起こす。 図2は 14日間再灌流後に処理、グローバルな脳虚血の8分で生成けがを表しています。 図2Aおよび2Bは、偽から海馬を比較し、クレシルバイオレットで染色した虚血後の脳は、 図2AはそのままCA1を含め、正常な形態を示す偽手術ラットから海馬を示しています。 図2Bは、虚血/再灌流に海馬件名を、実証場所歯状回、CA2およびCA3最小限の形態に影響を与えている。 CA1海馬の選択的に脆弱なニューロンは、虚血/再灌流障害に耐えないし、唯一の散在ニューロンが残ります。しかし、浸潤マクロファージおよび/またはミクログリア（伊庭-1陽性細胞）、および反応性アストロサイト（GFAP陽性細胞）の劇的な増加はCA1時間に明らかであるippocampalフィールド。ホテルネウン、マクロファージ/ミクログリア伊庭-1とラベリング、およびGFAPとアストロサイトのラベリングとニューロンの特定の免疫蛍光ラベリングは、これらの調査結果を裏付ける。

図2Cは、40倍の倍率でCA1の顕微鏡画像のウィンドウを数えるサンプルニューロンを提示します。トップパネルには、偽手術コントロールからCA1を示しており、下のパネルは、虚血/再灌流CA1次を示しています。小さな筒状またはティアドロップ形の見える怪我CA1ディスプレイミクログリアとアストロサイトを含む染色。これらは、その形状によって神経細胞と区別することができる。そのまま海馬ニューロンは、歯状回においてどうか、CA2またはCA1は、円形または錐形状を持つ大規模である。

図2Dは ​​、CA1ニューロンのカウントすることによって定量2VOH誘発傷害のグラフィカルな分析である。それは2VOHモデルによって生成虚血の8分が引き起こす可能性があることを結論することができる一貫しreproducibl主に海馬CA1に隔離されている電子けが。

図1。実験的なタイムライン。実験のタイムラインは、外科的手順と組織処理を表現したものです。

図2。代表的な結果。偽手術対照ラット（）に比べてI / R（B）に供し、未処理のラットにおける海馬損傷。クレシルバイオレット染色した海馬（10倍）[サラウンド] 40X CA1の倍率、CA2、CA3、門、およびDG（トップleftà時計回り）。（B）損害はCA1 hippocにローカライズされていますCA1のampus。（C）ニューロンカウントとダメージ定量偽手術対照動物で（上、コントロール）およびグローバル·脳虚血にさらされる動物に使用代表カウント窓（下、I / R）は、（D）代表定量未発表の研究から海馬ニューロンカウント（+標準偏差平均値であり、n = 8、P <0.05）。

Discussion

ここで説明されたモデルは、ヒトで見られるものと同様の傷害を提供し、心停止および蘇生の結果として発生する可能性がある脳の虚血性傷害を生成する。全脳虚血を製造するためのこの方法は、複数のプロトコルの一つである。我々は、その比較的低い死亡率、急速な回復、および再現性のある結果を得るために何よりも、このプロトコルを利用する。心停止/蘇生モデルは、しかし技術的には、間違いなく常に再現することが最も困難で最も臨床的に関連するモデルです。グローバルな脳虚血の4VOモデルは4つのすべての貢献血管が血中に閉塞していることを実際に貴重な他の一般的に使用されるプロトコルです。また、このモデルでは、複数の手術や神経保護前処理の可能性を含む欠点を持っています。 4VOモデルは1つのプロシージャの間にすべての4隻の一過性閉塞が虚血を生成できるように、適応されています、しかし手術は技術のまま^30を要求LY。

2VOH上のばらつきが結果^31,32の範囲を生成することが示されている。虚血および低血圧の程度の期間は、結果に影響を与えることができる主要な変数です。レポートは、血圧が十分に低減されていない場合に生成さ損傷はラット³⁰に矛盾する、または一方的であり得ることが示されている。我々は、それが顕著な周辺機器の損傷を引き起こすことなく、信頼性の虚血を生成するので低血圧の最適度であることが30 mmHgのを発見した。このパラダイムは、しかし、我々のプロトコルが合併症の他の方法で増加可能性が低くなります続いて、厳しいとして特徴付け虚血を生成します。侮辱の厳しい自然は、動物間の生理学的パラメータのわずかな変化が、一般負傷の一貫性に影響を与えない理由かもしれない。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name
5-0 VICRYL suture, reverse cutting	Ethicon	J391H
Scalpel, No.10	Swann-Morton	6601
Gauze Sponges	Fisher	22-362-178
18G x 1 ½ in needle	BD	305201
23G x 1 in needle	BD	305145
26 G x 3/8 in needle	BD	305110
18 G x 1 ¼ catheter	EXEL	26735
1 ml syringe	BD	309659
10 ml syringe	BD	309604
60 ml syringe	BD	309653
Surgilube	Henry Schein	1152666
.9% Saline, plastic IV bag	Henry Schein	1537468
Suture 3-0 Silk	Henry Schein	1007842
Puralube Ophthalmic Ointment	Henry Schein	3390017
Betadine	Henry Schein	6903564
Sterile Towel Drape	Moore Medical	14170
Polyethylene Tubing, 50	Intramedic	427411
Stopcock, 3 way	Smiths medical	MX9311L
Drug Name
AERRANE (isoflurane)	Henry Schein	2091966
Mapap Liquid (Tylenol)	Major Pharmaceuticals	1556
Kedavet (ketamine)	Ketathesia Butney	NDC 50989-996-06
Butorphic (butorphanol)	Lloyd Labs	4881
Heparin	APP Pharmaceuticals	504011
Chemical Name
Paraformaldehyde prills	Elecron Microscopy Sci.	19202
2-methylbutane	Sigma	270342
Cresyl Violet Acetate	Sigma	C5042
Sucrose	Sigma	S9378
Software
ImageJ	NIH