Summary
Двусторонние окклюзии сонной сочетании с системной гипотензии производит глобальной ишемии мозга у крыс приводит к повреждению гиппокампа с воспроизводимыми тяжести. Животное субъектов обесценились с предсказуемый характер повреждения головного мозга, они выздоравливают целесообразно, и смертность сравнительно низки.
Abstract
Остановка сердца последующей реанимации часто приводит к резкому повреждение головного мозга, вызванных ишемией и последующей реперфузии головного мозга. Глобальной ишемии мозга производит повреждение определенных областях мозга показано, что весьма чувствительными к ишемии 1. Нейронов гиппокампа имеют более высокую чувствительность к ишемического инсульта по сравнению с другими популяции клеток, и, в частности, области СА1 гиппокампа особенно подвержена ишемии / реперфузии 2.
Конструкция терапевтическое вмешательство или изучение механизмов, участвующих в повреждения головного мозга, требуется модель, которая производит повреждение похожа на клиническое состояние и воспроизводимым образом. Двусторонние окклюзии сонной судно с гипотонией (2VOH) представляет собой модель, которая формирует обратимой ишемии переднего мозга, подражая головного события, которые могут произойти во время остановки сердца и реанимации. Мы описали модель редактировался Смит и др.. (1984) 2, А впервые представлена в его нынешнем виде в Sanderson и соавт. (2008) 3, который производит воспроизводимых травмы выборочно уязвимых регионах мозга 3-6. Надежность этой модели продиктован точным контролем системного артериального давления при гипотонии применяются, длительность ишемии, тщательный контроль температуры, специальную схему анестезии, и прилежные послеоперационного ухода. 8 минут ишемического инсульта производит гибель клеток СА1 нейронов гиппокампа, который прогрессирует в течение от 6 до 24 часов реперфузии, в то время как менее уязвима областей мозга избавлены. Эта прогрессивная гибели клеток легко количественно 7-14 дней после реперфузии, как почти полная потеря нейронов CA1 очевидно, в это время.
В дополнение к этой модели мозговой травмы, мы представляем метод для количественного CA1 повреждения с помощью простой, но тщательно, методология. Важно отметить, что количественное может быть достигнуто с помощью простого монтажа камеры микроскопа,Да Фри ImageJ (NIH) программного обеспечения плагин, что исключает необходимость в непомерно программ стереологии программного обеспечения и моторизованных микроскопические стадии оценки ущерба.
Introduction
Повреждения головного мозга, как следствие, остановки сердца и инсульт является одной из ведущих причин смерти и длительной инвалидности. В то время сердечно-легочной реанимации для жертв остановки сердца успеха в деле восстановления спонтанного кровообращения примерно в 70 000 пациентов в год в США 7,8 по меньшей мере 60% этих больных впоследствии умирают в больнице в результате обширного повреждения головного мозга, и только 3-10% из реанимации пациенты могут возобновить свои бывшие 9,10 образа жизни. Очевидно, что понимание механизмов, которые приводят к повреждению мозга после глобальной ишемии мозга и проектирования терапевтического вмешательства, чтобы минимизировать неврологические травмы имеет решающее значение.
Ишемии мозга может быть смоделировано использованием различных методов. Чаще всего, ишемии головного мозга производится в грызунах по окклюзии главный кровеносный сосуд в мозге, средней мозговой артерии, производя таким образом координационного ишемического инсульта 11,12. В то время как клинически значимые,фокальной ишемии мозга не является точным методом изучения мозга ущерб в результате остановки сердца / реанимации. Для моделирования этой клинической парадигмы весь мозг должен быть сделан ишемический последующей реинтродукции кровотока. Чтобы точно имитировать эту клиническую картину, исследователи экспериментально вызвать остановку сердца последующей реанимации с СЛР и дефибрилляции 13,14. Эта модель является клинически значимым, однако непредсказуемое время реанимации может увеличить изменчивость и может сделать анализ данных трудно интерпретировать. Кроме того, эта модель связана с высокой смертностью, дальнейшее увеличение числа животных необходимо проверить гипотезу. Исследование головного ответ на глобальной ишемии и / или реперфузии в более воспроизводимым, последовательной и живучие оскорбление может быть предпочтительным.
Глобальной ишемии может быть индуцирован в головном мозге при сохранении некоторых кровоток системно. Это снижает смертность, позволяя при этом investigatioн механизмов повреждения тканей в головном мозге 2. Для получения глобальной ишемии мозга, необходимо прервать или значительно ограничить поток во всех четырех сосудов, которые снабжают мозг, внутренней сонной артерии и позвоночных артерий. Эти сосуды снабжают мозг с кровотоком через сосудистый структура, называемая Круг Уиллис, которая образует петлю анастомоза. Эта архитектура позволяет сосудистой головной мозг, чтобы сохранить перфузии в случае проксимальной окклюзии сосудов. Таким образом, чтобы вызвать полную ишемию головного мозга, кровоток через все сопутствующие сосуды должны произойти. Сонной артерии может быть достигнуто при использовании минимально инвазивной вентральной шеи урезанную и применение аневризмы клипы на желаемый срок. Нарушению кровотока по позвоночным артериям может быть трудно, так как они incased в поперечном отверстий отдела позвоночника. Исследователи решали эту проблему, electrocauterizing позвоночных артерий 24-48 ч до соннойокклюзии и ишемии мозга (4VO модели) 15. В противоположность этому подходу, Smith и соавт. Разработали способ индукции ишемии мозга за счет снижения среднего артериального давления (MAP) системно до 40 мм для уменьшения перфузии через позвоночные артерии до точки, где поток крови теряется или значительно снижается 2 . В сочетании с окклюзией сонных, этот метод вызывает ишемию всей переднего мозга, в результате чего модель повреждения головного мозга, которые близко имитирует сердечной выживших после остановки. С целью дальнейшего совершенствования этого метода, модели, представленной здесь требует жесткого регулирования MAP на 30 мм рт.ст. ± 1mHg в течение всего 8 мин ишемии. Мы нашли это изменение улучшает воспроизводимость мозга повреждений, вызванных этой модели, сохраняя при этом низкий уровень смертности оригинальной методики разработаны Смит и др..
Точный фенотип клеточной смерти и общую степень повреждения тканей вызванныхМодель, представленная здесь напрямую зависит от продолжительности ишемических 16. После 8 мин ишемии СА1 нейронов демонстрируют задерживается гибели клеток, что свидетельствует о наличии временного окна для терапевтического вмешательства во время фазы реперфузии 15,17. В начале реперфузии, нейроны быстро восстановить функцию и никакого непосредственного гибели клеток не определяется 18. Однако это оскорбление вызывает индукцию каскадов гибель клеток (апоптоз), которые завершаются выпуском апоптогенное белки из митохондрий, включая цитохром С, 4-6 ч реперфузии 3,19. Между 6 и 24 часа в сутки реперфузии нейронов CA1 гиппокампа обязались клетки кончину, и программа апоптоза гибель клеток, выполненном 19. Следует отметить, что гибель клеток ответственны за фенотип ишемическое повреждение является весьма спорным. Ранние исследования показали, некроз является основной фенотип гибели клеток 20,21, в то время как другие другие сообщают apoptОсис в качестве основного механизма 22,23. В общей сложности, имеющиеся данные позволяют предположить, что клетки умирают спектра гибели клеток фенотипы от классического апоптоза некроз. Конкретный режим гибели клеток зависит от многих факторов, причем степень вклада каждого фенотипа в зависимости от тяжести инсульт, среди других факторов, 24,25. К 24 ч реперфузии, умирающие клетки обладают пикнотических ядер, сгущенное цитозоле с четкими признаками агрегированных клеточного содержимого, и потеря функциональной морфологии митохондрий. Мертвые клетки разбиты, охвачен иммунных клеток, таких как макрофаги и / или микроглии и очищены от CA1 гиппокампа. На 4-7 дней реперфузии, мертвые клетки удаляются, а все, что остается являются воспалительными клетками и активированные глиальные клетки 17,26. Таким образом, 7 дней реперфузии представляет собой оптимальное время где СА1 гиппокампа гибель нейронов может быть определена количественно с помощью простых, неспецифический пятна ячейкиCresyl том числе фиолетовые или hemotoxylin-эозином и подсчитывали на основе морфологических критериев включения. Клеток, оставшихся в этот поздний интервал реперфузии может быть расценено как выживших клеток, тем самым обеспечивая индекс повреждения мозга.
Если эта модель должна быть использована для проверки терапевтических вмешательств, предполагается, что опытно-конструкторские следовать ЛЕСТНИЦЫ критериев (терапии инсульта Академический промышленности Круглого стола) 27. Эти принципы должны соблюдаться при планировании и проведении исследования, однако здесь не обсуждаются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
Все эксперименты на животных должны соответствовать ведомственным руководящим принципам и получить одобрение соответствующего Комитета ухода за животными до начала. Все процедуры, представленные здесь, были одобрены Wayne State University Институциональные уходу и использованию животных комитета и следовать указаниям на этичное обращение с животными, как выдвинул в Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, а также правительству США принципов Использование и уход за позвоночных животных, используемых в Испытания, исследования и обучение. Перед началом операции, подготовить необходимые материалы и хирургические операции восстановления клетке. Эта процедура выживание хирургии и, следовательно, необходимо на практике стерильной техники.
- Чтобы сосудистого катетера, вырезать 8 дюйма длиной труб полиэтиленовых 50 (PE50) и вставьте затупленной 23 иглы в один конец. Катетер может быть приобретен отдельно предварительно стерилизованные или приобретенные в BУЛК, а затем стерилизовали с этиленгликолем при необходимости.
- Закрепить эту иглу на один порт трехходовым краном и разместить еще трех ходовой кран на противоположной порту. Heparinize краны и катетер гепарином, запустив через солевой раствор. Соединение 10 мл физиологического раствора шприц на перпендикулярное кран и дистальнее катетера. Подключите кран дистальной к катетеру к трубке датчика давления, заполнить систему физиологического раствора и удалить пузырьки воздуха.
- Установка восстановления клетку в соответствии с правилами использования животных. Восстановление комнате должно быть тихо и имеют низкий трафик. Важный поворот на стол или нисходящий поток Похожие системы очистки газа перед началом операции для фильтрации изофлурана испаряется.
2. Хирургическая подготовка
Sprague-Dawley крыс (300-350 г) используют в 2VOH модели ишемии переднего мозга. Анестезия индуцируется и поддерживается изофлураном и поддержкиplemented с суб-диссоциативные доза кетамина. Мы заметили, что анестезия поддерживается изофлурана только причины возникновения повышенной конфискации во время послеоперационного восстановления. Приступы могут способствовать нейронные повреждения и смертности, которая окажет влияние на воспроизводимость этой модели. Дополнение анестезии кетамином позволяет получить более низкие дозы изофлуран, чтобы достичь хирургической стадия наркоза. Использование гомеостатическими термоодеяла позволяет строгое регулирование температуры ядра. Хирургическая процедура влечет за собой сонную артерию урезанную и изоляции, и бедренная артерия обрезанной и катетеризации.
ПРИМЕЧАНИЕ Важно вести подробные записи во время каждого отдельного хирургического вмешательства. Изменения температуры тела, кровяного давления или других физиологических переменных, которые происходят до или во время операции может кардинально изменить результаты и записи могут быть проанализированы, чтобы у пассажиров было процедурной согласованности между отдельными лицами и группами. СогласованностьВ физиологических параметров животное может быть улучшена путем пост животных до операции. Экспериментаторы предлагается определить метод, который приводит к наиболее последовательным управлением предварительного гемодинамики и концентрации в сыворотке глюкозы для своих исследований.
- Анестезии, помещая крысу в индукции камеры, а затем с 30% oxygen/70% смеси закиси азота при 5% изофлурана. Интубация с 12-го калибра катетер, используя ларингоскоп грызунами и вентиляцию с 30% oxygen/70% закиси смеси оксида с 2,5% изофлурана. Вентиляция ставка должна быть 80 вдохов в минуту при 2,5 мл на дыхании.
- Дайте внутрибрюшинную инъекции кетамина (20 мг / кг) в физиологическом растворе и уменьшить изофлурана до 1,5%. ВАЖНО Крайне важно, чтобы контролировать уровень анестезии на протяжении всей процедуры для обеспечения адекватного хирургического плоскости анестезии. Для проверки глубины анестезии, щепотка между задних конечностей цифр, в то время как мониторинг педали рефлекс. Если рефлексотсутствует, анестезия является адекватной. После канюли в бедренную артерию, кровяное давление может быть использована в качестве индикатора уровня анестезии. Держите дозу изофлурана как можно ниже, сохраняя при хирургической анестезии плоскости для снижения вероятности возникновения пост-ишемических приступов.
- Разрез будет сделан на шее и в области малого таза. Бритья шеи и правой таза, где бедро отвечает живота. Orient крысы в лежачем положении на гомеостатические термо-одеяло и вставьте ректального термометра с использованием хирургических смазки. Прикрепите защитную смазку глаза. 60 ваттная лампочка может помочь в регулировании температуры. Лампы никогда не должны быть ближе, чем 8 дюймов от животного. ВАЖНО температура выше или ниже нормальных физиологических температурах (37 ° С) может сильно влиять окончательного неврологические повреждения. Поддерживайте температуру ядра при 37 ° C ± 0,5 ° С.
- Скраб разрез областей бетадином и промыть 70% этанола. Повторите эту TWO более раз. Наведите хирургического поля над крысой, и вырезать отверстия, чтобы разоблачить разрез областях. ВАЖНО сонных и бедренных артерий, могут быть выделены, не вызывая никаких травм окружающие мышцы, что позволит улучшить восстановление и минимизировать последующую необходимость послеоперационного обезболивания.
- В ожидании адекватной анестезии, использовать скальпель № 10, чтобы сделать срединный разрез вдоль шеи, то, используя кровоостанавливающие прямо не рассекают между слюнных желез до достижения грудинно-подъязычный мышцы, видные группы мышц средней линии охватывает трахею. Снова используя осторожны тупым технику вскрытия, отделить основные группы мышц грудинно-подъязычный от грудино-сосцевидный, на двусторонней основе. Эти две группы мышц образуют треугольную отступа, которые могут быть использованы в качестве ориентира для обнаружения нервного пучка, который содержит сонной артерии. Общих сонных разветвляется на внутренней и наружной сонной артерии. Изолят общей сонной артерии проксимальнее биразвилка.
- Аккуратно отделить эти две мышцы и найдите сонной артерии. Чтобы определить это судно искать пульс. Изолят сонных артерий с обеих сторон путем пропускания ~ 5 дюймов длиной 3-0 шелковой нити под сосудом. Очистить от фасции из сосудов. ВНИМАНИЕ блуждающего нерва и симпатической цепи включены в шейном сосудисто-нервного пучка и следует проявлять осторожность, чтобы не вызывать к его повреждению при выделении сонной артерии.
- Используйте ножницы, чтобы сделать второй разрез в паховой области, а также углубление, где задних конечностей мышцы бедра встречается живота. Проанализируйте под брюшной мышцы, а мышцы бедра, пока не достигнете паховой связки. Это откроет бедренного сосудисто-нервного пучка. Тщательно изолировать бедренной артерии путем пропускания ~ 5 дюймов длиной 3-0 шелковой нити под сосудом. Очистить от фасции оставив 5-7 мм оголенного судна.
- Tie постоянного узел на дистальном конце подвергается артерии.
- Применение тяги на шов на проксимальном конце артерии для окклюзии кровотока, потянув швов учат. Сделать небольшой надрез в верхней части судна с глазной ножниц. Недостаточная тяга на судне приведет к кровотечению, которое может быть остановлено путем применения тяжелого тяги. Закрыть катетера на запорный кран.
- Использование сосудистый интродьюсер, вставьте трубки катетера в сосуд, 7-9 мм мимо судно разрез и к средней линии. Как только катетер находится на нужном расстоянии, завяжите свободный узел вокруг судна и катетер, чтобы закрепить его на месте. Снимите тягу с судна и дайте ему естественно лежат.
- Администрирование 0,3 мл гепарина (100U/ml в физиологическом растворе), внутривенно. Подавить любоекрови из катетера с небольшим количеством физиологического раствора, чтобы предотвратить свертывание. Включите реле давления и калибровки оборудования. Открыть запорные краны, чтобы датчик для обнаружения артериального давления. Для получения точного измерения артериального давления, позиционирование системы не должны быть изменены после калибровки.
- Isoflurane дозировка должна быть скорректирована с получением среднего артериального давления (САД) 110 мм рт.ст. до 130 мм рт. Эта карта должна быть показателем адекватное хирургическое плоскости анестезии.
3. Ишемия протокола
Как упоминалось ранее, четыре сосуды снабжают перфузии головного мозга. Проксимальная окклюзия два сонных артерий не приведет к ишемии мозга, потому что позвоночной артерии будет компенсировать посредством Круг Уиллис. Было показано, что сонная окклюзии, в сочетании с индуцированной системной гипотензии, ограничит перфузии через позвоночной артерии в результате ишемии головного мозга. Здесь мы DescrIBE протокол для извлечения крови производят гипотонии и зажимные сонных артерий производить контролируемое обратимой ишемии. См. рисунок 1.
Крови кислородом и углекислым газом, концентрация глюкозы и рН может меняться в зависимости от лиц и организаций в целом по выборке и вызывают изменения в травме. Мониторинг этих физиологических переменных может уменьшить изменчивость миокарда. Как упоминалось выше, температура другого параметра, который является важным для регулирования, однако температура мозга может не соответствовать внутренней температуры, как перфузия в значительной степени ограничен при экспериментальной ишемии 28. Наши конкретные результаты хирургического настройки температуры изменения в головном мозге, что зеркало изменения температуры тела во время ишемии. Тем не менее, важно, чтобы экспериментатор, чтобы определить это эмпирически путем мониторинга температуры мозга с помощью термопар или другими средствами для стандартизации процедуры. Если температура ядра не отражают мозга температурытемпературы, важно, чтобы поддерживать температуру мозга нормотермической в течение всей процедуры, независимо от внутренней температуры.
Рандомизация требует, чтобы хирург случайным животного к ишемии или ложно-оперированных контрольной группы в этой точке. Шам операция будет соблюдать все процедуры точно так же как ишемическая животных исключая любые снижению кровяного давления и сонной артерии. Важно, что с ложной операцией управления находиться в одной дозе наркоза в течение времени, который соответствует этой ишемизированного животных. Если есть лечение группу входили, которое требует анестезии до или после ишемии, фиктивный и необработанных групп ишемии должен соответствовать доза анестезии и продолжительности лечения группы.
- Готовые гемостатические клипсы и клип аппликатором. Клипы должны полностью закупоривать сосуд, не вызывая никаких травм. Ишемия может быть индуцирована при гемодинамики стали последовательно. Подключите 10 мл гепаринизированные SyriNGe на краны, перпендикулярной и проксимально по отношению к катетеру. Там должно быть 0,3 мл (30 единиц) гепаринизированного солевой внутри шприца для предотвращения свертывания крови сняты.
- Установите таймер в течение 1 мин и откройте кран с гепарином шприц, так что кровь может быть отозвано.
- Вывод крови, потянув поршень шприца. Если слишком много всасывания применяется, судно рухнет или уплотнения относительно катетера открытия и кровь не будет обращено. Должна быть возможность для удаления 7-9 мл крови в 1 мин. Если это не так, выдвинул катетер дальше в артерии и повторите попытку. Мы считаем, что 7-9 мл крови должны быть удалены, чтобы уменьшить карте Рядом 30 мм рт ст, целевого уровня артериального давления для достижения ишемии. ВАЖНО Убедитесь, что сняты крови поддерживается на уровне 37 ° С, чтобы избежать охлаждения во время реинфузии крови.
- После одной минуты взятия крови (7-9 мл крови, должны быть сняты), применяют гемостатические клипы на сонных артериях и начатьТаймер в течение 8 мин. Немедленно проверить артериальное давление. Если карта не на 30 мм рт ст, наполнить или взять кровь медленно, чтобы достичь 30 мм ± 1 мм рт. Продолжать эту практику в течение ишемии сохранить MAP 30 мм рт. ВАЖНО кровяное давление Запись на протяжении всего протокола ишемии. Неспособность снизить артериальное давление до 30 мм рт.ст. может ограничить ишемии. Монитор основных и / или температуры мозга близко во время реинфузии как увеличение или снижение температуры может влиять повреждения мозга.
- В конце 8 мин, начинают реперфузии путем удаления гемостатических зажимов и реинфузии крови медленно, 2 мл в минуту.
- Когда кровь была реинфузии канюли может быть удален из бедренной артерии. Чтобы избежать кровотечения во время послеоперационной, безопасный два отдельных узлов проксимальнее разрез на артерии.
- Шовный разрезы с разрывным узора с помощью обратной иглы резки, с 5-0 VICRYL шва. Этот шов будет растворяться, поэтому он не будет Rэквайеру удаления. ПРИМЕЧАНИЕ Во время процедуры, при наличии достаточных анестезии не может быть достигнута с более низким уровнем изофлуран, администрирования дополнительной дозы кетамина.
4. Обезболивание и восстановление
Благополучие животных является приоритетной во время восстановления, а также хирургической процедуры. Послеоперационный уход должны следовать конкретные руководящие принципы учреждения. Животные, которые подвергаются глобальной ишемии мозга подвержены судороги. Чтобы свести к минимуму захват возникновение важно, чтобы комнате восстановления имеют минимальный стимуляции, т.е. шумы и нарушения зрения. В нашем протоколе использование животных, мы дома послеоперационных животных в течение 72 ч в уединенном номере для этих целей.
- После разрезы были пришивается крыса может отлучить от вентилятора. Выключите изофлурана и возобновления вентиляции на 30% oxygen/70% закиси азота, пока крыса не начинает дышать против вентилятора.
- Администрирование 0,5 мг / к.буторфанолом г в 5 мл солевого раствора, подкожно между лопатками.
- Быстро реинфузии крови может увеличиться правый желудочек. Это увеличивает давление в легочной циркуляции и может привести к отеку легких. Признаками этого являются затрудненное дыхание и потрескивание при дыхании. Применение положительного давления в конце выдоха поможет улучшить отек легких.
- Когда добровольный контроль дыхания восстанавливается, экстубации, удалите термометр и выключить отопление одеяло. В этот момент животное может быть помещен в восстановлении клетке. Восстановление клетка должна быть расположена таким образом половины клетка находится в верхней части воды, циркулирующей одеяло (34 ° C) в течение первых 24 часов реперфузии. Место животное на части пола клетки над нагревательными одеяло, чтобы помочь в поддержание температуры. Как только животное начинает оправиться от наркоза и обезболивания, он будет передвигаться по клетке, чтобы регулировать температуру самой. Животные будут размещены по отдельности во время послеоперационной.
- Животное должно иметь неограниченный доступ к воде. В течение двух дней послеоперационного, эта вода должна содержать 4 мг / кг жидкой Tylenol решение. В дополнение к корм для грызунов, подслащенные зерновых завтрак предоставляется в клетке, чтобы стимулировать еды и предотвратить потерю веса.
- Покрыть половину клетку с драпировкой и внимательно следить послеоперационного восстановления.
- Когда животное восстанавливается после анестезии важно отслеживать признаки бедствия. Затрудненное дыхание или противоречивой может быть признаком бедствия, возможно, вызвано отеком легких или раздражение дыхательных путей во время интубации. Butorphenol будет степенный животных, снижение активности, однако мягкая деятельность должна быть восстановлена в течение 1 часа. Мы находим животные начинают есть и пить удовольствий в течение 4 ч экстубации. К 12 ч, нормальное поведение и кормления деятельность должна быть возобновлена. Другим признаком бедствия потеря веса; животных должны терять не более 20% от первоначальной массы тела в любой промежуток 48 часов, если чрезмерной потери веса яс наблюдать животных следует усыплять.
- Гуманное вмешательство необходимо, если припадки. Этот тип судорожной активности как правило, рассматривается от 24 до 48 ч после реперфузии. Приступы могут привести к увеличению повреждения мозга, которое не зависит от ишемического инсульта по себе, таким образом, судорожной активности следует рассматривать как исключение критериев, установленных на месте до начала исследования 29. Приступы могут возникать, когда никто не присутствует, поэтому важно распознавать признаки. Постельное белье будет нарушен и, возможно, исключили из клетки. Постиктальные крыса будет иметь томный расположение с быстрым, затрудненное дыхание и / или имеют синяки или кровотечения носом.
Примечание Любые признаки боли или бедствия, немедленно устраняются применением анальгетиков. Если sympotoms не устраняются применением одной дозы анальгетиков или сохраняться после четвертой дозы обезболивания, животное будет быть умерщвлены и исключены из исследования. Хирургическое WOunds должны быть проверены на предмет надлежащего лечения в течение восьми дней послеоперационное.
5. Коллекция тканей и обработки
Мозг фиксируется transcardial вливания параформальдегиде. После валового секционирования и криозащиты, мы оснастки заморозить мозг и раздел о криостата. Эти срезы мозга окрашивали Cresyl фиолетовый и отображается на световом микроскопе.
- Индуцировать анестезию путем помещения животного в индукции камеры и заполнение 30% кислорода / 70% закиси азота с добавлением 5% изофлуран. Интубировать животных и проветрить на 30% кислорода / 70% закиси азота с добавлением 5% изофлуран.
- Подготовьте материал для перфузии процедуры. Заполните один стакан с 100 мл 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при 4 ° С и один стакан с 100 мл 4% параформальдегида (PFA) при 4 ° С. Мозг промыт PBS последующим PFA, посредством перфузии насоса. Трубки будет помещен в каждый стакан и соединены с трехходовым запорным краном, чтобыLlow плавный переход от PBS перфузии PFA. Наведите затупленной иглу 18 калибра на НКТ и заполнить строку с PBS. Убедитесь, нет пузырьков в иглу и трубку, как воздух может образовывать эмболии, которые могли бы помешать перфузии. Кроме того, готова небольшой контейнер с PFA для погружения фиксации головного мозга.
- Используйте лоток для сбора жидкости, с достаточной способностью удерживать не менее 200 мл жидкости. В этот момент животных должна быть вентилируемой с изофлуран достаточно долго (по крайней мере, 3 мин), чтобы достичь глубокой анестезии.
- ВАЖНО Убедитесь хирургической анестезии плоскости будет достигнут.
- Продолжайте, делая разрез для доступа к грудной полости через брюшную полость. Зажмите нисходящей аорты. Когда сердце подвергается вставить затупленных 18 иглы через верхушки сердца в аорту. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии, чтобы перфузат для выхода из животного.
- Включить насос при 50 мл / мин, начиная с PBS. После PumpiNG 100 мл PBS, переключите кран заливать 100 мл PFA.
- Удалить мозг, стараясь не повредить ткани.
- Поместите мозга в ткань матрицы и разрез между мозжечком и головного мозга. Раздел переднего мозга; ~ 3 мм от передней и задней части коры головного мозга. Это даст три секции, средней секции будет содержать гиппокампа.
- Поместите срезы мозга в банку с достаточным PFA для полного погружения. Погружение исправить мозг ровно 2 часа.
- Чтобы защитить ткани от повреждений, вызываемых замерзанием, мозг cryoproteced заменив PFA с 30% сахарозы в PBS. Криозащиты в комплекте с образцов тканей тонуть в раствор сахарозы (~ 24-48 ч).
- Чтобы привязать заморозить срезах мозга, поместить стакан в сухой лед и залейте 2-метилбутанол течение десяти минут. Поместите срезы мозга в метилбутанол в течение 5 мин, затем передать в герметичный контейнер и хранить при температуре -80 ° С до cryostна секционирования.
- Криостат разделе мозг на 20 мкм, собирая по крайней мере, на 3 секции 3 атлас мозга координаты (мозг крысы в стереотаксическим координатам. Paxinos и Ватсона, плиты разделах 29, 31, 33 или брегмы -2,8 мм, -3,3 мм, -3,8 мм). Разделах размещены на заряженные слайды микроскопа и сухой перед хранением при -80 ° С.
- Cresyl фиолетовый (0,1% при рН 3,5) пятно 9 срезов головного мозга, 3 на каждой мозга Атлас координат.
- Изображение региона CA1 гиппокампа на 40x с помощью микроскопа установлены камеры и вставить 300 мкм шкалы параллельно с CA1 нейронов плоскости. Сохранение изображений в виде файлов TIFF.
6. Количественное Brain Damage
ImageJ, бесплатная программа, предлагаемая Национальным институтом здоровья, может быть использована для подсчета и количественно жизнеспособных нейронов, которые будут представлять степень повреждения головного мозга.
- Открытое микроскопом TIFF изображения с плагином "Счетчик клеток" из ImageJ. Выберитемаркировка цвет и количество нейронов в пределах шкалы. Нейроны подсчитываются на основе простых критериев включения на основе морфологии нейронов (крупные, пирамидальной формы) или исключения критериев микроглии / астроцитов морфологии (маленькие круглые или длинной трубчатой формы).
ВАЖНО Будьте последовательны в критериях включения / исключения между слайдами, и физические лица при подсчете нейронов. - Запись нейронов рассчитывает и сохранении окна счетчика клеток.
- Нейрон счет должны быть завершены с помощью двух отдельных людей для достижения последовательной, Точный подсчет нейрона.
- Среднее значение всех 9 изображений из каждого животного обеспечит одной средней "нейрон счет", которая является количественной мерой СА1 гиппокампа повреждения быть использованы в статистическом анализе. Группы могут быть сравнены статически использованием однофакторного дисперсионного анализа последующим HSD тест Тьюки для апостериорного анализа, или, если нормальность тест не пройден, критерий Крускала-Уоллиса односторонний ANOVA на ряды последующим ро Даннаго специального анализа для статистической оценки различий между группами. Конкретные статистического анализа должны быть продиктованы индивидуальный дизайн исследования, одним представленные здесь может не подходить для конкретных гипотез проходит испытания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2VOH Модель общей ишемии мозга / реперфузионного вызывает гибель нейронов в области СА1 гиппокампа. Рисунок 2 представляет травма производства 8 мин глобальной ишемии мозга, обработанных 14 дней после реперфузии. Фиг.2А и 2В сравнить гиппокампа от фиктивных и постишемического мозги, окрашивали Cresyl фиолетового. рисунке 2а гиппокампа от ложнооперированных крыса, которая показывает нормальную морфологию, в том числе нетронутыми CA1. рис. 2В демонстрирует гиппокампе подлежат ишемии / реперфузии, где зубчатая извилина, CA2 и CA3 было минимальное влияние морфологии. Избирательно уязвимых нейронах гиппокампа CA1 не выживают при ишемии / реперфузии и только рассеянные нейроны остаются. Тем не менее, резкое увеличение проникновения макрофагов и / или микроглии (МБА-1-позитивных клеток), и реактивные астроциты (GFAP-позитивных клеток) проявляются в CA1 чippocampal поля. Конкретные Иммунофлуоресцентной маркировки нейронов с NeuN, макрофагов / микроглии маркировке с МБА-1, и астроцитов маркировки GFAP подтверждают эти выводы.
На фиг.2С представляет пример подсчета нейронов окна для микроскопом изображения CA1 в 40-кратном увеличении. На верхней панели показывает CA1 от ложнооперированных управления и панели показано CA1 после ишемии / реперфузии. Потерпевшая CA1 отображает окрашивания, который включает микроглии и астроцитов, которые появляются мелкие и трубчатые или форму слезы. Они могут быть выделены из нейронов по их форме. Интактных нейронов гиппокампа, будь то в зубчатой извилине, Ca2 или CA1, большие с круглым или пирамидальной формы.
Рисунок 2D представляет собой графический анализ 2VOH индуцированной травмой количественно CA1 нейронов рассчитывает. Можно сделать вывод, что 8 мин ишемии производства 2VOH модель может вызвать последовательное и reproduciblэлектронной травмы, которые в основном изолированы от СА1 гиппокампа.
Рисунок 1. Экспериментальные шкале. Экспериментальные сроки является представлением мер хирургического и обработки ткани.
Рисунок 2. Представитель Результаты. Поражения гиппокампа в необработанном крысы подвергались I / R (B) по сравнению с ложнооперированных дератизация (A). Cresyl гиппокампе окрашенные фиолетовым (10x) [Surround] 40X увеличениях CA1, CA2, CA3, воротах, и DG (верхняя leftà часовой стрелки). (B) Урон локализуется в CA1 hippocAmpus. (C) представитель подсчет окон, используемых для подсчета нейронов и повреждения количественного в ложно-оперированных животных управления (сверху, контроль) и животное подвергается глобальной ишемии головного мозга (дно, I / R). (D) представитель количественного СА1 гиппокампа рассчитывает нейрона из неопубликованного исследования (среднее ± стандартное отклонение, N = 8, р <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта модель описана здесь производит ишемического инсульта головного мозга, которые могут возникнуть в результате остановки сердца и реанимации, обеспечивая травмы подобный тем, которые имеются у людей. Этот способ получения глобальной ишемии мозга является одним из множества протоколов. Мы используем этот протокол очередь для его сравнительно низкой смертности, быстрое восстановление, и воспроизводимость результатов. Остановки сердца / реанимации модели, возможно, самый клинически значимой модели, однако технически самый сложный постоянно размножаются. 4 VO модели глобальной ишемии мозга другой обычно используемый протокол, ценные в том, что все четыре способствует сосуды перекрываются при ишемии. Эта модель также имеет свои недостатки, которые включают в себя несколько операций и возможность нейропротекторные предварительной подготовки. 4VO модель была адаптирована, позволяя переходных окклюзии всех четырех судов в течение одной процедуры, чтобы произвести ишемии, однако операция остается техническаяLY требуют 30.
Вариации на 2VOH было показано, что производим ряд результатов 31,32. Продолжительность ишемии и степень гипотензии основные переменные, которые могут влиять на результат. Отчеты показали, что если артериальное давление не снижается достаточно травм производятся могут быть противоречивыми или односторонних у крыс 30. Мы нашли 30 мм, чтобы быть оптимальной степени гипотензия, поскольку он производит надежные ишемии, не вызывая заметное повреждение периферического. Эта парадигма производит ишемия характеризуется как тяжелое, однако после нашего протокола снизит иначе увеличилась вероятность осложнений. Суровая природа оскорбление может быть причиной небольшие изменения в физиологических параметров между животными правило, не влияет травмы консистенции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких финансовых конфликтов интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | |||
| 5-0 VICRYL suture, reverse cutting | Ethicon | J391H | |
| Scalpel, No.10 | Swann-Morton | 6601 | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| 18G x 1 ½ in needle | BD | 305201 | |
| 23G x 1 in needle | BD | 305145 | |
| 26 G x 3/8 in needle | BD | 305110 | |
| 18 G x 1 ¼ catheter | EXEL | 26735 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| Surgilube | Henry Schein | 1152666 | |
| .9% Saline, plastic IV bag | Henry Schein | 1537468 | |
| Suture 3-0 Silk | Henry Schein | 1007842 | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Henry Schein | 3390017 | |
| Betadine | Henry Schein | 6903564 | |
| Sterile Towel Drape | Moore Medical | 14170 | |
| Polyethylene Tubing, 50 | Intramedic | 427411 | |
| Stopcock, 3 way | Smiths medical | MX9311L | |
| Drug Name | |||
| AERRANE (isoflurane) | Henry Schein | 2091966 | |
| Mapap Liquid (Tylenol) | Major Pharmaceuticals | 1556 | |
| Kedavet (ketamine) | Ketathesia Butney | NDC 50989-996-06 | |
| Butorphic (butorphanol) | Lloyd Labs | 4881 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 504011 | |
| Chemical Name | |||
| Paraformaldehyde prills | Elecron Microscopy Sci. | 19202 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 270342 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma | C5042 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
References
- Kirino, T., Sano, K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathologica. 62, 201-208 (1984).
- Smith, M. L., Auer, R. N., Siesjo, B. K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 64, 319-332 (1984).
- Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. Journal of Neurochemistry. 106, 1248-1258 (2008).
- Sanderson, T. H., et al. Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia. Neurological Research. 31, 947-958 (2009).
- Sanderson, T. H., et al. PKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) activation following brain ischemia is independent of unfolded nascent proteins. Neuroscience. 169, 1307-1314 (2010).
- Hazelton, J. L., et al. Hyperoxic reperfusion after global cerebral ischemia promotes inflammation and long-term hippocampal neuronal death. Journal of Neurotrauma. 27, 753-762 (2010).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 121, e46-e215 (2010).
- Krause, G. S., Kumar, K., White, B. C., Aust, S. D., Wiegenstein, J. G. Ischemia, resuscitation, and reperfusion: mechanisms of tissue injury and prospects for protection. American Heart Journal. 111, 768-780 (1986).
- Krause, G. S., White, B. C., Aust, S. D., Nayini, N. R., Kumar, K. Brain cell death following ischemia and reperfusion: a proposed biochemical sequence. Critical Care Medicine. 16, 714-726 (1988).
- Bloom, H. L., et al. Long-term survival after successful inhospital cardiac arrest resuscitation. American Heart Journal. 153, 831-836 (2007).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 84-91 (1989).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. J. Vis. Exp. (48), e1978 (2011).
- Neumar, R. W., et al. Calpain mediates eukaryotic initiation factor 4G degradation during global brain ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 876-881 (1998).
- Paine, M. G., Che, D., Li, L., Neumar, R. W. Cerebellar Purkinje Cell Neurodegeneration After Cardiac Arrest: Effect of Therapeutic Hypothermia. Resuscitation. , (2012).
- Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B., Plum, F. Temporal profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Annals of Neurology. 11, 491-498 (1982).
- Edinger, A. L., Thompson, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology. 16, 663-669 (2004).
- Kirino, T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Research. 239, 57-69 (1982).
- Yager, J. Y., Brucklacher, R. M., Vannucci, R. C. Cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and early recovery in immature rats. The American Journal of Physiology. 262, 672-677 (1992).
- Sugawara, T., Fujimura, M., Morita-Fujimura, Y., Kawase, M., Chan, P. H. Mitochondrial release of cytochrome c corresponds to the selective vulnerability of hippocampal CA1 neurons in rats after transient global cerebral ischemia. J. Neurosci. 19, RC39 (1999).
- Nishino, H., et al. Pathophysiological process after transient ischemia of the middle cerebral artery in the rat. Brain Research Bulletin. 35, 51-56 (1994).
- Ross, D. T., Ebner, F. F. Thalamic retrograde degeneration following cortical injury: an excitotoxic process. Neuroscience. 35, 525-550 (1990).
- Soriano, M. A., Ferrer, I., Rodriguez-Farre, E., Planas, A. M. Apoptosis and c-Jun in the thalamus of the rat following cortical infarction. Neuroreport. 7, 425-428 (1996).
- Watanabe, H., et al. Protein synthesis inhibitor transiently reduces neuronal death in the thalamus of spontaneously hypertensive rats following cortical infarction. Neuroscience Letters. 233, 25-28 (1997).
- Wei, L., Ying, D. J., Cui, L., Langsdorf, J., Yu, S. P. Necrosis, apoptosis and hybrid death in the cortex and thalamus after barrel cortex ischemia in rats. Brain Research. 1022, 54-61 (2004).
- Zong, W. X., Thompson, C. B. Necrotic death as a cell fate. Genes & Development. 20, 1-15 (2006).
- Ito, U., Spatz, M., Walker, J. T., Klatzo, I. Experimental cerebral ischemia in mongolian gerbils. I. Light microscopic observations. Acta Neuropathologica. 32, 209-223 (1975).
- Saver, J. L., Albers, G. W., Dunn, B., Johnston, K. C., Fisher, M. Stroke Therapy Academic Industry Roundtable (STAIR) recommendations for extended window acute stroke therapy trials. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 40, 2594-2600 (2009).
- Busto, R., Dietrich, W. D., Globus, M. Y., Ginsberg, M. D. The importance of brain temperature in cerebral ischemic injury. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 20, 1113-1114 (1989).
- Voll, C. L., Auer, R. N. Postischemic seizures and necrotizing ischemic brain damage: neuroprotective effect of postischemic diazepam and insulin. Neurology. 41, 423-428 (1991).
- Yamaguchi, M., Calvert, J. W., Kusaka, G., Zhang, J. H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat. Stroke; a Journal of Cerebral Circulation. 36, 2212-2214 (2005).
- Gionet, T. X., Warner, D. S., Verhaegen, M., Thomas, J. D., Todd, M. M. Effects of intra-ischemic blood pressure on outcome from 2-vessel occlusion forebrain ischemia in the rat. Brain Research. 586, 188-194 (1992).
- Sugawara, T., et al. Effect of hypotension severity on hippocampal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Research. 877, 281-287 (2000).
