Summary
Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.
Abstract
Non virale trasferimento genico utilizzando nanoparticelle polimeriche è emerso come un approccio interessante per la terapia genica per trattare malattie genetiche 1 e come una tecnologia per la medicina rigenerativa 2. A differenza dei virus, che hanno notevoli problemi di sicurezza, nanoparticelle polimeriche possono essere progettati per essere non tossico, non immunogenica, non mutagena, più facile da sintetizzare chimicamente versatile, in grado di trasportare più carichi di acido nucleico e biodegradabili e / o l'ambiente reattivo. Polimeri cationici auto-assemblano con DNA carico negativamente tramite interazione elettrostatica per formare complessi dell'ordine di 100 nm, che sono comunemente denominate nanoparticelle polimeriche. Esempi di biomateriali utilizzati per formare nanoscala policationici nanoparticelle di consegna del gene includono polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s e polietilenimmina (PEI), che è un non-degradabile off-the-shelf polimero cationico comunemente utilizzato per la consegna di acido nucleico 1,3. Poli (beta-amminoestere) s (PBAEs) sono una nuova classe di polimeri cationici 4 che sono idroliticamente degradabili 5,6 e hanno dimostrato di essere efficace nel gene delivery a hard-trasfezione tipi cellulari quali cellule endoteliali retiniche (HRECs) 7, topo cellule epiteliali mammarie 8, cervello umano cellule tumorali 9 e macrovascolari (vena ombelicale umana, HUVEC), cellule endoteliali 10.
Un nuovo protocollo per caratterizzare nanoparticelle polimeriche che utilizzano l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) è descritto. In questo approccio, sia la distribuzione della dimensione delle particelle e la distribuzione del numero di plasmidi per particella si ottengono 11. Inoltre, un elevato throughput a 96 pozzetti per saggio di transfezione piastra screening rapido dell'efficacia trasfezione di nanoparticelle polimeriche è presentato. In questo protocollo, poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) sono usati come modello polimeri e cellule retiniche umane endoteliali (HRECs) sono usati come modEL cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente adattato per valutare qualsiasi nanoparticella polimerica e qualsiasi tipo di cellule in un multi-pozzetto formato lastra.
Introduction
La determinazione del numero di plasmidi complessati per nanoparticelle è importante progettare nanoparticelle efficaci strategie basate consegna del gene, in particolare per co-fornitura di plasmidi multipli al bersaglio stessa cella, come spesso è richiesto in cellule staminali riprogrammazione studi 12. Alcuni approcci per calcolare il numero di plasmidi associati a una singola nanoparticella sono stati descritti, e ogni approccio ha degli inconvenienti nelle tecniche utilizzate per la stima 13-16. Quantum dot (QD) etichettatura combinata con TEM è stato utilizzato per stimare plasmidi per particella in chitosano base di nanoparticelle. Stima con questa tecnica QD è complicato a causa della necessità di etichettare il DNA, che potrebbero alterarne le proprietà auto-assemblaggio, la possibilità che incapsulato DNA non marcato non è direttamente rilevato; plasmidi potenzialmente sovrapposti e QDs nelle immagini TEM 2D di particelle, e altre ipotesi semplificatrici 13. Un approccio alternativo, che è unApplicabile quando microdomini ordinati esistono in particelle è stato utilizzato per studiare Lipopolyamine-DNA mediante crio-microscopia elettronica a trasmissione (crio-TEM), X-ray scattering e light scattering dinamico (DLS) 14,15. Purtroppo, materiali come le nanoparticelle polimeriche esaminati qui non sono applicabili in questo metodo. . In un altro studio, Collins et al utilizzata una particella flusso tecnica di analisi di immagine per studiare (Lys) 16-peptide contenente / DNA, tuttavia, il metodo può valutare, grandi dimensioni micron particelle 16. Così, abbiamo recentemente messo a punto un nuovo metodo di analisi e flessibile per quantificare il numero di plasmidi nanoparticelle per 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Semina cellulare
- Non consentono alle cellule di crescere fino a overconfluency. Utilizzare le cellule di passaggio in anticipo in cui trasfezione delle cellule primarie.
- Ventiquattro ore prima della trasfezione, le cellule Tripsinizzare, contare le cellule utilizzando un emocitometro, e diluire la sospensione cellulare con supporti per ottenere la densità cellulare desiderata (cellule / volume). Cellule nel tessuto semi trasparente cultura trattata con fondo piatto da 96 pozzetti con un serbatoio e pipette multicanale. La densità scelto dovrebbe dare 70-80% di confluenza del giorno di trasfezione. Ad esempio, come mostrato nella Tabella 1, le cellule sono state diluite da 25 a 50 cellule / mL per i dati riportati qui di trasfezione.
2. Cella Transfection
- Diluizione di polimero e delle scorte del DNA. Scongelare polimero e soluzioni madri DNA a temperatura ambiente (RT). Diluire soluzione di polimero e stock soluzione di DNA, separatamente in chiaro piastre a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di dodici canali, Con il solvente appropriato concentrazioni necessarie per ottenere il peso di polimero desiderato rapporto peso DNA (peso / peso). In questo caso, il solvente è scelto di sodio 25 mM tampone acetato (pH = 5,2).
- DNA diluizione. Tipicamente, DNA conservati a 1 mg / ml è diluito in tampone di acetato di sodio ad una concentrazione da 0,03 a 0,06 mg / ml in un chiaro non-tessuto cultura-trattati piastra a 96 pozzetti (un pozzetto per una singola formulazione). Tabella 2 mostra il tipico protocollo di diluizione DNA per una singola formulazione usato per trasfettare quattro pozzi replicati in una piastra a 96 pozzetti seminati con cellule del punto 1.
- Polimero di diluizione. La 100 mg / ml di polimero / DMSO soluzione viene diluita in tampone sodio acetato in funzione della concentrazione necessaria per ottenere il polimero di DNA desiderato peso / peso rapporto. La gamma di peso / peso rapporti tipicamente utilizzati per il trasferimento genico con poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) è di 20 a 100. Polimeri PBAE vengono prima diluito a 10 mg / ml, seguito dalla diluizioneROTOCOLLO come mostrato nella Tabella 3. Le diluizioni polimero può essere eseguita in un chiaro non-trattati coltura tissutale a 96 pozzetti che corrisponde all'orientamento campione della piastra di diluizione DNA.
- Nanoparticelle formazione. Aggiungere la soluzione PBAE ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico utilizzando un dodici canali pipetta e mescolare energicamente. Lasciate che la miscela incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire l'auto-assemblaggio.
- Nanoparticelle trasfezione. Seguendo autoassemblaggio, 20 pl nanoparticelle sono aggiunti per pozzetto al mezzo di coltura a gocce utilizzando il dodici canali pipetta. Replica pozzi sono lasciati non trattati o sono trasfettate con i reagenti disponibili in commercio come controlli. Le cellule trasfettate sono incubate a 37 ° C per 2-4 ore e poi i pozzetti vengono sostituiti con mezzi freschi (100 pl / pozzetto). La scelta del tempo di incubazione dipende dalla linea cellulare, condizioni di coltura, e il sistema di transfezione. La differenza di trasfezioneefficienza e tossicità cellulare a causa del periodo di incubazione variabile sarà quantificato mediante il protocollo di analisi descritto nel passaggio 3.
3. Analisi di efficienza di trasfezione e tossicità cellulare
Efficienza di trasfezione è analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando un citofluorimetro 48 ore dopo la trasfezione. Tossicità cellulare viene analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando la CellTiter 96 acquosa Un dosaggio 24 ore dopo la trasfezione.
- Microscopia a fluorescenza. Analizzare visivamente i pozzetti per l'espressione del gene reporter transfettate (per esempio, EGFP o DsRed) utilizzando il canale appropriato fluorescenza. Acquisire immagini per ogni pozzetto, scegliendo campi di vista che rappresentano adeguatamente l'efficienza di trasfezione per le formulazioni particolari (Figura 1). Prendere nota di qualsiasi tossicità cellulare osservata visivamente.
- Citometria a flusso.
- Utilizzare pipette multicanale per preparare la piastra a 96 pozzetti per la citometria a flusso. Lavare con PBS, Tripsinizzare con 30 pl / pozzetto di tripsina / EDTA, neutralizzare con 170 microlitri tampone FACS (PBS + 2% FBS), pipetta su e giù in ciascun pozzetto, anche intorno ai bordi, e trasferire l'intero 200 microlitri volume ciascun pozzetto in pozzetti in un pallone a fondo o V-bottom piastra a 96 pozzetti.
- Centrifugare la piastra a 130 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere supporti 170 ul cellule da ogni bene e pipetta per risospendere evitando bolle. Per utilizzare una vitalità macchia come ioduro di propidio (PI), aggiungere 10 ml di FACS tampone + PI (50:1 FACS buffer: PI di diluizione, la concentrazione magazzino PI 1 mg / ml) in ciascun pozzetto. Porre immediatamente sul ghiaccio e coprire dalla luce.
- Avviare il flusso C6 Accuri citometro, il HyperCyt 96 pozzetti attaccamento, e il software HyperView. Utilizzare Progettazione HyperView e le schede del protocollo di scegliere il p appropriataTipo di ritardo, il layout piastra, e le altre impostazioni, come shake / SIP / risciacquo / agitare tempo. Per il protocollo di cui sopra, i seguenti parametri sono stati usati, un pre-piastra prime per un minuto, e una pre-piastra agitare per 30 secondi a 2400 rpm. Tempo Sip è stato fissato per 15 sec a 15 giri al minuto, una sonda di risciacquo ogni bene per 2 secondi, e un inter-e agitare ogni 12 pozzi per 12 secondi a 2.400 giri al minuto. L'inter-shake pozzo è importante per mantenere le cellule disperse nei media, nonché per migliorare la capacità di elaborare i dati includendo pause temporizzati tra gruppi di pozzetti (in questo caso 12 sec).
- Utilizzare la scheda di identificazione Beh HyperView per elaborare i dati e separati nel bene appropriato (Figura 2). Al fine di identificare i singoli pozzetti, può aiutare a utilizzare il filtro del rumore del software, così come tra una base anche filtro sotto le impostazioni avanzate.
- Quantificare la percentuale di cellule vive positivamente trasfettate con gating opportuno separare pop diversomentari (Figura 3). In primo luogo visualizzare i dati di flusso su un grafico a dispersione FSC e SSC, al fine di separare le cellule dai detriti (Figura 3A). Se ioduro di propidio (PI) è stato utilizzato, porta la popolazione di cellule individuale e vista che i dati su un terreno FSC vs FL3 in modo da separare le cellule vive da cellule morte e gate di cellule vive. Al fine di quantificare il numero di cellule trasfettate, vedi la popolazione cellulare diretta sui canali appropriati, per esempio, GFP può essere visto in FL1. Utilizzando la popolazione non trattata, porta le cellule non trattate per identificare il segnale di fondo (Figura 3B). Le cellule trasfettate positivamente può quindi essere isolato utilizzando questo cancello e visualizzando le popolazioni trasfettate utilizzando sia dispersione e grafici di contorno (Figura 3C e 3D). Ci può essere un continuum di cellule trasfettate positivamente, come cellule diverse saranno transfettate a diversi gradi di fluorescenza.
- CellTiter 96 acquosa Un saggio
- Transfettare un'altra piastra esattamente nello stesso modo per misurazioni tossicità cellulare.
- Premix 1 ml di CellTiter 96 Una soluzione acquosa di test con 10 ml supporti freschi. Rimuovere i supporti dalle cellule e utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 110 microlitri della soluzione premiscelata + supporto per pozzetto.
- Misurare l'assorbanza a 490 nm ogni intervallo ore 1-4 ore finché la assorbanza dal pozzo con condizione non trattata è nel range lineare del saggio. Include quattro pozzi di controllo con i media solo + soluzione per una lettura assorbanza di fondo.
- Valori medi l'assorbanza delle quattro pozzi replicati per condizione e sottrarre l'assorbanza di fondo media da ogni media. Normalizza la media corretta per ogni condizione trattata alla media corretta della condizione non trattata per determinare la vitalità cellulare per cento.
- Primo il sistema fluidica del NS500 NanoSight eseguendo la pompa diluente in avanti a circa 1/5th la massima velocità e la pompa di campionamento indietro a circa 1/10th la velocità massima. Continuare fino a quando il sistema fluidico è lavata con diluente.
- Preparare le nanoparticelle da analizzare. Nel caso di PBAEs, separatamente diluire il DNA plasmidico magazzino (1 mg / ml) e PBAE magazzino (100 mg / ml) in tampone sodio acetato (25 mM, pH 5) in provette Eppendorf.
- Diluire la concentrazione di DNA plasmidico a 0,06 mg / ml. Concentrazione del polimero può variare a seconda del desiderato rapporto peso-peso di polimero DNA (ad esempio, per 60 peso / peso di particelle, polimero viene diluito a 3,6 mg / ml).
- Aggiungere la soluzione di polimero ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico e mescolare vigorosamente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti per permettere l'auto-assemblaggio.
- Diliuto la soluzione di nanoparticelle 100 volte in PBS affinché la concentrazione nanoparticelle di essere nel range appropriato per NTA e per ottenere un volume finale di almeno 500 microlitri.
- Caricare il campione nella Nanosight ponendo la provetta caricamento nel campione provetta Eppendorf (Figura 4A). Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria.
- In modalità di cattura, aumentare il livello di fotocamera finché le particelle non può essere visto. Regolare il fuoco in modo che le particelle guardare liscia (Figura 4A e 4B).
- In modalità standard, regolare il livello di fotocamera oltre il punto che tutte le particelle possono essere visti sullo schermo. Quindi diminuire il livello fotocamera al livello più basso in modo tale che le particelle possono ancora essere osservati. Se un livello intermedio fotocamera è necessario, andare in modalità avanzata e modificare l'otturatore della fotocamera e ottenere ai livelli appropriati.
- Controllare visivamente per assicurarsi che non ci sono fra 20 - 100 particelle sul screen. Un numero ideale per il monitoraggio delle nanoparticelle è di circa 50 particelle. Se ci sono troppi o troppo pochi, lavare l'NS500, regolare la diluizione in PBS, e ri-caricare il campione.
- Regolare la durata di acquisizione in base alla tabella delle modalità standard. Tipicamente 30 - 60 sec è una lunghezza di cattura appropriata (Figura 4B).
- Per caricare il campione successivo, lavare l'impianto, poi ri-caricare il nuovo campione.
- Una volta che i video vengono catturati, procedere alla fase di elaborazione con l'apertura di un file video.
- Ci sono un certo numero di parametri che possono essere sintonizzati per elaborare meglio un video (Figura 4C). L'obiettivo è quello di selezionare parametri che meglio catturare ogni particella sullo schermo, come indicato da un segno di croce rossa sullo schermo per ogni particella (Figura 5).
- Aumentare il guadagno dello schermo per vedere meglio le particelle. In modalità standard o avanzata, selezionare la regolazione automatica per i parametri da clicking le caselle appropriate. Nel caso che le impostazioni auto non adeguatamente selezionare particelle, deseleziona la casella e impostare manualmente i parametri (Figura 4C).
- Una volta che tutte le particelle vengono raccolte sullo schermo, fare clic sul pulsante processo del software per elaborare il file video (Figura 4C). Questo fornisce la distribuzione della dimensione delle particelle, medie dimensioni, così come la concentrazione di particelle.
- Al fine di assicurarsi che la concentrazione di particelle è accurata, modificare la diluizione PBS, ad esempio aumentando la diluizione di 2x, e ripetere la procedura precedente. Misurazione diluizioni multiple dello stesso campione è raccomandata per assicurare che la misura della concentrazione del campione è accurato. Una buona gamma per la misura è 10 7 -10 9 particelle / ml.
- Verificare che tutti i plasmidi sono incorporati in nanoparticelle eseguendo elettroforesi su gel delle nanoparticelle e valutare se un DNA libero è presente.Se non tutti i plasmidi sono incapsulati, utilizzare tecniche standard per misurare l'assorbanza DNA per quantificare totale plasmidi incapsulati.
- Per calcolare il numero medio di plasmidi per particella, dividere la concentrazione totale incapsulato plasmide dalla concentrazione di particelle misurata NTA. Per stimare il plasmide per la distribuzione di particelle campione, prima usare l'istogramma delle particelle NTA dimensioni per calcolare la frazione di volume di 1-nm ciascun bin di particelle. Moltiplicate questa distribuzione frazione di volume per l'importo totale plasmide per ottenere il numero di plasmidi in ogni bin. Dividere questi numeri per il numero di particelle in ciascun bin di ottenere il numero di plasmidi-per-particelle per ogni dimensione delle particelle (Figura 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 mostra una immagine di fluorescenza microscopia di un esempio di trasfezione successo HRECs con il plasmide EGFP. L'immagine brightfield è utile per garantire che le cellule mantengono la loro morfologia normale. Inoltre, saggi di vitalità cellulare, come saggi MTS o simili, può essere utilizzato per valutare la tossicità delle nanoparticelle 7. Citometria a flusso, come descritto, può essere usato per quantificare l'efficienza di trasfezione. Quando si utilizza il HyperCyt multi-pozzetto attacco a piastra, i dati dovranno essere trattati in modo idoneo per identificare correttamente i pozzetti. Come si può vedere nel pannello di destra della figura 2, quando i conteggi cellulari sono buoni (migliaia di cellule per pozzetto), e le fluidica corretto funzionamento, i singoli pozzetti sono più facili da individuare sia manualmente dal software. Tuttavia, se i conteggi di cella sono troppo bassi o c'è un problema con i fluidica, diventa molto più difficile individuare l'indiviUAL pozzetti (di sinistra di figura 2), e l'esperimento deve probabilmente essere ripetuto. Sostituzione del tubo del Hypercyt può spesso risolvere i problemi con il flusso del campione. Una volta che i singoli dati così ottenuti vengono, più comune software citometria di flusso può essere utilizzato per analizzare i file esportati. FCS. In figura 3, viene utilizzato per FlowJo cancello le cellule trasfettate confrontando positivamente ai pozzetti non trattate.
Le nanoparticelle PBAE sono solitamente tra 100 - 200 nm di dimensione misurata dal NTA Nanosight. Quando si esegue NTA, è importante che il numero di nanoparticelle sullo schermo compresa tra 20 -. 100 in modo che il software sarà in grado di monitorare con precisione le particelle Figura 5A è un esempio di troppe particelle, mentre la Figura 5B mostra un esempio di un numero appropriato. Elaborazione del video catturato deve essere fatto in modo tale che le particelle osservate su schermo vengono prelevati dal softwar e, rappresentato con i capelli rossi croce. Un esempio di quando la soglia per aspirare particelle troppo bassa può essere visto in Figura 5C, mentre un esempio di un livello di soglia è meglio visibile nella figura 5D. Una diversa diluizione del campione può essere eseguita per assicurarsi che il campione è nell'intervallo di concentrazione corretto. La concentrazione di particelle nuova proposta dal NanoSight deve corrispondere la nuova diluizione. Una volta che la dimensione e la concentrazione di particelle sono ottenuti, la media delle particelle per plasmide e distribuzione può essere calcolato. Risultati di esempio può essere visto in Figura 6. La timeline sperimentale è mostrato in Figura 7.
| Wells / piastra | Volume / Benessere (pl) | Cellule / pozzetto |
| 96 | 100 | 2.500 a 5.000 |
| Wells / piastra | Volume / Benessere (pl) | Particelle Volume / Benessere (pl) | DNA / Well (mg) | DNA (pg / pl) | DNA 1 pg / pl magazzino (pl) | NaAc (pl) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabella 2. Tipico protocollo di diluizione DNA per un formato a 96 pozzetti piastra.
| Polymer: DNA (peso / peso) | Particelle Volume / Benessere (pl) | Replica # Wells | DNA / Benessere(Mg) | Polimero / Well (mg) | Polimero / 10 pg / pl magazzino (pl) | NaAc (pl) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Tabella 3. Tipica polimero protocollo di diluizione per un formato a 96 pozzetti piastra.
Figura1. Singolo canale di immagini a colori di fluorescenza di HRECs trasfettate con PBAE (Sinistra) GFP fluorescenza, colore verde,. (Centro) immagine Campo chiaro, (a destra) immagine composita.
Figura 2. Software Hypercyt ben fase di identificazione dopo che i dati raccolti (sinistra) Esempio di dati problematici causati da un numero basso o problema con la fluidica,.. (Destra) Esempio di dati puliti, con pozzi facilmente identificabili Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Gating FlowJo per le cellule trasfettate con il plasmide EGFP (A) FSC e SSC per le cellule non trattate,. (B) FL1 vs FL3 per ucellule ntreated, (C, D) FL1 vs FL3 per cellule transfettate con PBAE. Sia pseudo-colore densità (C) e (D) i grafici di contorno sono utili per determinare la posizione di disegnare cancelli.
Figura 4. Cattura schermo di parti del NanoSight software di analisi delle nanoparticelle di monitoraggio, versione 2.2 (A) Il controllo fluidica,. (B) modalità di ripresa, utilizzate per catturare video delle nanoparticelle, (C) modalità di elaborazione disponibili dopo l'apertura di un video precedentemente catturato. Scatole rosse di evidenziazione funzioni descritte nel protocollo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. . Esempio di cattura video e analisi NanoSight Screenshots di campione prima di acquisizione video per il campione che non è diluito abbastanza (A), e con diluizione adeguata (B); Screenshots di modalità di analisi con soglia di rilevamento delle particelle troppo basso (C) e impostare in modo appropriato (D), con il rosso mirino identificare tutte le particelle in modo appropriato. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Distribuzione delle dimensioni e plasmidi per i dati delle particelle di distribuzione di PBAE (B5S3E7, 60:1 polimero DNA p / p) a base di nanoparticelle analizzati utilizzando il monitoraggio delle tecniche di analisi NanoSight. Ristampato da Piccolo [14], 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J., e Green, JJ Un nuovo metodo di analisi per quantificare il numero di plasmidi incapsulate in nanoparticelle polimeriche, 367-373, Copyright 2012, con il permesso da Wiley-VCH. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 7. Linea temporale sperimentale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I protocolli sopra descrivono metodi di valutazione dell'efficacia trasfezione di formulazioni di nanoparticelle, così come un modo per caratterizzare la dimensione delle particelle e caricamento DNA delle nanoparticelle. Il numero di plasmidi per particella è un parametro importante che può aiutare a prevedere l'efficacia della particella e può essere utilizzato anche per la determinazione della dose. Monitoraggio analisi delle nanoparticelle può essere eseguita in una gamma di differenti soluzioni acquose, come quelli che differiscono nella concentrazione salina. Spesso questa caratterizzazione viene eseguita in PBS, per imitare salina fisiologica. Mentre dimensionamento in PBS può fornire una buona stima della dimensione delle nanoparticelle in media o soluzione fisiologica, la quantità di siero presente può influenzare le dimensioni e la stabilità delle nanoparticelle 17. Pertanto, la caratterizzazione delle particelle in varie concentrazioni di siero può essere importante per alcune applicazioni come bene. Al fine di caratterizzare le particelle nel siero, un supplepasso nale è raccomandato a causa della dispersione di fondo di proteine del siero. In questo caso, le particelle devono essere etichettato fluorescente, in modo che attraverso l'uso del filtro fluorescenza, le particelle possono essere specificamente monitorati distintamente da proteine del siero.
La quantificazione plasmide particella per è generale sufficiente per essere utilizzato con formulazioni di nanoparticelle diversi, tra altri sistemi particolati polimerici o inorganico. A causa del diverso comportamento diffusione di luce di diversi materiali, la cattura video e parametri di lavorazione può essere necessario modificare. Inoltre, la sensibilità del NTA può cambiare a seconda del materiale. Il protocollo plasmide particella per sopra descritto è un metodo rapido e utile per caratterizzare nanoparticelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori riportano alcun conflitto di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 per il supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
