Summary
I denne protokol vi vise, hvordan man tilstand udnyttes honningbier til taktile stimuli og indføre en 2D motion capture teknik til at analysere kinematik finskala-antennal sampling mønster.
Abstract
Honningbier (Apis mellifera L.) er eusocial insekter og kendt for deres komplekse arbejdsdeling og associativ læring kapacitet 1, 2. De bier tilbringer den første halvdel af deres liv inde i mørke hive, hvor de ammer larverne eller bygge den almindelige sekskantede kamme til fødevarer (f.eks pollen eller nektar) og ruge 3. Antennerne er ekstraordinære multisensoriske følehorn og spiller en afgørende rolle i forskellige taktile medierede opgaver 4, herunder hive bygning 5 og mønstergenkendelse 6. Senere i livet, hver enkelt bi forlader bistade til foder til fødevarer. Så en bi skal lære at skelne rentable fødekilder, huske deres placering, og meddeler den til sin Rede hjælpere 7. Bier bruger forskellige blomster signaler som farver eller lugte 7, 8, men også taktile køer fra den kronblad overflade 9 for at danne multisensoriske minder fra fødekilde. Under laboratoriesamarbejdeld, kan bierne blive oplært i en appetitive læringsparadigme at diskriminere taktile objekt funktioner, såsom kanter eller riller med deres antenner 10, 11, 12, 13. Dette indlæringsparadigme er nært beslægtet med den klassiske olfaktoriske konditionering af proboscis forlængelse respons (PER) i spændte bier 14. Fordelen ved den taktile læring i laboratoriet, er muligheden for at kombinere adfærdsmæssige forsøg på læring med forskellige fysiologiske målinger, herunder analyse af antennal bevægelsesmønster.
Protocol
1. Forberedelse af bier
- Nektar eller Pollen grøntmaskiner er fanget i området enten fra en sucrose feeder eller direkte fra bikuben indgangen på vej hjem fra en fouragering tur. Hver enkelt bi er fanget i et glas hætteglas, der er lukket med en skum stik og indtages straks ind i laboratoriet for videre håndtering.
- I laboratoriet er de indfangede bier kortvarigt afkølet i køleskabet ved 4 ° C indtil de viser første tegn på immobilitet.
- Hver enkelt immobiliseret bi er monteret i en lille metalrør med tape, mellem hoved og thorax og over maven. Skal sørges for, at snabel og antenner er frit bevægelige.
- Mal de sammensatte øjne og ocelli af den faste bi med hvid maling (f.eks fri for opløsningsmidler Tipp-Ex) at okkludere vision.
- Tilføj en lille dråbe smeltet voks bag hovedet af bi til at ordne det på båndet mellem hoved og brystkasse for at forhindre hoved bevægelser under optagelser.
- Mark hver enkelt bi med et nummer på båndet for bedre identifikation og placer røret med det faste bi ind i en fugtig atmosfære for at undgå dehydrering.
- Foder hver enkelt bi i 5 sekunder med dråber af en 30% sucroseopløsning præsenteret med en sprøjte og lade alle bier komme sig i 30 min før start med den taktile conditioning protokollen.
2. Tactile Conditioning
- Før konditionering, har hver enkelt bi skal testes for proboscis forlængelse respons (PER) til en 30% sucrose stimulus påført på antenner. Hvorved spidsen af proboscis skal krydse en lige linje mellem de åbnede kæberne. Kassér alle bier, der ikke reagerer med en PER til saccharose stimulus.
- For taktil conditioning anvende en messing cube (fx 3 x 5 mm) med en glat eller en indgraveret mønster, fx vandret eller lodret riller danner et gitter med 150 um bølgelængde, som betinget stimulus (CS). Feller ubetinget stimulus (US) anvender en 30% saccharoseopløsning (husholdnings sukker, fortyndet i vand).
- Messing cube (CS) er placeret i en holder på en mikromanipulator (f.eks Märzhäuser MM33) for at sikre nøjagtig positionering under emballeringen procedure. USA præsenteres for bi med en sprøjte fyldt med en 30% sucroseopløsning.
- The conditioning procedure består af fem bindinger af den taktile stimulus (CS) og sucroseopløsning (US) med en inter-trial interval (ITI) på 5 min. Placer et enkelt bi foran mikromanipulator med monteret taktile stimulus (CS). Placer CS langsomt, således at overfladen af det taktile stimuli er parallel med hovedet af bi (figur 1 A og B). Afstanden mellem dyret og den taktile objektet skal være i området fra den antennal arbejdsradius af den testede bi, dvs bi bør være i stand til at scanne de taktile stimuli i en behagelig position wed begge antenner. I eksemplet vist i figur 1, var afstanden 3 mm. Lad bi scanne taktile stimulus (CS) i 5 sek. Efter den første 3 sekunder, udgør en dråbe af 30% saccharose (US) opløsning med en sprøjte under proboscis. Brug spidsen af sprøjten til forsigtigt at hæve snabel. Saccharose stimulation under snabel vil fremkalde det ubetingede PER 15. Lad bi at slikke saccharose belønning. Anvende et stopur med et alarmsignal for at opretholde den nøjagtige tidsintervaller under konditionering.
- Det konditionerede PER bruges som et mål for læring succes en bi. Efter de første belønnet bindinger, begynder bierne at reagere på CS præsentation ved forlængelse af deres snabel, hvilket indikerer, at de forventer, den kommende belønning. En fuldt udstrakt snabel observeret når som helst i løbet af 3 sek tidsvindue af taktil stimulus præsentation og før saccharose præsentationen er scoret som et positivt svar. Ingen reaktion tælles negativ. OCCurrence af PER skal bemærkes af eksperimentatoren. Den procentdel af bier viser PER under CS præsentation er plottet for hvert forsøg.
3. Kinematisk Recordings
- Antennal bevægelser af en enkelt udnyttes bi registreres med et digitalt videokamera med en egnet makroobjektiv (f.eks Basler A602f-2 udstyret med TechSpec VZM 200, drevet ved 50 fps via en brand wire forbindelse). Kameraet er anbragt over dyret i en oppefra (fig. 1 A). I figur 1 er den rumlige opløsning af optagelserne 0,02 mm / pixel.
- Kalibrere kameraet ved at registrere enkelte billeder af en 10 x 10 mm skakternet med en kantlængde på 1 mm fra forskellige orienteringer under kameraet målet. Kalibreringen kan udføres med kameraet kalibrering værktøjskassen Matlab 16.
- Placer et enkelt fast bi under kameralinsen. Præsenter taktile stimulus, fastgjort til en mikromanipulator, Til dyret. Fortsæt på samme måde som beskrevet for taktil conditioning, og optage antennal bevægelse, mens bi scanner objektet. Det er vigtigt, at hele antennal arbejdsområde og den taktile stimuli er synlige. De valg af stimulus mønstre testet og forsøg tal afhænger af det eksperimentelle design.
4. Dataanalyse
- Beregningen af billedet baggrunden er gjort i Matlab. Først den mediane gråtoner værdi over tid skal beregnes for hver pixel. Statiske objekter, ligesom den faste leder af bi og den taktile stimulus, udgøre vil billedet baggrunden. Bevægelige objekter, ligesom de to antenner, vil ikke være en del af baggrunden.
- Hver ramme af optagne video skal indlæses sekventielt, og forskellen mellem den aktuelle ramme og billedbaggrunden skal beregnes. Resultatet af denne subtraktion fremhæver de dele af billedet, der bevæger sig fra ramme til ramme. Ideally, antennerne af bi er de eneste områder af ikke-nul-værdier (figur 1C).
- Til yderligere behandling, er de to største områder med nul pixel-værdier antages at være antenner. For begge antenner en binær maske skal genereres der for hvert pixel et værdien 1, hvis pixelen hører til antennen og værdien 0 ellers. Denne maske tjener som grundlag for at lokalisere de antennal tip senere. For at få en foreløbig maske for hele billedet for grå-værdien for hvert punkt af forskellen billedet sammenlignes med en foruddefineret tærskelværdi. Da vi sørger for støj senere denne tærskel vælges til at være ganske lav. Den foreløbige maske så stadig bærer to slags fejl: For det første på grund af billedstøj små regioner er stadig en del af masken. For det andet kunne områder, der hører til antennen ikke nødvendigvis at være helt tilsluttet. Sidstnævnte sker især, hvis baggrunden har omtrent samme luminescens som antenne. For at fjerne disse artefakter, standardbilledbehandling morfologisk operation anvendes, dvs en kombination af billedet erosion og dilatation, at forlade sig på de almindelige Matlab funktioner imerode og imdilate henholdsvis (se 17 pp. 158-205 for yderligere forklaring). Efter denoising fremgangsmåde til antenner hypoteser er stadig i den samme maske. Derfor, som et næste skridt den binære maske er grupperet for disjunkte områder ved hjælp af standard Matlab funktionen bwlabel (se 17 pp. 40-48 for yderligere detaljer om billedet segmentering algoritme).
- Antallet af pixels pr klynge tælles, og de to største klynger er valgt. Tyngdepunktet er beregnet til at skelne mellem venstre og højre antenne (figur 1D).
- Den antennal spids for hver antenne kan defineres som den pixel i en klynge med den højeste værdi i retningen proximal-til-distal retning (se figur 1 D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det følgende eksperiment vi undersøgt, hvordan taktil læring påvirker antennal sampling adfærd i honningbier. Til dette overvåges vi bevægelsen af antennal spids hos naive og konditioneret bier før og under præsentation af en taktil stimuli.
Først blev den spontane antennal bevægelse af en gruppe af pollen grøntmaskiner (N = 42) optaget i 1 min. Halvdelen af bierne (N = 21) blev derefter konditioneret ved parring fem gange en taktil stimulering med en 30% saccharose belønning. Dette var konditioneret gruppe. Den taktile stimuli var 30 x 50 mm overflade af en messing terning med en graveret vandret rist (λ = 150 um). Den anden halvdel af bierne (N = 21) blev ikke konditioneret og brugt som en naiv gruppe. Figur 2 viser den gennemsnitlige indlæringskurven af den konditionerede gruppe bier. Procentdelen af konditioneret PER efter den første belønning er signifikant forskellig fra spontan adfærd (Figur 2 rd belønning.
Derefter bevægelsen af antennal spids i både betingede og det naive gruppe blev optaget igen i 1 min i nærvær af den taktile stimuli Figur 3 A 1 -. B 2 viser fordelingen af antennal tip steder i begge grupper, før og under præsentation Den taktile objekt. Både den naive og det konditionerede gruppen ændret deres antennal bevægelsesmønster i nærvær af en taktil stimulering sammenlignet med spontan adfærd. Sandsynligheden for antennal tip til eftersøgning og / eller prøve det område af stimulus er steget betydeligt, hvis stimulus var til stede, viser, at taktil prøveudtagning indebærer en markant ændring i den antennal bevægelsesmønster i forhold til spontan antennal bevægelse. Dette gælder for begge grupper af bier (Figur 3 C 1 og C
Sammenfattende, at resultaterne fra dette forsøg viser honningbier kan trænes meget effektivt at reagere på en taktil stimuli, og at taktil læring ledsages af øget akve søge og prøveudtagning adfærd.
. Figur 1 Video optagelse og antennal sporing procedure A:. Oppefra af en fast bi og den taktile stimuli. Den taktile stimulus er placeret i forreste del af hovedet af den faste bi med tilstoppede øjne. Det er placeret inden for antennal arbejds-range. d-og p angiver distale og proximale placering i forhold til dyret B:. set fra siden den samme bi og den taktile stimuli. Overfladen af den taktile stimuli og lederen af bi (blå stiplede linjer) er parallelle med hinanden C:. Kollienes bevægelige pixels fra statiske pixels i en videosekvens. Ved at trække hvert billede fra en baggrund model muliggør identifikation af de bevægelige dele, dvs enntennae. Den faste leder af bi og den taktile stimulus (angives her som røde stiplede linjer) er statiske og ikke synlige efter subtraktion D:. Definition venstre og højre og antennal spids. De to største pixel klynger efter subtraktion er identificeret som antenner. Beregning af tyngdepunktet tillader at skelne mellem venstre (rød) og højre (grøn) antenne. Den antennal spids for hver antenne (sorte kors) kan defineres som den pixel i en klynge med den største værdi i den distale retning.
Figur 2. Learning kurve af taktil PER conditioning. Pollen grøntmaskiner blev uddannet med fem parringer i CS (taktile stimuli) og USA (rørsukkeropløsning) med en inter-trial interval på 5 min. Procentdelen af positive svar på 21 dyr er afbildet for spontan adfærd (Spont) og during præsentation af CS efter hver konditionering forsøg. Procentdelen af PER observeret efter den første og alle følgende belønninger adskiller sig væsentligt fra den spontane adfærd (Fisher eksakte sandsynlighedstest, p <0,001).
Figur 3. Normaliserede gennemsnitlige fordelinger af antennal spids lokation i en periode på 1 min. Den antennal spids fordeling af bien blev normaliseret til det totale antal datapunkter pr dyr. Panelerne viser resultater fra naive (venstre, N = 21) og konditionerede bier (højre, N = 21) før (A) og under stimulus præsentation (B) A 1 og A 2:. Spontan antennal bevægelse inden stimulus præsentation. Abscissen viser den laterale stilling af antennal spids i forhold til the midten af hovedet (sammenlign med figur 1C og D). Ordinaten viser den distale position af antennal spids. Farveskalaen angiver procentdelen af tid, som antennal spids brugt på en given placering. Optagelsen periode på 1 minut var ækvivalent med 3000 videorammer B 1 og B2:. Samme som i en 1,2, men under stimulus præsentation C1 og C2:. Gennemsnitlig antal rammer, hvor antennal spids blev placeret inde det objektområde, dvs ± 3 bins distale eller proximale forhold til stimulus overflade. C1: naive gruppe, C2: conditioned gruppe. De box-knurhår plots viser median, betyde, kvartiler, og 5-95% percentil intervaller af antallet af billeder per minut. I begge grupper af bier, er der en væsentlig forskel mellem "ingen stimulus '(A) og' med stimulus '(B, C, Wilcoxon signed-rank test, C 1: P = 5,39 * 10 -4; C 2 -5). Det gennemsnitlige antal billeder med taktil stimulus præsentation er betydeligt større i konditionerede bier end hos naive bier (Mann-Whitney U test, C 1 - C 2: P = 0,007). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forberedelse af bierne: Indsamling og fastsættelse af bier bør ske hurtigt, for at holde stress niveauet af dyret lav. Stress har en effekt på den PER-responsivitet, og derfor kunne have en indirekte effekt på indlæring i bier 19, 20. Stress niveau kan nedsættes ved at placere hætteglas med bierne direkte på is umiddelbart efter opsamlingen at immobilisere dem hurtigt. Det skal tages i betragtning, at bier har brug for mere tid til at komme, jo længere anæstesi periode er før.
Vision har en negativ effekt på taktil læring i bier 18. Derfor er det vigtigt at okkludere syn ved at male øjnene på dyret. For at øge den visuelle kontrast af videooptagelser, anbefales det at bruge hvid maling (f.eks Tipp-Ex). Der skal udvises omhu for ikke at få antenner i kontakt med malingen.
LærING ydeevne: Tidligere undersøgelser i laboratoriet og i marken viste, at sucrose følsomhed i honningbi grøntmaskiner påvirker deres associative indlæringsevne 21, 22. Høj saccharose følsomhed er positivt korreleret med bedre taktil erhvervelse og diskrimination forestillinger. Pollen grøntmaskiner af en honningbi koloni i gennemsnit er mere lydhøre over for sucrose end nektar grøntmaskiner i de fleste uger af en fouragering sæson 23. De kan let identificeres af de pollen belastninger på deres bagben og fanget på bikuben indgangen. Nectar grøntmaskiner med høj sucrose følsomhed kan fanges ved slutningen af en fouragering sæson, mellem september og oktober. De kan vælges på kunstige foderautomater fyldt med lav-koncentreret sukker vand placeret ca 20 m væk fra bikuben 23.
Den lærende ydeevne og hukommelse dannelse afhænger stærkt af det mættelse status af en bi under konditioneringen 25. En længere sult period før konditionering, f.eks natten kan forbedre associativ indlæring adfærd og øge motivationen i et dyr.
Taktil conditioning: Den PER anvendes som det ubetingede respons i en appetitive læring protokol 14. Derfor er det afgørende, at alle testede bier viser en fuldt udvidet PER til det ubetingede stimulus (sukker stimulus) før conditioning. Bier, der ikke reagerer på sukker stimulus skal kasseres, samt bier, der reagerer med en PER under antennal kontakt med den taktile stimuli før conditioning. Ellers vil den ekstremt lave eller meget høj reaktionsevne disse dyr forvirre indlæringskurven.
Den taktile stimulus, der anvendes i denne protokol (messing terning med vandrette gitre) blev tilfældigt udvalgt. Honning bier kan også betinget af forskellige taktile stimuli med forskellige former og teksturer (se 10).
At sammenligne købet i forskellige grupper af bier (f.eks Pollen-versus Nectar grøntmaskiner), kan en erhvervelse score beregnes 21. Dette resultat er det samlede antal betingede reaktioner på CS, og det har et område mellem 0 (ingen konditioneret PER) og 5 (konditioneret PER efter hver konditionering forsøg).
Video analyse: Forskellige video analyser metoder blev anvendt i fortiden for at kvantificere ændringer i antennal bevægelse adfærd i honningbier 26, 27. Vores metode har den fordel, at analysere de antennal bevægelser uden at kræve reflekterende markører på antenner og ydelser fra forskellige billedbehandling værktøjer i Matlab. Som et eksempel kan man også analysere timingen af antennal kontakter i retning af et objekt, bestemme hastigheden af antennal bevægelse, beregner vinkelpositionerne af antennerne i forhold til kroppen akser eller diskriminere mellem venstre og højre antennal bevægelse.
En PER, der opstår under optagelse af antennal reaktion på objektet i konditionerede bier kan forstyrre senere med den automatiske detektering af antenner. I dette tilfælde er det nødvendigt at redigere filmen, fx i VirtualDub, og at maskere det objekt, der interfererer med påvisningsprocessen, fx ved at dække den sektion, hvor proboscis vises med et gråt lag af den samme form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Joachim Erber for at indføre os til den taktile læring i honningbier. Dette arbejde blev støttet af Cluster of Excellence 277 CITEC, finansieret inden for rammerne af det tyske Exzellenzinitiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
- Page, R. E., Scheiner, R., Erber, J., Amdam, G. V. The development and evolution of division of labor and foraging specialization in a social insect (Apis mellifera L.). Curr. Top. Dev. Biol. 74, 253-286 (2006).
- Menzel, R., Müller, U. Learning and memory in honeybees: From behavior to neural substrates. Annu. Rev. Neurosci. 19, 379-404 (1996).
- Seeley, T. D. The wisdom of the hive. , Harvard University Press. Cambridge Mass, London. (1995).
- Staudacher, E., Gebhardt, M. J., Dürr, V. Antennal movements and mechanoreception: neurobiology of active tactile sensors. Adv. Insect Physiol. 32, 49-205 (2005).
- Martin, H., Lindauer, M. Sinnesphysiologische Leistungen beim Wabenbau der Honigbiene. Z. Vergl. Physiol. 53, 372-404 (1966).
- Kevan, P. G. Texture sensitivity in the life of honeybees. Neurobiology and behavior of honeybees. Menzel, R., Mercer, A. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. 96-101 (1987).
- von Frisch, K. Tanzsprache und Orientierung der Bienen. , Springer Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. (1965).
- Waser, N. M. Flower constancy: definition, cause, and ceasurement. Am. Nat. 127, 593-603 (1986).
- Kevan, P. G., Lane, M. A. Flower petal microtexture is a tactile cue for bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 4750-4752 (1985).
- Erber, J., Kierzek, S., Sander, E., Grandy, K. Tactile learning in the honeybee. J. Comp. Physiol. A. 183, 737-744 (1998).
- Kisch, J., Erber, J. Operant conditioning of antennal movements in the honey bee. Behav. Brain. Res. 99, 93-102 (1999).
- Scheiner, R., Erber, J., Page, R. E. Tactile learning and the individual evaluation of the reward in honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 185, 1-10 (1999).
- Erber, J., Scheiner, R. Honeybee learning. Encyclopedia of Neuroscience. Adelman, G., Smith, B. , Elsevier. (2004).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97, 107-119 (1983).
- Dacher, M., Gauthier, M. Involvement of NO-synthase and nicotinic receptors in learning in the honey bee. Physiol. Behav. 95, 200-207 (2008).
- Camera Calibration Toolbox for Matlab [Internet]. , Available from: http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc (2004).
- Haralick, R. M., Shapiro, L. G. Computer and Robot Vision. I, Addison-Wesley. Reading, Mass. (1992).
- Erber, J. Tactile antennal learning in the honey bee. Honeybee Neurobiology and Behavior. Galizia, C. G., et al. , Springer Verlag. 439-455 (2012).
- Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 189, 675-684 (2003).
- Harris, J. W., Woodring, J. Effects of stress, age, season and source colony on levels of octopamine, dopamine and serotonine in the honey bee (Apis mellifera L.) brain. J. Insect. Physiol. 38, 29-35 (1992).
- Scheiner, R., Kuritz-Kaiser, A., Menzel, R., Erber, J. Sensory responsiveness and the effects of equal subjective rewards on tactile learning and memory of honeybees. Learn. Mem. 12, 626-635 (2005).
- Mujagic, S., Sarkander, J., Erber, B., Erber, J. Sucrose acceptance and different forms of associative learning of the honey bee (Apis mellifera L.) in the field and laboratory. Front. Behav. Neurosci. 4, 46 (2010).
- Scheiner, R., Barnert, M., Erber, J. Variation in water and sucrose responsiveness during the foraging season affects proboscis extension learning in honey bees. Apidologie. 34, 67-72 (2003).
- Mujagic, S., Erber, J. Sucrose acceptance, discrimination and proboscis responses of honey bees (Apis mellifera L.) in the field and the laboratory. J. Comp. Physiol. A. 195, 325-339 (2009).
- Friedrich, A., Thomas, U., Müller, U. Learning at different satiation levels reveals parallel functions for the cAMP-protein kinase A cascade in formation of long-term memory. J. Neurosci. 24, 4460-4468 (2004).
- Erber, J., Pribbenow, B., Grandy, K., Kierzek, S. Tactile motor learning in the antennal system of the honeybee (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. 181, 355-365 (1997).
- Lambin, M., Déglise, P., Gauthier, M. Antennal movements as indicators of odor detection by worker honeybees. Apidologie. 36, 119-126 (2005).
