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Neuroscience

Tactile Conditioning und Bewegungsanalyse der antennalen Sampling Strategies In Honey Bees ( Published: December 12, 2012 doi: 10.3791/50179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biological Cybernetics, CITEC - Cognitive Interaction Technology - Center of Excellence, Bielefeld University

Summary

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Bedingung Honigbienen auf taktile Reize genutzt und die Einführung einer 2D-Motion-Capture-Technik zur Analyse der Kinematik feinskaligen antennalen Abtastmuster.

Abstract

Honigbienen (Apis mellifera L.) sind eusocial Insekten und bekannt für ihre komplexen Arbeitsteilung und assoziative Lernfähigkeit 1, 2 bekannt. Die Arbeitsbienen verbringen die erste Hälfte ihres Lebens in den dunklen Bienenstock, wo sie Pflege der Larven oder den Bau der regelmäßigen sechseckigen Waben für Lebensmittel (zB Pollen oder Nektar) und Brut 3. Die Antennen sind außergewöhnlich multisensorische Fühlern und spielen eine entscheidende Rolle in verschiedenen taktilen vermittelten Aufgaben 4, einschließlich hive Gebäude 5 und Mustererkennung 6. Später im Leben hinterlässt jedes einzelne Biene den Stock, um nach Nahrung zu suchen. Dann eine Biene muss lernen, profitable Nahrungsquellen zu diskriminieren, zu speichern ihre Lage und kommunizieren sie ihre Nestgefährten 7. Bienen verwenden verschiedene florale Signale wie Farben oder Gerüche 7, 8, sondern auch taktile Hinweise aus der petal Oberfläche 9 bis multisensorische Erinnerungen an die Nahrungsquelle zu bilden. Unter Laborbedingungen conditions, können Bienen in einem appetitive Lernparadigma geschult werden, um taktile Objekteigenschaften, wie Kanten oder Rillen mit ihren Antennen 10, 11, 12, 13 unterscheiden. Diese Lernparadigma ist eng mit dem klassischen olfaktorischen Konditionierung des Rüssels Verlängerung Reaktion (PER) in angeschirrt Bienen 14 verbunden. Der Vorteil der taktilen Lernparadigma im Labor ist die Möglichkeit der Kombination Verhaltensexperimente auf das Lernen mit verschiedenen physiologischen Messungen, einschließlich der Analyse der antennalen Bewegungsmuster.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Bienen

  1. Nektar oder Pollen Sammlerinnen im Feld entweder aus einer Saccharose Feeder oder direkt aus dem Flugloch gefangen, während der Rückkehr von einem Nahrungssuche Reise. Jede einzelne Biene wird in einen Glaskolben, der mit einem Schaum-Stopfen verschlossen ist und unmittelbar in das Labor für die weitere Handhabung getroffen eingefangen.
  2. Im Labor werden die aufgenommenen Bienen kurz im Kühlschrank bei 4 ° C abgekühlt, bis sie erste Anzeichen von Immobilität zu zeigen.
  3. Jede einzelne Biene immobilisiert ist in einem kleinen Metallrohres mit einem Klebestreifen zwischen Kopf und Thorax und über den Bauch befestigt. Es sollte darauf geachtet, dass der Rüssel und Antennen frei beweglich sind.
  4. Malen Sie die Facettenaugen und Augenflecken der festen Biene mit weißer Farbe (zB lösemittelfreie Tipp-Ex) zur Vision zu verschließen.
  5. Fügen Sie einen kleinen Tropfen geschmolzenen Wachs hinter dem Kopf der Biene um es dem Band zwischen Kopf und Thorax zu fixieren Kopfbewegungen während der Aufnahmen zu verhindern.
  6. Markieren Sie jede einzelne Biene mit einer Nummer auf dem Band zur besseren Identifizierung und platzieren Sie den Schlauch mit dem festen Biene in einer feuchten Atmosphäre, um eine Dehydratation zu verhindern.
  7. Führen Sie jede einzelne Biene für 5 sec mit Tröpfchen einer 30% Saccharose-Lösung mit einer Spritze vorgestellt und lassen Sie alle Bienen für 30 min erholen, bevor mit dem taktilen Klimaanlage Protokoll.

2. Tactile Conditioning

  1. Bevor Klimaanlage hat jede einzelne Biene für die proboscis extension response (PER) auf 30% Saccharose Stimulus zu den Antennen getestet werden. Wodurch die Spitze des Rüssels muss eine virtuelle Linie zwischen der geöffneten Mandibeln überqueren. Entsorgen Sie alle Bienen, nicht mit einem KGV der Saccharose Reiz reagieren.
  2. Für taktile Konditionierung mit einem Messing cube (zB 3 x 5 mm) mit einer glatten oder einer gravierten Muster, zB horizontale oder vertikale Nuten bilden ein Gitter mit 150 um Wellenlänge, als die konditionierten Reiz (CS). Foder die unbedingte Reiz (US) mit einem 30% Saccharose-Lösung (Haushaltszucker, in Wasser verdünnt).
  3. Das Messing Würfel (CS) in einer Halterung an einem Mikromanipulator platziert (zB Märzhäuser MM33) eine genaue Positionierung während der Konditionierung zu gewährleisten. Die USA die Biene mit einer Spritze mit einer 30% Saccharose-Lösung gefüllt präsentiert.
  4. Die Konditionierung besteht aus fünf Paarungen der taktilen Reiz (CS) und Saccharose-Lösung (US) mit einem inter-trial-Intervall (ITI) von 5 min. Legen Sie eine einzelne Biene vor dem Mikromanipulator mit dem montierten taktilen Reiz (CS). Positionieren des CS langsam, so dass die Oberfläche des taktilen Reiz parallel zum Kopf der Biene (Abbildung 1 A und B) ist. Der Abstand zwischen dem Tier und dem taktilen Objekt sollte im Bereich des antennalen Ausladung der getesteten Biene sein, dh die Biene der Lage sein sollten, um die taktilen Reiz scannen in einer komfortablen Position with beide Antennen. In dem Beispiel in 1 gezeigt, war der Abstand von 3 mm. Lassen Sie die Biene scannen die taktilen Reiz (CS) für 5 Sekunden. Nach der ersten 3 sec, präsentieren ein Tröpfchen der 30% Sucrose (US)-Lösung mit einer Spritze unter den Rüssel. Verwenden Sie die Spitze der Spritze vorsichtig heben die Rüssel. Saccharose Stimulation unter den Rüssel wird entlocken die unbedingte PER 15. Lassen Sie die Biene, die Saccharose Belohnung lecken. Verwenden Sie eine Stoppuhr mit einem Alarmsignal, um die genauen Zeitintervallen während der Konditionierung zu halten.
  5. Das konditionierte PER wird als Maß für den Lernerfolg einer Biene verwendet. Nach den ersten belohnt Paarungen starten Bienen zu CS Präsentation durch Erweiterung ihres Rüssels zu reagieren, was darauf hinweist, dass sie die bevorstehende Belohnung erwarten. Ein vollständig ausgefahrenen Rüssels jederzeit während der 3 sec Zeitfenster Tastreizes Aufmachung und Präsentation vor Saccharose beobachtet wird als positive Reaktion gewertet. Keine Antwort gezählt negativ. Die occurrence des PER ist vom Experimentator vermerkt. Der Prozentsatz der Bienen, die die PER während CS Präsentation ist für jeden Versuch aufgetragen.

3. Kinematische Recordings

  1. Antennalen Bewegungen eines einzigen genutzt Biene mit einer digitalen Videokamera mit einem geeigneten Makro-Objektiv (zB Basler A602f-2 mit TECHSPEC VZM 200 ausgestattet, betrieben bei 50 fps über einen Firewire-Anschluss) aufgezeichnet. Die Kamera ist oberhalb des Tieres in einer Draufsicht (Figur 1 A) positioniert ist. In Abbildung 1 ist die räumliche Auflösung der Aufnahmen 0,02 mm / Pixel.
  2. Kalibrieren Sie die Kamera durch die Aufnahme einzelner Bilder von einem 10 x 10 mm Schachbrett mit einer Kantenlänge von 1 mm aus verschiedenen Ausrichtungen unter dem Kamera-Objektiv. Die Kalibrierung kann mit der Kamera-Kalibrierung tool box Matlab 16 durchgeführt werden.
  3. Legen Sie eine einzelne feste bee unterhalb der Kameralinse. Präsentieren des taktilen Reiz, der an einem Mikromanipulator, An das Tier. Gehen Sie in der gleichen Weise wie für die taktile Konditionierung, und notieren Sie die antennalen Bewegung, während die Biene ist das Scannen des Objekts. Es ist wichtig, dass die volle antennalen Arbeitsbereich und der Tastreizes sichtbar sind. Die Auswahl der Reizmuster getestet und Studie-Nummern hängen von der experimentellen Design.

4. Data Analysis

  1. Die Berechnung der Bildhintergrund wird in Matlab getan. Erstens hat der Median Grauwert über die Zeit, um für jedes Pixel berechnet werden. Statische Objekte, wie die festen Kopf der Biene und der taktilen Reiz, bilden den Bildhintergrund. Bewegte Objekte, wie die beiden Antennen, werden nicht mehr in den Hintergrund.
  2. Jeder Rahmen des aufgenommenen Videos hat, sequentiell geladen werden, und die Differenz zwischen dem aktuellen Frame und dem Bildhintergrund muss berechnet werden. Das Ergebnis dieser Subtraktion betont diejenigen Teile des Bildes, die von Rahmen zu Rahmen bewegen. Identifikationeally, sind die Antennen der Biene die einzigen Bereiche von Nicht-Null-Werte (Abbildung 1C).
  3. Zur weiteren Verarbeitung werden die beiden größten Flächen mit von Null angenommen Pixelwerte die Antennen sein. Zu den beiden Antennen eine binäre Maske zu erzeugen, die für jedes Pixel einen Wert 1, falls das Pixel gehört zu der Antenne und den Wert 0 ansonsten. Diese Maske dient als Grundlage für die Lokalisierung der antennalen Tipps später. Um eine vorläufige Maske für das gesamte Bild zu gewinnen die grau-Wert jedes Pixels des Differenzbilds mit einem vordefinierten Schwellenwert verglichen. Da wir kümmern uns um Geräusche später diese Schwelle gewählt wird recht gering zu sein. Die vorläufige Maske dann noch trägt zwei Arten von Fehlern: Erstens wegen Bildrauschen kleinen Regionen sind immer noch Teil der Maske. Zweitens könnten Bereiche, die an der Antenne gehören nicht unbedingt in vollem Umfang angeschlossen werden. Letzteres geschieht meist, wenn der Hintergrund hat ungefähr die gleiche wie die Antenne Lumineszenz. Um diese Artefakte zu eliminieren, StandardBildverarbeitung morphologische Operation angewendet werden, dh eine Kombination von Bild Erosion und Dilatation, gestützt auf die Standard-Matlab-Funktionen imerode und imdilate sind (siehe 17 S. 158-205 für weitere Erläuterungen). Nach dem Verfahren werden die Antennen Rauschunterdrückung Hypothesen werden noch innerhalb des gleichen Maske enthalten. Daher in einem nächsten Schritt die binäre Maske für disjunkte Bereiche mit dem Standard Matlab-Funktion bwlabel (siehe 17 S. 40-48 für weitere Details auf das Bild Segmentierungsalgorithmus) gebündelt.
  4. Die Anzahl von Pixeln pro Cluster wird gezählt und die beiden größten Clustern ausgewählt. Der Schwerpunkt berechnet wird, um zwischen dem linken und rechten Antenne (1D) zu unterscheiden.
  5. Die antennalen Spitze für jede Antenne als das Pixel in einem Cluster mit dem höchsten Wert in proximal-zu-distal (siehe 1D) definiert werden.

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Representative Results

In dem folgenden Experiment haben wir untersucht, wie taktile Lernen antennalen Probenahme Verhalten von Honigbienen beeinflusst. Hierzu überwachten wir die Bewegung der Spitze in antennalen naiven und konditionierten Bienen vor und während der Darstellung eines taktilen Reiz.

Zuerst wurde die spontane antennalen Bewegung einer Gruppe von Pollensammlerinnen (N = 42) für 1 Minute aufgezeichnet. Die eine Hälfte der Bienen (N = 21) wurde dann durch Paarung fünf Mal eine taktile Reiz mit einer 30% Saccharose Belohnung konditioniert. Dies war das konditionierte Gruppe. Die taktilen Reiz war die 30 x 50 mm Oberfläche eines Messing Würfel mit einem gravierten horizontale Gitter (λ = 150 um). Die andere Hälfte der Bienen (N = 21) wurde nicht konditioniert und als naive Gruppe. Abbildung 2 zeigt die mittlere Lernkurve der konditionierten Gruppe von Bienen. Der Prozentsatz der konditionierten PER nach dem ersten Belohnung unterscheidet sich signifikant von der spontanen Verhalten (Abb. 2 3. Belohnung.

Danach wird die Bewegung des antennalen Spitze sowohl in der Klimaanlage und dem naiven Gruppe wurde erneut für 1 min in Anwesenheit des taktilen Reiz aufgezeichnet Abbildung 3 A 1 -. B 2 zeigt die Verteilung der antennalen Spitze Standorten in beiden Gruppen vor und während der Präsentation der taktilen Objekt. Sowohl der naiven und das konditionierte Gruppe änderten ihre antennalen Bewegungsmuster in Gegenwart eines Tastreizes Vergleich zum spontanen Verhalten. Die Wahrscheinlichkeit der antennalen Tipp zur Suche und / oder Muster der Bereich des Stimulus signifikant erhöht wird, wenn der Reiz vorhanden war, zeigt, dass taktile Abtastung beinhaltet eine deutliche Veränderung in der antennalen Bewegungsmuster im Vergleich zu spontanen antennalen Bewegung. Dies ist für beide Gruppen von Bienen (Abbildung 3 C 1 und C wahr (Abb. 3 C 1 und C 2, Mann-Whitney-U-Test, p <0,05; gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Bezugszeiträume A in 3C). So führt taktile Konditionierung zu einer Erhöhung der aktiven antennalen Bewegung in der Nähe des Objekts und taktile Abtastung der Objektoberfläche, wie zuvor in Erber gezeigt (2012) 18. Im Vergleich zu den naiven Gruppe war die räumliche Verteilung während Stimuluspräsentation viel glatter nach der Konditionierung (Vergleiche Abbildung 3 B 1 und B 2).

Zusammenfassend sind die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass Bienen sehr effektiv trainiert werden, um zu einem taktilen Reiz zu reagieren, und dass taktilen Lernen wird durch erhöhte aktiviert begleitetve suchen und Probenahme Verhalten.

Abbildung 1
. Abbildung 1 Video-Aufzeichnung und antennalen Tracking-Prozedur A:. Top-Down-Sicht eine feste Biene und der taktilen Reiz. Die taktilen Reiz vor dem Kopf des feststehenden Biene mit okkludierten Augen positioniert. Es wird innerhalb des antennalen Arbeits-Bereich befindet. d und p geben distalen und proximalen Positionen relativ zu dem Tier B:. Seitenansicht des gleichen Biene und dem taktilen Reiz. Die Oberfläche des taktilen Reiz und dem Kopf der Biene (blau gestrichelte Linien) sind parallel zueinander C:. Unterscheidungsmerkmale bewegenden Pixel von statischer Pixel in einer Videosequenz. Zieht man jedes Bild von einem Hintergrund-Modell ermöglicht die Identifizierung der beweglichen Teile, dh die einntennae. Die festen Kopf der Biene und der taktilen Reiz (hier als rote gestrichelte Linien angedeutet) sind statisch und nicht sichtbar nach der Subtraktion D:. Definieren links und rechts und die antennalen Spitze. Die beiden größten Pixelcluster nach Abzug sind wie Antennen identifiziert. Berechnung des Schwerpunktes ermöglicht die Unterscheidung zwischen dem linken (rot) und rechts (grün) Antenne. Die antennalen Spitze für jede Antenne (schwarzes Kreuz) kann als das Pixel in einem Cluster mit dem größten Wert in der distalen Richtung definiert werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Lernkurve taktiler PER Klimaanlage. Pollensammlerinnen ausgebildet wurden mit fünf Paarungen der CS (taktilen Reiz) und US (Saccharose-Lösung) mit einer inter-Studie im Abstand von 5 min. Der Prozentsatz der positiven Antworten von 21 Tieren für die spontane Verhalten (spont) und du aufgetragenring Präsentation des CS nach jedem Klimaanlage Studie. Der Anteil der PER beobachtet, nachdem die erste und alle folgenden Belohnungen unterscheidet sich deutlich von dem spontanen Verhalten (Fisher genaue Wahrscheinlichkeit Test, p <0,001).

Abbildung 3
Abbildung 3. Normalisierte durchschnittliche Verteilungen des antennalen Spitze Ort während eines Zeitraums von 1 min. Die Spitze antennalen Verteilung jedes Biene wurde auf die Gesamtzahl von Datenpunkten pro Tier normalisiert. Die Tafeln zeigen die Ergebnisse von naiven (links, N = 21) und konditionierten Bienen (rechts, N = 21) vor (A) und während der Stimulus-Präsentation (B) A 1 und A 2:. Spontane antennalen Bewegung vor Reizdarbietung. Die Abszisse zeigt die seitliche Position der Spitze relativ zu antennalen the Mitte des Kopfes (vgl. Abbildung 1C und D). Die Ordinate zeigt das distale Position des antennalen Spitze. Die Farbskala zeigt den Prozentsatz der Zeit, die der antennalen Spitze an jedem gegebenen Ort verbracht. Die Aufnahme von 1 min war äquivalent zu 3000 Videorahmen B 1 und B 2:. Gleiche wie in A 1,2, aber während Stimuluspräsentation C 1 und C 2:. Durchschnittliche Anzahl von Rahmen, in dem die Spitze innerhalb antennalen befand die Objektfläche, dh ± 3 Bins distalen oder proximalen relativ zu dem Stimulus Oberfläche. C1: naive Gruppe; C2: klimatisierte Gruppe. Die Box-Whisker-Plots zeigen den Median, Mittelwert, Quartile, und 5-95% Perzentil Bereiche der Anzahl der Frames pro Minute. In beiden Gruppen von Bienen, gibt es einen signifikanten Unterschied zwischen "kein Stimulus" (A) und "mit Stimulus" (B, C; Wilcoxon-Test, C 1: P = 5,39 * 10 -4; C 2 -5). Die durchschnittliche Anzahl der Frames während taktilen Reiz Präsentation ist deutlich größer in konditionierten Bienen als naiv Bienen (Mann-Whitney-U-Test, C 1 - C 2: P = 0,007). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

Vorbereitung der Bienen: Sammeln und Fixieren die Bienen schnell getan werden sollte, um den Stress des Tieres gering zu halten. Stress hat einen Einfluss auf die PER-Reaktionsfähigkeit und könnte daher einen indirekten Einfluss auf die Lernleistung bei Bienen 19, 20. Die Belastung kann durch Platzieren der Glasfläschchen mit den Bienen direkt auf Eis unmittelbar nach der Entnahme, um sie schnell zu immobilisieren verringert werden. Es muss berücksichtigt werden, dass die Bienen mehr Zeit, um die mehr erholen die Anästhesie beträgt, bevor benötigen.

Vision hat einen negativen Effekt auf taktile Lernen bei Bienen 18. Deshalb ist es wichtig, Visionen durch die Malerei der Augen des Tieres zu verschließen. Um den visuellen Kontrast der Videoaufnahmen zu erhöhen, empfiehlt es sich, weiße Farbe zu verwenden (z. B. Tipp-Ex). Darauf zu achten, um die Antennen in Kontakt mit der Farbe zu erhalten.

Lernenten Leistung: Frühere Studien im Labor und im Feld zeigte, dass Saccharose Empfindlichkeit in honey bee Sammlerinnen ihre assoziative Lernfähigkeit 21, 22 beeinflussen. Hohe Saccharose Empfindlichkeit positiv mit besseren taktilen Akquisition und Diskriminierung Leistungen korreliert. Pollensammlerinnen eines Honigbienenvolk sind im Durchschnitt besser auf Saccharose als Nektar Sammlerinnen in den meisten Wochen des Nahrungssuche Saison 23. Sie lassen sich leicht von den Pollen Lasten auf ihren Hinterbeinen identifiziert werden und fing am Flugloch. Nectar Sammlerinnen mit hoher Saccharose-Empfindlichkeit kann am Ende eines Nahrungssuche Saison gefangen werden, zwischen September und Oktober. Sie können auf künstliche Anleger mit geringer konzentrierte Zuckerlösung Wasser gelegt ca. 20 m entfernt von der hive 23 gefüllt ausgewählt werden.

Die Lernleistung und Gedächtnisbildung hängt stark von der Sättigung Status einer Biene während der Konditionierung 25. Eine längere Hunger period vor der Konditionierung, beispielsweise über Nacht, kann zur Verbesserung der assoziativen Lernverhalten und erhöhen das Motivationsniveau eines Tieres.

Tactile Konditionierung: Der PRO wird als unbedingte Reaktion in einem appetitive Lernen Protokoll 14 verwendet. Daher ist es wichtig, dass alle getesteten Bienen, die eine vollständig PER zum unbedingten Reiz (Zucker Stimulus) vor der Konditionierung verlängert. Bienen, die nicht mit dem Zucker reagieren sollte Stimulus sowie Bienen, die mit einem PRO während antennalen Kontakt mit der taktilen Reiz vor der Konditionierung reagieren verworfen. Andernfalls wird die extrem niedrige oder extrem hohe Reaktionsfähigkeit dieser Tiere verwechseln die Lernkurve.

Die taktilen Reiz in diesem Protokoll verwendet (Messing Würfel mit horizontalen Gitter) wurde zufällig ausgewählt. Honigbienen können auch auf unterschiedlichen taktile Reize mit verschiedenen Formen und Texturen (siehe 10) konditioniert werden.

Um Akquisition in verschiedenen Gruppen von Bienen (zB Pollen-versus Nectar Sammlerinnen) zu vergleichen, kann eine Übernahme des Gastes 21 berechnet werden. Diese Punktzahl ist die Gesamtzahl der konditionierten Reaktionen auf die CS und es hat einen Bereich zwischen 0 (keine PER konditioniert) und 5 (konditioniert PER nach jedem Klimaanlage Studie).

Video-Analyse: Unterschiedliche Video-Analysen Methoden wurden in der Vergangenheit verwendet, um Veränderungen im Antennallobus Bewegungsverhalten in Honigbienen 26, 27 zu quantifizieren. Unsere Methode hat den Vorteil der Analyse der antennalen Bewegungen ohne reflektierende Markierungen auf den Antennen und profitiert von der Vielzahl von Bildverarbeitungs-Tools in Matlab. Als ein Beispiel, kann man auch den Zeitpunkt der Analyse antennal Kontakte zu einem Objekt, bestimmen die Geschwindigkeit der antennalen Bewegung, berechnen die Winkelpositionen der Antennen in Bezug auf den Körper Achsen oder diskriminieren zwischen links und rechts antennalen Bewegung.

A PRO, die während der Aufzeichnung der antennalen Reaktion auf das Objekt in konditionierten Bienen tritt könnten später stören die automatische Erkennung der Antennen. In diesem Fall ist es notwendig, den Film in VirtualDub zB, zu bearbeiten und um das Objekt, das dem Detektionsprozess, z. B. durch Abdecken der Abschnitt, wo der Rüssel wird mit einem grauen Schicht der gleichen Form interferiert maskieren.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Joachim Erber für die Einführung in die taktile Lernparadigma in Honigbienen. Diese Arbeit wurde durch den Exzellenzcluster CITEC 277, die im Rahmen der deutschen Exzellenzinitiative gefördert unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pollen foragers, Apis mellifera L. Private hives
Glass vials (22 x 45 mm) Carl Roth GmbH Co X655.1
Brass tubes, 10 x 30 mm Self-produced
Brass cube, 3 x 5 mm Self-produced
Tipp-Ex (solvent-free) Tipp-Ex GmbH Co KG
Sucrose solution (30%) Household suger diluted in water
Ethanol (70%) Carl Roth GmbH Co 9065.3
Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) Carl Roth GmbH Co 59.1
Stop Watch Carl Roth GmbH Co L423.1
Micromanipulator Märzhäuser MM33 00-42-101-0000
Digital video camera Basler A602f-2
Macro lens for camera TechSpec VZM 200
Matlab R2009b The MathWorks

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References

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