Summary
In questo protocollo si mostra come condizione sfruttata api a stimoli tattili e introdurre un 2D tecnica del motion capture per analizzare la cinematica di fine scala modello di campionamento antenne.
Abstract
Le api da miele (Apis mellifera L.) sono insetti eusociali e ben noti per la loro complessa divisione del lavoro e la capacità di apprendimento associativo 1, 2. Le api operaie trascorrere la prima metà della loro vita all'interno dell'alveare buio, dove sono le larve allattamento o la costruzione della regolare pettini esagonale per il cibo (ad esempio polline o nettare) e la covata 3. Le antenne sono straordinari antenne multisensoriali e svolgono un ruolo fondamentale in diversi compiti tattili mediate 4, tra cui lo sviluppo alveare 5 e riconoscimento di pattern 6. Più tardi nella vita, ogni singola ape lascia l'alveare alla ricerca di cibo. Poi un ape deve imparare a discriminare redditizie fonti di cibo, memorizzare la loro posizione, e comunicare ai propri compagni di nido 7. Api utilizzano diversi segnali floreali come colori o odori 7, 8, ma anche tattili dalla superficie petalo 9 per formare memorie multisensoriali della fonte di cibo. In laboratorio conditions, le api possono essere addestrati in un paradigma di apprendimento appetitivo di discriminare le caratteristiche degli oggetti tattili, come i bordi o scanalature con le loro antenne 10, 11, 12, 13. Questo paradigma di apprendimento è strettamente legato al condizionamento classico olfattivo della risposta estensione proboscide (PER) in api bardati 14. Il vantaggio del paradigma dell'apprendimento tattile in laboratorio è la possibilità di combinare esperimenti comportamentali sull'apprendimento con varie misurazioni fisiologiche, compresa l'analisi del modello di movimento antennale.
Protocol
1. Preparazione delle api
- Bottinatrici nettare o polline sono catturati in campo sia da un alimentatore di saccarosio o direttamente dall'ingresso alveare mentre tornava da un viaggio foraggiamento. Ogni singola ape viene catturata in una fiala di vetro che viene chiuso con un tappo di schiuma e presi immediatamente in laboratorio per ulteriori manipolazioni.
- In laboratorio, le api catturate sono brevemente raffreddata in frigorifero a 4 ° C fino a quando i primi segni di immobilità.
- Ogni singola ape immobilizzato è montato in un tubo metallico piccola con nastro adesivo tra la testa e il torace e sopra l'addome. Si deve prestare attenzione che la proboscide e le antenne sono liberamente mobili.
- Dipingere gli occhi composti e ocelli delle api fisso con vernice bianca (ad esempio, esente da solventi, Tipp-Ex) da occludere visione.
- Aggiungere una goccia di cera fusa dietro la testa delle api per fissarlo al nastro tra la testa e il torace per evitare movimenti della testa durante le registrazioni.
- Contrassegnare ogni singola ape con un numero sul nastro per una migliore identificazione e posizionare il tubo con l'ape fisso in un ambiente umido per prevenire la disidratazione.
- Alimentare ogni singola ape per 5 secondi con gocce di una soluzione di saccarosio al 30% presentato con una siringa e lasciare tutte le api recuperare per 30 min prima di iniziare con il protocollo condizionata tattile.
2. Condizionamento tattile
- Prima del condizionamento, ogni singola ape deve essere testato per la risposta estensione proboscide (PER) a uno stimolo di saccarosio 30% applicata alle antenne. In tal modo la punta della proboscide deve attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte. Eliminare tutte le api che non rispondono con un PER allo stimolo saccarosio.
- Per il condizionamento tattile usare un cubo ottone (es. 3 x 5 mm) con una superficie liscia o un motivo inciso, ad esempio, scanalature orizzontali o verticali che formano un reticolo con 150 micron lunghezza d'onda, come stimolo condizionato (CS). Fo lo stimolo incondizionato (US) utilizzare una soluzione di saccarosio al 30% (zucchero domestico, diluito in acqua).
- Il cubo ottone (CS) è collocato in un supporto su un micromanipolatore (ad esempio, Märzhäuser MM33) per garantire l'esatto posizionamento durante la procedura di condizionamento. L'US è presentato al ape con una siringa riempita con una soluzione di saccarosio al 30%.
- Il procedimento di condizionamento costituito da cinque coppie di stimolo tattile (CS) e soluzione di saccarosio (US), con un inter-trial intervallo (ITI) di 5 min. Posizionare una singola ape davanti al micromanipolatore con lo stimolo montato tattile (CS). Posizionare il CS lentamente, in modo tale che la superficie dello stimolo tattile è parallelo alla testa delle api (Figura 1 A e B). La distanza tra l'animale e l'oggetto tattile dovrebbe essere nell'intervallo del raggio antennale lavoro dell'ape testati, cioè l'ape dovrebbe essere in grado di eseguire la scansione dello stimolo tattile in una posizione comoda wesimo entrambe le antenne. Nell'esempio illustrato in figura 1, la distanza di 3 mm. Lasciate che l'ape scansione lo stimolo tattile (CS) per 5 sec. Dopo i primi 3 sec, presentano una gocciolina di saccarosio 30% (US) soluzione con una siringa sotto la proboscide. Usare la punta della siringa per sollevare delicatamente la proboscide. Stimolazione Saccarosio sotto le proboscide susciterà l'incondizionato PER 15. Lasciare l'ape a leccare la ricompensa di saccarosio. Utilizzare un cronometro con un segnale di allarme per mantenere gli intervalli di tempo durante il condizionamento esatti.
- Il PER condizionato viene usato come misura per il successo di apprendimento di un ape. Dopo gli accoppiamenti primo premiati, le api iniziano a rispondere alla presentazione CS per estensione dei loro proboscide, che indica che si aspettano la ricompensa futura. A proboscide massima estensione osservati in qualsiasi momento durante la finestra 3 sec Tempo di presentazione dello stimolo tattile e prima della presentazione saccarosio è segnato come una risposta positiva. Nessuna risposta è negativa contato. Il occurrence della PER Va osservato dallo sperimentatore. La percentuale di api che mostrano il PER in occasione della presentazione CS è tracciata per ogni prova.
3. Registrazioni cinematici
- Movimenti antennale di un'ape sfruttata sono registrati con una videocamera digitale con un obiettivo macro adatto (per esempio Basler A602f-2 dotato di TechSpec VZM 200, operato a 50 fps tramite una connessione FireWire). La telecamera è posizionata sopra l'animale in una vista dall'alto in basso (Figura 1 A). In figura 1, la risoluzione spaziale delle registrazioni è di 0,02 mm / pixel.
- Calibrare la fotocamera con la registrazione di immagini singole di una scacchiera 10 x 10 mm, con una lunghezza dello spigolo 1 mm da diversi orientamenti nel quadro dell'obiettivo della fotocamera. La calibrazione può essere fatto con la cassetta degli attrezzi di calibrazione fotocamera Matlab 16.
- Posizionare un un'ape fissa sotto la lente della fotocamera. Presentare lo stimolo tattile, fissato ad un micromanipolatore, Per l'animale. Procedere nello stesso modo descritto per il condizionamento tattile, e registrare il movimento antennale mentre l'ape viene scansione dell'oggetto. È importante che l'intera gamma antennale lavoro e lo stimolo tattile sono visibili. Le scelte dei modelli di stimolo testato e numeri di prova dipende dal disegno sperimentale.
4. Analisi dei dati
- Il calcolo dello sfondo dell'immagine è fatto in Matlab. Primo, il valore mediano di grigio nel tempo deve essere calcolato per ciascun pixel. Oggetti statici, come la testa fissa delle api e lo stimolo tattile, costituirà l'immagine di sfondo. Oggetti in movimento, come due antenne, non sarà parte dello sfondo.
- Ogni fotogramma del video registrato deve essere caricato in sequenza, e la differenza tra il frame corrente e lo sfondo dell'immagine deve essere calcolata. Il risultato di questa sottrazione enfatizza quelle parti dell'immagine che si sposta da frame a frame. Ideally, le antenne delle api sono le uniche aree di valori diversi da zero (Figura 1C).
- Per l'ulteriore elaborazione, i due più grandi aree con valori diversi da zero pixel vengono considerati le antenne. Per entrambe le antenne di una maschera binaria deve essere generato contenenti, per ciascun pixel un valore 1, se il pixel appartiene alla antenna e valore 0 altrimenti. Questa maschera serve come base per localizzare le punte antennali tardi. Per ottenere una maschera preliminare per l'intera immagine del grigio-valore di ciascun pixel dell'immagine differenza viene confrontata con una soglia predefinita. Dal momento che ci prendiamo cura di rumore entro la soglia viene scelto per essere piuttosto basso. La maschera preliminare poi porta ancora due tipi di errori: in primo luogo, a causa del rumore di immagine piccole regioni sono ancora parte della maschera. In secondo luogo, le aree che appartengono alla antenna potrebbe non necessariamente essere completamente collegato. Quest'ultimo si verifica soprattutto se lo sfondo ha approssimativamente la stessa luminescenza come antenna. Per eliminare questi artefatti, standardoperazione di trattamento immagini morfologiche vengono applicate, ossia una combinazione di erosione e dilatazione dell'immagine, basandosi sulle funzioni standard Matlab imerode e imdilate rispettivamente (vedi 17 pp 158-205 per ulteriori spiegazioni). Dopo il processo di denoising le ipotesi antenne sono ancora contenute all'interno della maschera stessa. Quindi, come passo successivo la maschera binaria è in cluster per le aree disgiunte che utilizzano lo standard Matlab funzione bwlabel (vedi 17 pp 40-48 per ulteriori dettagli su l'algoritmo di segmentazione di immagini).
- Il numero di pixel per cluster viene contato e le due maggiori gruppi sono selezionati. Il centro di gravità è calcolata a distinguere tra l'antenna sinistra e destra (Figura 1D).
- La punta antennale per ciascuna antenna può essere definita come il pixel in un cluster con il valore massimo nella prossimale-distale direzione (vedi Figura 1D).
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Representative Results
Nel seguente esperimento abbiamo studiato come l'apprendimento tattile influenza il comportamento antennale campionamento di api mellifere. Per questo, abbiamo monitorato il movimento della punta antennale in api pretrattati e condizionati prima e durante la presentazione di uno stimolo tattile.
Primo, il movimento spontaneo antennale di un gruppo di raccoglitori polline (N = 42) è stata registrata per 1 min. Metà delle api (N = 21) è stata poi condizionata accoppiando cinque volte uno stimolo tattile con un premio di saccarosio 30%. Questo era il gruppo condizionata. Lo stimolo tattile è stata la x 30 50 mm Superficie di un cubo in ottone con inciso un reticolo orizzontale (λ = 150 micron). L'altra metà delle api (N = 21) non è stato condizionato e utilizzato come gruppo naive. Figura 2 mostra la curva media di apprendimento del gruppo condizionata di api. La percentuale di condizionato PER dopo la prima ricompensa è significativamente diverso dal comportamento spontaneo (Figura 2 ° premio.
Successivamente il movimento della punta antennale sia il condizionato e il gruppo naive stata registrata nuovamente per 1 min in presenza dello stimolo tattile Figura 3 A 1 -. B 2 mostra la distribuzione di posizioni punta antennali in entrambi i gruppi, prima e durante la presentazione dell'oggetto tattile. Entrambi, il naif e il gruppo condizionata cambiato il loro modello antennale movimento in presenza di uno stimolo tattile rispetto al comportamento spontaneo. La probabilità della punta antennale di ricerca e / o il campione l'area dello stimolo aumenta significativamente se lo stimolo era presente, dimostrando che il campionamento tattile comporta un netto cambiamento nel modello di movimento antennale rispetto al movimento spontaneo antenne. Ciò vale per entrambi i gruppi di api (figura 3 C 1 e C
In sintesi, i risultati di questo esperimento mostrano che le api possono essere addestrati in modo molto efficace per rispondere ad uno stimolo tattile, e che l'apprendimento tattile è accompagnata da un aumento active la ricerca e campionamento comportamento.
. Figura 1 La registrazione del video e la procedura di monitoraggio antenne A:. Top-down vista di un'ape fisso e lo stimolo tattile. Lo stimolo tattile è posizionato davanti alla testa della ape fissa con occhi occluse. Si trova all'interno del antennale operaia gamma. D e P indicano le località distale e prossimale rispetto per l'animale B:. Vista laterale delle api stesse e lo stimolo tattile. La superficie dello stimolo tattile e la testa delle api (blu linee tratteggiate) sono paralleli tra loro C:. Distinguere pixel dal pixel in movimento statici in una sequenza video. Sottraendo ogni immagine da un modello di sfondo consente di individuare le parti in movimento, vale a dire, l'unantennae. La testa fissa delle api e lo stimolo tattile (qui indicate come linee rosse tratteggiate) sono statici e non visibile dopo la sottrazione D:. Definizione di destra e sinistra e la punta antennale. I due cluster più pixel dopo sottrazione sono identificati come antenne. Calcolo del centro di gravità permette distinguere tra la sinistra (rosso) e destra (verde) antenna. La punta antennale per ciascuna antenna (croce nera) può essere definita come il pixel in un cluster con il valore più grande nella direzione distale.
Figura 2. Curva di apprendimento tattile di condizionamento PER. Bottinatrici di polline sono stati formati con cinque coppie del CS (stimolo tattile) e Stati Uniti (una soluzione di saccarosio), con un inter-trial intervallo di 5 min. La percentuale di risposte positive di 21 animali è tracciata per il comportamento spontaneo (SPONT) e dupresentazione anello del CS dopo ogni prova condizionata. La percentuale di PER osservata dopo la prima e tutti i premi seguenti è significativamente diverso dal comportamento spontaneo (probability test esatto di Fisher, p <0,001).
Figura 3. Normalizzate distribuzioni medi del percorso punta antennale durante un periodo di 1 min. La distribuzione punta antennale di ciascuna ape è stata normalizzata per il numero totale di punti di dati per animale. I pannelli mostrano i risultati da ingenuo (a sinistra, N = 21) e le api condizionata (a destra, N = 21) prima (A) e durante la presentazione dello stimolo (B) A 1 e A 2. Spontaneo movimento antenne prima della presentazione dello stimolo. L'ascissa indica la posizione laterale della punta antennale relativo the centro della testa (confrontare con la figura 1C e D). L'ordinata mostra la posizione della punta distale antennale. La scala di colori indica la percentuale di tempo che la punta antennale trascorso presso qualsiasi posizione. Il periodo di registrazione di 1 minuto è stato pari a 3.000 fotogrammi B 1 e B 2:. Come in un 1,2, ma durante la presentazione dello stimolo C 1 e C 2:. Numero medio di fotogrammi in cui si trovava la punta antennale all'interno l'area oggetto, vale a dire, ± 3 appositi contenitori distale o prossimale alla superficie stimolo. C1: ingenuo gruppo; C2: gruppo condizionata. I box-whisker mostrano la mediana, media, quartili, percentili e gli intervalli di 5-95% del numero di fotogrammi al minuto. In entrambi i gruppi di api, vi è una differenza significativa tra 'nessuno stimolo' (A) e 'uno stimolo' (B, C, Wilcoxon test, C 1: P = 5.39 * 10 -4; C 2 -5). Il numero medio di fotogrammi durante la presentazione dello stimolo tattile è significativamente più grande di api condizionata, che in api naive (Mann-Whitney U test, C 1 - C 2: P = 0.007). Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Preparazione delle api: raccogliere e fissare le api dovrebbe essere fatto rapidamente, al fine di mantenere il livello di stress di bassa animale. Lo stress ha un effetto sulla PER-risposta e, quindi, potrebbe avere un effetto indiretto sulle prestazioni di apprendimento delle api 19, 20. Il livello di stress può essere ridotta collocando i flaconi di vetro con le api direttamente su ghiaccio immediatamente dopo il prelievo per immobilizzare rapidamente. Si deve tenere conto che le api bisogno di più tempo per recuperare più lungo è il periodo di anestesia prima.
Vision ha un effetto negativo sull'apprendimento tattile delle api 18. Pertanto è importante occludere visione dipingendo gli occhi dell'animale. Al fine di aumentare il contrasto visivo delle registrazioni video, si raccomanda di usare vernice bianca (ad esempio, Tipp-Ex). Si deve prestare attenzione a non ottenere il antenne in contatto con la vernice.
Imparareprestazioni ing: studi precedenti in laboratorio e sul campo hanno dimostrato che la sensibilità di saccarosio in api bottinatrici influenzare la loro capacità di apprendimento associativo 21, 22. Alta sensibilità saccarosio è positivamente correlata con una migliore acquisizione tattile e prestazioni discriminazione. Bottinatrici di polline di una colonia di api al miele sono in media più sensibili al saccarosio di raccoglitori di nettare in maggior parte delle settimane di una stagione foraggiamento 23. Essi possono essere facilmente identificati dai carichi di polline sulle zampe posteriori e prese all'ingresso dell'alveare. Bottinatrici Nectar con sensibilità elevata di saccarosio possono essere catturati al termine di una stagione foraggiamento, tra settembre e ottobre. Possono essere selezionati su linee artificiali pieni di bassa acqua e zucchero concentrato posto a circa 20 m di distanza dall'alveare 23.
Le prestazioni di apprendimento e formazione della memoria dipende fortemente dallo stato di sazietà un'ape durante il condizionamento 25. Un peri più fameod prima del condizionamento, ad esempio durante la notte, in grado di migliorare il comportamento associativo di apprendimento e aumentare il livello di motivazione di un animale.
Condizionata tattile: Il PER viene utilizzato come risposta incondizionata in un apprendimento appetitiva protocollo 14. Pertanto, è fondamentale che tutte le api testati mostrano completamente esteso PER allo stimolo incondizionato (stimolo zucchero) prima del condizionamento. Le api che non rispondono allo stimolo dello zucchero deve essere eliminato così come le api che rispondono con un PER antenne durante il contatto con lo stimolo tattile prima del condizionamento. In caso contrario, la capacità di risposta estremamente bassi o estremamente alti di questi animali confondere la curva di apprendimento.
Lo stimolo tattile utilizzato in questo protocollo (cubo in ottone con griglie orizzontali) è stata scelta a caso. Il miele le api può essere condizionata anche su diversi stimoli tattili, con varie forme e texture (vedi 10).
Per confrontare acquisizione in diversi gruppi di api (ad esempio polline rispetto raccoglitori Nectar), un punteggio di acquisizione può essere calcolato 21. Questo punteggio è il numero totale di risposte condizionate al CS e ha un range compreso tra 0 (nessuna condizionato PER) e 5 (condizionato PER dopo ogni prova di condizionamento).
Analisi Video: analisi di video differenti metodi sono stati utilizzati in passato per quantificare i cambiamenti nel comportamento in movimento antennale api 26, 27. Il nostro metodo ha il vantaggio di analizzare i movimenti antennali senza la necessità di marcatori riflettenti sulle antenne e si avvale della varietà di strumenti di elaborazione delle immagini in Matlab. Come esempio, si può anche analizzare i tempi di antennAl contatti verso un oggetto, determinare la velocità di movimento antennali, calcolare le posizioni angolari delle antenne in riferimento agli assi corporei o discriminare tra destra e sinistra movimento antenne.
Un PER che si verifica durante la registrazione della risposta antennali all'oggetto in api condizionata potrebbe interferire con il successivo rilevamento automatico delle antenne. In questo caso è necessario modificare il filmato, ad esempio in VirtualDub, e per mascherare l'oggetto che interferisce con il processo di rilevamento, ad esempio coprendo la sezione in cui la proboscide appare con uno strato grigio della stessa forma.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Joachim Erber per l'introduzione di noi al paradigma dell'apprendimento tattile di api mellifere. Questo lavoro è stato sostenuto dal cluster di 277 CITEC Excellence, finanziato nell'ambito dell'iniziativa eccellenza tedesca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
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