Summary
이 프로토콜에서 우리는 상태로 촉각 자극에 꿀벌을 밝혀와 고급 규모의 antennal 샘플링 패턴의 운동학을 분석하는 차원 모션 캡처 기술을 소개하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
꿀벌 (API를 mellifera L.)은 eusocial 곤충이며, 잘 노동과 연관 학습 능력 1, 2, 자신의 복잡한 부문에 대한 알려져 있습니다. 그들은 애벌레를 받아야하거나 일반 육각 식품 빗 (예 : 꽃가루 나 꿀)과 알을 품다 3 구축 곳의 일벌은 어두운 벌집 내부의 인생의 첫 번째 절반을 보냅니다. 안테나는 특별한 multisensory feelers하고 하이브 건물 5 패턴 인식 6 등 다양한 촉각 인한 작업 4에서 중추적 인 역할을한다. 나중에 생활에서, 각 하나의 벌은 음식에 대한 사료에 하이브를 출발합니다. 그런 벌은 수익 음식 소스를 차별 위치를 기억, 7의 둥지 친구로 의사 소통을 할 수 있습니다. 꿀벌은 음식 소스의 multisensory 기억을 형성하기 위해 꽃잎 표면 9 색이나 냄새 7, 8, 9, 10와 같은 다른 꽃 신호뿐만 아니라, 촉각 신호를 사용합니다. 실험실 공동 이하nditions은 꿀벌이 같은 가장자리 또는 안테나 10, 11, 12, 13와 홈으로 촉각 객체 기능을 차별하는 appetitive 학습 패러다임에서 훈련을 할 수 있습니다. 이 학습 패러다임은 밀접하게 밝혀 꿀벌 14 코 확장 응답 (PER)의 클래식 후각 시설에 관련되어 있습니다. 실험실에서 촉각 학습 패러다임의 장점은 antennal 운동 패턴의 분석 등 다양한 생리 측정과 학습에 행동 실험을 결합의 가능성입니다.
Protocol
1. 꿀벌 준비
- foraging 여행에서 돌아하면서 꿀이나 꽃가루 일개미는 자당 피더이나 직접 벌집 입구에서 어느 분야에서 잡은 수 있습니다. 각 단일 벌은 폼 플러그와 폐쇄 및 추가 처리를위한 실험실로 바로 이동되는 유리관에 캡처됩니다.
- 사람들이 부동의 첫 징후를 보여 ° C까지 실험실에서 캡처 꿀벌은 잠시 4에 냉장고에 냉각되어 있습니다.
- 각 단일 고정 벌은 머리와 가슴 사이와 복부 이상 접착 테이프로 작은 금속 튜브에 장착되어 있습니다. 케어는 코와 안테나 자유롭게 움직일 수 있다는주의해야한다.
- 비전을 막다하기 위해 흰색 페인트 (예 : 용매 무료 Tipp-예)로 고정 벌의 화합물 눈과 ocelli 그림을 그리기도 하죠.
- 녹음하는 동안 머리의 움직임을 방지하기 위해 머리와 가슴 사이의 테이프에 문제를 해결하기 위해 꿀벌의 머리 뒤에 녹은 왁스의 작은 방울을 추가.
- 더 나은 식별 테이프에 번호를 각각 하나의 벌을 표시하고 탈수를 방지하기 위해 습윤 분위기에 고정 벌과 튜브를 놓습니다.
- 주사기가 표시 30 % 자당 솔루션의 방울을 5 초 각 하나의 벌을 먹이고 촉각 시설 프로토콜로 시작하기 전에 모든 꿀벌이 30 분에 복구 보자.
2. 촉각 컨디셔닝
- 에어컨하기 전에, 각 단일 벌은 안테나에 적용 30 % 자당의 자극에 코 확장 응답 (PER)에 대한 검사를해야합니다. 따라서 코의 끝이 열려있는 개미 사이에 가상의 선을 넘어있다. 자당의 자극에 PER으로 응답하지 않는 모든 꿀벌을 폐기하십시오.
- 촉각 에어컨이 설치된 자극 (CS)와 같은 부드러운 또는 조각 패턴, 예를 들어, 수평 또는 150 μm의 파장과 격자를 형성하는 수직 홈이있는 황동 큐브를 (예를 들어 3 × 5 ㎜), 사용하십시오. 에프또는 무조건 자극 (미국)는 30 %의 자당 솔루션을 (물에 희석 가정 설탕,)을 사용합니다.
- 황동 큐브 (CS)는 컨디셔닝 절차를 수행하는 동안 정확한 위치를 보장하기 위해 (예를 들어, Märzhäuser MM33) micromanipulator에 홀더에 배치됩니다. 미국은 30 % 자당 솔루션들로 가득 찬 주사기로 벌에게 수여됩니다.
- 에어컨 절차는 5 분 간 시험 간격 (ITI)와 촉각 자극 (CS)과 자당 솔루션 (미국) 다섯 pairings로 구성되어 있습니다. 마운트 된 촉각 자극 (CS)과 micromanipulator 앞에 한 벌을 배치합니다. 촉각 자극의 표면이 꿀벌의 머리 (그림 1 A와 B)에 평행되도록 천천히 CS를 배치합니다. 동물과 촉각 객체 사이의 거리가 테스트 꿀벌의 antennal 작업 반경의 범위에 있어야, 비 편안한 자세 w에 촉각 자극을 스캔 할 수 있어야한다 즉i 번째 안테나 모두. 그림 1에 표시된 예제에서, 거리가 3mm했다. 꿀벌이 5 초에 대한 촉각 자극 (CS)를 스캔 보자. 처음 3 초 후, 30 % 자당 (미국) 코 아래에 주사기와 솔루션의 비말을 제시한다. 부드럽게 코를 높이 주사기의 끝을 사용합니다. 코 아래에 자당의 자극은 15 당 무조건을 이끌어내는 것입니다. 꿀벌은 자당 보상을 치유 할 수 있습니다. 컨디셔닝 동안 정확한 시간 간격을 유지하기 위해 경보 신호 스톱워치를 사용하십시오.
- 에어컨, PER은 벌의 학습 성공을위한 조치로 사용됩니다. 첫 번째 보상 pairings 후, 꿀벌들은 향후 보상을 기대하는 의미, 자신의 코의 확장에 의한 CS 프리젠 테이션에 대응하기 위해 시작합니다. 촉각 자극 프리젠 테이션의 3 초 시간 창 동안과 자당 프리젠 테이션하기 전에 언제든지 관찰 완전히 확장 코는 긍정적 인 반응으로 채점됩니다. 응답이 부정적인 인정되지 않습니다. occPER의 urrence은 실험에 의해 주목해야합니다. CS 프리젠 테이션 동안 PER을 보여 꿀벌의 비율은 각 시험에 대한 도시된다.
3. 동적 레코딩
- 하나 밝혀 벌의 Antennal 움직임이 적합한 매크로 렌즈 (예 : TechSpec VZM 200 장착 Basler A602f-2, 화재 와이어 연결을 통해 50 프레임에서 작동)와 디지털 비디오 카메라로 기록됩니다. 카메라는 하향식 (top-down)보기에서 동물 (그림 1 A) 위에 위치합니다. 그림 1에서 녹음의 공간 해상도는 0.02 mm / 픽셀입니다.
- 카메라 목적에 따라 서로 다른 방향에서 1 mm의 가장자리 길이 10 × 10mm의 체커의 사진을 하나 기록하여 카메라를 보정합니다. 보정은 카메라 보정 도구 상자 MATLAB 16으로 수행 할 수 있습니다.
- 카메라 렌즈 아래에 하나의 고정 벌을 배치합니다. micromanipulator에 고정 촉각 자극을 제시, 동물합니다. 촉각 시설에 대한 설명과 같은 방식으로 진행하고, 비 개체를 스캔하는 동안 antennal 움직임을 기록합니다. 그것은 전체 antennal 작동 범위와 촉각 자극이 볼 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 자극 패턴의 선택 테스트 및 시험 번호는 실험 설계에 따라 달라집니다.
4. 데이터 분석
- 이미지 배경의 계산은 MATLAB에서 이루어집니다. 첫째, 시간이 지남에 따라 중간 그레이 스케일 값은 각 픽셀에 대해 계산해야합니다. 정적 객체는, 꿀벌과 촉각 자극의 고정 머리처럼 이미지 배경을 구성합니다. 움직이는 물체는 두 개의 안테나 같은 배경의 일부가 될 수 없습니다.
- 기록 된 비디오의 각 프레임이 순차적으로로드 할 수 있으며, 현재 프레임과 이미지 배경의 차이는 계산해야합니다. 이 뺄셈의 결과는 프레임에서 프레임으로 이동하는 이미지의 부분을 강조하고 있습니다. 신분증eally, 꿀벌의 안테나는 비 제로 값 (그림 1C)의 유일한 지역입니다.
- 자세한 처리를 위해, 비 - 제로 픽셀 값과 함께 두 큰 영역은 안테나로 간주됩니다. 두 안테나에 대한 바이너리 마스크는 픽셀의 안테나와 달리 값을 0으로 속하는 경우, 각 픽셀에 대해 값 1을 포함하는 생성하는 것입니다. 이 마스크는 나중에 antennal 팁을 현지화의 기반으로 제공하고 있습니다. 전체 이미지에 대한 예비 마스크를 얻으려면 다른 이미지의 각 픽셀의 회색 값은 미리 정의 된 임계 값과 비교됩니다. 우리가 노이즈 처리하기 때문에 나중에이 임계 값이 매우 낮을 것으로 선택됩니다. 첫째, 이미지 노이즈 작은 지역으로 인해 아직도 쓰고의 일부입니다 : 예비 마스크는 여전히 오류 두 가지를 수행합니다. 둘째, 안테나에 속하는 지역은 반드시 완전히 연결되지 않을 수 있습니다. 배경은 약 안테나와 같은 발광가있는 경우 후자는 주로 발생합니다. 이러한 유물을 제거하려면, 표준영상 처리 형태학의 작업이 적용됩니다, 표준 MATLAB 함수는 imerode과 (자세한 설명은 17 pp. 158-205 참조) 각각 imdilate에 의존, 이미지 침식과 팽창의 조합을 말한다. denoising 절차 후 안테나의 가설은 여전히 같은 마스크에 포함되어 있습니다. 따라서, 다음 단계로 바이너리 마스크는 표준 MATLAB 함수를 bwlabel을 (이미지 세분화 알고리즘에 대한 자세한 내용은 17 pp. 40-48를 참조)를 사용하여 연결이 끊긴 지역에 밀집되어 있습니다.
- 클러스터 당 픽셀의 수는 계산되어 두 개의 큰 클러스터가 선택되었습니다. 무게 중심은 왼쪽과 오른쪽 안테나 (그림 1D)를 구별하는 계산됩니다.
- 각 안테나에 대한 antennal 팁은 근위 - 투 - 말초 방향 (그림 1D 참조)에서 가장 높은 값을 가진 클러스터에서 픽셀로 정의 할 수 있습니다.
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Representative Results
다음과 같은 실험에서 우리는 촉각 학습 꿀벌의 antennal 샘플링 동작에 영향을 미치는 방법을 공부했습니다. 이를 위해, 우리는 이전에 순진하고 설치된 꿀벌의 antennal 팁과 촉각 자극을 제시하는 동안 움직임을 감시.
첫째, 꽃가루 일개미 집단의 자발적인 antennal 운동 (N = 42)이 1 분에 기록되었다. 꿀벌의 절반 (N = 21)가 다섯 번에게 30 %의 자당 보상과 촉각 자극을 페어링하여 에어컨이되었다. 이 설치된 그룹이었다. 촉각 자극은 조각 수평 격자 (λ = 150 μm)와 황동 큐브의 30 X 50mm 표면했습니다. 꿀벌의 나머지 절반 (N = 21)이 완비되어 있으며 순진한 그룹으로 사용됩니다. 그림 2는 꿀벌의 설치된 그룹의 평균 학습 곡선을 보여줍니다되지 않았습니다. 첫 번째 보상 후 PER이 설치된의 비율은 자발적인 행동 (그림 2에서 상당히 다릅니다 3 보상 후 채도를 보여줍니다.
그 이후에는 에어컨, 순진한 그룹 모두에서 antennal 팁의 움직임은 촉각 자극의 면전에서 1 분에 다시 기록 된 그림 3 1 -. B 2 두 그룹에서 antennal 팁 위치의 분포를 보여줍니다하기 전에 및 프리젠 테이션시 촉각 객체의. , 순진하고 설치된 그룹 모두 자연 동작에 비해 촉각 자극의 존재에서의 antennal 운동 패턴을 변경했습니다. 자극이 존재한다면 검색 및 / 또는 샘플 자극의 지역 antennal 팁의 가능성이 크게 그 촉감 샘플링 자연 antennal 운동에 비해 antennal 운동 패턴에 표시된 변경 사항을 포함 보여주는 증가하고 있습니다. 이 꿀벌의 두 그룹 (그림 3 C 1과 C에 대한 사실
요약이 실험 쇼의 결과는 꿀벌은 촉각 자극에 대응하기 위해 매우 효과적으로 훈련 될 수 있으며, 그 촉각 학습은 증가 acti 동반VE 검색 및 동작을 샘플링.
. 그림 1 비디오 녹화 및 antennal 추적 절차 A :. 고정 벌과 촉각 자극의 하향식보기. 촉각 자극은 occluded 눈을 고정 벌의 머리 앞에 위치합니다. 이 작업 범위 antennal 내에 위치하고 있습니다. d와 P는 동물에 비해 말초 및 근위 위치를 나타냅니다 B :. 같은 벌과 촉각 자극의 측면보기. 촉각 자극과 벌 (파란색 점선)의 머리의 표면은 서로 평행 C :. 비디오 시퀀스의 정적 픽셀의 구별 이동 픽셀. 배경 모델에서 각 이미지를 빼는 것은 허용 움직이는 부분, 즉의 식별ntennae. . 벌과 촉각 자극 (빨간색 점선으로 여기 표시)의 고정 머리 빼기 D 후 정적 및 표시되지 않습니다 : 왼쪽과 오른쪽 antennal 팁 정의. 빼기 후 두 큰 픽셀 클러스터는 안테나로 표시되어 있습니다. 무게 중심의 계산은 왼쪽 (빨간색)과 오른쪽 (녹색) 안테나를 구별 할 수 있습니다. 각 안테나 (블랙 크로스)에 대한 antennal 팁은 말초 방향으로 가장 큰 값을 가진 클러스터에서 픽셀로 정의 할 수 있습니다.
그림 2. 촉각 PER 시설의 커브를 학습. 꽃가루의 일개미는 5 분 간 시험 간격으로 CS (촉각 자극)과 미국 (자당 솔루션) 다섯 pairings을 사용하여 훈련했다. 21 동물의 긍정적 인 반응의 비율은 자발적인 행동 (spont)과 두에 도시된다각 컨디셔닝 시험 후 CS의 반지 프리젠 테이션. 첫 번째 및 모든 다음 보상은 자발적인 행동 (피셔 정확한 확률 테스트, P <0.001) 크게 다를 후 PER의 비율이 관찰했다.
그림 3. 1 분의 기간 동안 antennal 팁 위치의 정규화 된 평균 분포. 각 벌의 antennal 팁 배포 동물 당 데이터 포인트의 총 수에 표준화되었다. 패널이 순진한 (왼쪽, N = 21) 및 설치된 꿀벌의 결과를 표시 (오른쪽, N = 21) 전 (A)과 자극 프리젠 테이션 (B) 중 A 1 및 A 2 :. 자극 프리젠 테이션 전에 자연 antennal 운동. 자리표는 일을 기준으로 antennal 팁의 측면 위치를 보여줍니다머리의 전자 센터 (그림 1C와 D와 비교). 종좌표는 antennal 팁의 말초 위치를 보여줍니다. 색상 규모는 antennal 단서가 주어진 위치에서 보낸 시간의 비율을 나타냅니다. 1. 분의 녹화 기간은 B 1 및 B 2 3000 비디오 프레임에 해당했다 : A 1,2에서와 같이 동일하지만, 자극 프리젠 테이션 동안 C 1과 C 2 :. antennal 끝이 안쪽에 자리 잡고 된에 프레임의 평균 개수 객체 영역, 즉 자극 표면에 원위 또는 근위 상대적으로 ± 3 통. C1 : 나이브 그룹, C2 : 설치된 그룹. 상자 수염 플롯은 중간, 말은, quartiles 및 분당 프레임 수의 5~95%의 백분위 수 범위를 보여줍니다. P = 5.39 * 10 -4, C 2 : 윌 콕슨 로그인 한 순위 테스트, C 1, 꿀벌의 두 그룹에서 '더 자극'(A)와 '경기 부양과'(B, C 사이에는 상당한 차이가 있습니다 -5). 촉각 자극 프리젠 테이션시 프레임의 평균 수는 순진한 꿀벌 (맨 - 휘트니 U 테스트, C 1 - C 2 : P = 0.007)에 비해 에어컨, 꿀벌에서 상당히 큰 것입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
꿀벌의 준비 : 수집 및 꿀벌이 동물의 낮은의 스트레스 수준을 유지하기 위해 신속하게 수행해야 수정하는 것입니다. 스트레스는 당 응답에 영향을 가지고 있으며, 따라서 꿀벌 19, 20의 학습 성과에 간접적 인 영향을 미칠 수 있습니다. 응력 수준은 신속하게 고정하기 위해 수집 한 후 즉시 직접 얼음에 꿀벌과 유리 병을 배치하여 감소 될 수있다. 그것은 꿀벌이 마취 기간 전에이 더 이상 회복하는 데 더 많은 시간이 필요한 것이 고려되어야한다.
비전 꿀벌 18에 촉각 학습에 부정적인 효과가 있습니다. 따라서 동물의 눈을 칠함으로써 비전을 윗니와 아랫니가 맞 물리다하는 것이 중요합니다. 비디오 레코딩의 시각적 대비를 높이기 위해, 그것은 (예 : Tipp-예) 흰색 페인트를 사용하는 것이 좋습니다. 케어는 페인트와 접촉의 안테나를하지 않도록해야합니다.
자세히 알아보기ING 성능 : 실험실 및 필드의 이전 연구는 꿀 벌 일개미의 자당 감도가 연관 학습 능력 21, 22에 영향을 미칠 것으로 나타났다. 높은 자당 감도는 긍정적 나은 촉감 수집 및 차별 공연과 상관 있습니다. 꿀 꿀벌 식민지의 화분 일개미는 평균 foraging 시즌 23 대부분의 주 과즙의 일개미보다 자당에 더 민감하게 반응합니다. 그들은 쉽게 뒷다리에 꽃가루로드에 의해 식별과 벌집 입구에 체포 할 수 있습니다. 높은 자당 감도와 꿀의 일개미는 9 월과 10 월 사이, foraging 시즌을 끝으로 잡은 할 수 있습니다. 그들은 하이브 23 일부터 약 20m를 게재 낮은 농축 설탕 물로 가득 인공 피더에서 선택할 수 있습니다.
학습 성능과 메모리 형성은 에어컨 25시 꿀벌의 포만 상태에 적극 따라 달라집니다. 더 이상 기아의 아름다운 요정OD 에어컨 전에, 예를 들면 밤, 연관 학습의 행동을 개선하고 동물의 동기 부여 수준을 높일 수 있습니다.
촉각 시설 : PER은 appetitive 학습 프로토콜 14 무조건 응답으로 사용됩니다. 따라서 모든 테스트 꿀벌이 완전히 에어컨하기 전에 무조건 자극 (설탕 자극)에 당 연장을 표시하는 중요합니다. 설탕 자극에 반응하지 않는 꿀벌은 에어컨 전에 촉각 자극과 antennal 연락 동안 PER으로 응답 꿀벌뿐만 아니라 폐기해야합니다. 그렇지 않으면,이 동물의 매우 낮거나 매우 높은 응답은 학습 곡선 혼란 것입니다.
이 프로토콜에 사용 된 촉각 자극 (수평 격자와 황동 큐브)가 무작위로 선정되었습니다. 꿀 꿀벌은 다양한 모양과 질감 (10 참조) 다른 촉각 자극에 에어컨이 될 수 있습니다.
꿀벌의 다른 그룹 (예 : 꽃가루 - 대의 과즙의 일개미)에 인수를 비교하려면 획득 점수는 21 계산 될 수있다. 이 점수는 CS에 설치된 응답의 총 수이며 0 (없음 당 완비), 5 (각 시설의 재판 후에 당 시설이 갖추어져) 사이의 범위를 갖는다.
비디오 분석 : 다른 비디오 분석 방법은 꿀벌 26, 27의 antennal 운동 행동의 변화를 정량화하기 위해 과거에 사용되었습니다. 우리의 방법은 MATLAB에서 이미지 처리 도구의 다양한 안테나 및 혜택에 반사 마커를 필요로하지 않고 antennal 움직임을 분석 할 수있는 이점이 있습니다. 예를 들어, 하나는 antenn의 타이밍을 분석 할 수 있습니다개체에 대한 알 연락처는 antennal 운동의 속도를 결정 몸의 축에 대한 언급 안테나의 각도 위치를 계산하는 데, 또는 왼쪽과 오른쪽 antennal 운동 사이에 차별.
설치된 꿀벌의 개체에 antennal 응답 녹화 중에 발생 PER은 안테나의 자동 감지를 사용하여 나중에 영향을 줄 수 있습니다. 이 경우는 VirtualDub에서 예를 들어 영화를 편집하고 코는 같은 모양의 회색 층으로 표시되는 부분을 포함하여 예 : 검색 과정을 방해 객체를 마스크 할 필요가 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 꿀벌에 촉각 학습 패러다임에 우리를 소개를 위해 요아킴 Erber 감사드립니다. 이 작품은 독일의 우수 프로젝트의 프레임 워크에 재정 지원 우수 277 CITEC의 클러스터에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pollen foragers, Apis mellifera L. | Private hives | ||
| Glass vials (22 x 45 mm) | Carl Roth GmbH Co | X655.1 | |
| Brass tubes, 10 x 30 mm | Self-produced | ||
| Brass cube, 3 x 5 mm | Self-produced | ||
| Tipp-Ex (solvent-free) | Tipp-Ex GmbH Co KG | ||
| Sucrose solution (30%) | Household suger diluted in water | ||
| Ethanol (70%) | Carl Roth GmbH Co | 9065.3 | |
| Syringe (1 ml) and needle (0.6 x 25) | Carl Roth GmbH Co | 59.1 | |
| Stop Watch | Carl Roth GmbH Co | L423.1 | |
| Micromanipulator | Märzhäuser MM33 | 00-42-101-0000 | |
| Digital video camera | Basler A602f-2 | ||
| Macro lens for camera | TechSpec VZM 200 | ||
| Matlab R2009b | The MathWorks |
References
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