Summary
우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을 제시
Abstract
선충류 C. elegans은 인간의 비만과 관련 pathologies와 관련된 지방 신진 대사를 조절 보존 유전자 경로의 연구에 중요한 모델로 등장했다. C.의 시각화를 위해 개발 된 여러 가지 이전 방법 elegans 트리글리 세라이드이 풍부한 지방 상점 지질 방울 이외의 다른 세포 구획을 강조, 잘못된 것으로 입증되었습니다. 다른 방법은 특수 장비를 필요로 시간이 많이 걸리는, 또는 일관성 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 C.의 중성 지질 방울의 정확하고 빠른 탐지를위한 급속한, 복사, 정착액 기반 나일 붉은 착색 방법을 소개합니다 elegans. 40% 이소프로판올의 짧은 고정 단계는 동물을 얼룩하는 데 사용됩니다 나일 빨강, 완전히 투과 동물을합니다. 이 lipophilic 염료의 스펙트럼 특성은 강력하고 선택적으로 노란색 - 녹색 스펙트럼 형광을 할 수 있도록하는 경우에만 지질이 풍부한 환경에서,하지만 작품극지 환경. 따라서, 지질 방울은 이소프로판올 만 간단한 나일 붉은 착색 단계 후 간단한 GFP 이미징 기능을 갖춘 형광 현미경에 시각화 할 수 있습니다. 속도, 경제성,이 프로토콜의 재현성은 이상적으로 높은 처리량 화면에 적합합니다. 우리는 또한 트리글리세리드 및 가스 크로마토 그래피 질량 분석계를 사용하여 - phospholipids의 생화학 결정에 대한 페어링 방법을 보여줍니다. 이 더 엄격한 프로토콜은 나일 강 빨간색 미세 지질 결정에서 얻은 결과의 확인으로 사용되어야합니다. 우리는이 기술이 C. 분야에서 새로운 표준이 될 것으로 예상 elegans 대사 연구.
Introduction
인간과 선충류의 Caenorhabditis elegans의 사이에 신진 대사 경로의 보존은 비만 연구를위한 강력한 모델 생물 수 있습니다. 동안 C. elegans는 포유류에서 같은 지방 저장에 전념 adipocytes가 없습니다, 그들은 지질 방울 1 점 트리글리세리드을 수행하고 지방 저장 및 에너지 사용 2,3의 동일한 규제의 많은 부분을 가지고 있습니다. C.에 지방 수준에 대한 분석에 elegans는 여러 가지 방법이 쉽고 성공의 다양한 수준과 제안되었습니다. 형광, 중요한 염료 4-7의 한 일반적인 사용은 최근에 달려 있으며,이 시약은 C.의 주요 지방 저장 창고에서 뚜렷한 구획을 얼룩 질에 입증되었습니다 elegans 1,8-11. 이러한 수단 검은 색과 오일 빨간 O와 같은 고정력있는 기반이 아닌 형광 염료, 웜 12-14에 지질 방울을 강조에 성공 fluores 등의 quantitation에 대한 큰 동적 범위로하지 않지만센트 염료 8,13,15. 또한, 형광 및 비 형광 모두 염료에 대한 고정의 현재 방법은 시간이 오래 걸릴 수 있으며 여러 냉동 해동 단계 및 / 또는 독성 화학 물질 1,9,10의 사용을 포함한다. 특정 BODIPY - 표시 지질 analogs의 사용은 단기 라벨 15 웜을 생활에 공급되면 지질 방울을 강조하는 것으로보고되었습니다. 그러나이 염료의 이해에 의존하기 때문에 C.에 의해 바이어스된다 BODIPY 지방산 analogs의 elegans 처리 및 신진 대사. 지질 착색 염료에 설립 된 대안은 지방 점포에게 10,16을 시각화하는 지질 분자의 특성 진동 특성을 활용 레이블이없는, 일관된 반 스톡스 라만 산란 (자동차) 또는 자극 라만 산란 (SRS) 현미경,이다 17. 그러나, 고가의 전문 장비는이 방법에 필요한이며, 처리량은 기껏 낮습니다.
빠른, 확장 성 analy에 대한 필요성을 충족하려면C.의 중성 지질 상점 언니 elegans 신진 대사 연구는, 우리는 정착액 기반 나일 붉은 지질 착색의 높은 재현 방법을 소설을 소개합니다. lipophilic 염료 나일 붉은 색의 스펙트럼과 물리 속성은 경우에만 지질이 풍부한 환경에서,하지만 더 많은 극지 환경 18에 녹색 발광 스펙트럼 형광을 할 수 있도록, 그 여기 - 방출 피크에서 노란색 - 금 스펙트럼 변화를 유도 19. 따라서 지질 방울은 형광 현미경에 대해 설정된 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터의 사용에 의해 간단하게 염색 한 후 검색 할 수 있습니다. 이 기술의 편리함과 경제성이 이상적으로 높은 처리량 화면에 적합합니다. 우리는 또한 트리글리세리드와 견고한 위상 추출 및 기체 크로마토 그래피 - 질량 분광법을 사용하여 phospholipids의 생화학 결정에 대한 쌍, 엄격한 방법을 보여줍니다. 생화학 지질 측정 C.의 나일 붉은 기반의 미세한 결정과 상관 관계 elegans FAt 질량과는 미세 지질 결정으로 만든 연구 결과의 확인으로 사용되어야합니다.
Protocol
1. 사각형 앰프 / Tet (A / T) LB 한천 플레이트와 NGM IPTG RNAi의 플레이트의 작성
A / T 판은 4 ° C.에서 사용하는 1-4주 전에 준비 어둠 속에서 저장해야
- 미디어 1 L에 대해 1 L 탈 이온수, 32g의 LB 한천, 1.5 ML 2 M NaOH, 그리고 2g Bacto 한천을 추가합니다. 액체 사이클 40 분 압력솥. 60 냉각 한 후에 ° C, 3 ML 테트라 사이클린 및 0.5 ML 암피실린을 추가합니다. 각 판에 미디어 45 ML 하거라.
사전에 최대 2 주까지 RNAi 판 96 - 웰 3 일 준비합니다.
- 1 L 탈 이온수, 3g NaCl, 17g 아가로 오스, 및 2.5 g의 bactopeptone : 25 96 - 웰 RNAi 플레이트를 뿌리고, 선충류 성장 미디어 (NGM) 1 L를 준비합니다. 121 압력솥 액체 사이클 ° C 저어 바있는 40 분. 60 ° C.에 핫 플레이트 세트에 감동, 멋진하자
- 1 ML 1 M MgSO 4, ML 5 MG / ML 콜레스테롤, 25 ML 1 M KH 2 : 때 60 쿨 ° C, 다음 주식 솔루션을 추가 4 (산도 6.0), 1 ML 1 M CaCl 2, 1 ML 200 MG / ML carbenicillin, 5 ML 1 M IPTG (조리법에 대한 자료 표 참조).
- 전자 다중 채널 pipettor을 사용하여 평면 바닥 96 - 웰 플레이트의 각도에 RNAi 미디어 150 μl을 투여. 공기 거품을 피하십시오. 분배하는 동안 60 ° C의 물을 욕조에 익숙해 멸균 스테인레스 스틸 소켓에서 미디어세요.
- 아가로 오스는 굳은 때까지 RNAi 플레이트 수준을 유지. 플레이트는 사전에 최대 2 주까지 부어과 4 ° C.에 저장할 수 있습니다
1 일
2. 사각형 앰프 / Tet (A / T) LB 한천 플레이트에 냉동 도서관 플레이트에 도장을 찍어
- 어둠 속에서 그들을 유지, 실내 온도에 A / T 접시를 따뜻하게.
- -80에서 전송 96 - 웰 RNAi 라이브러리 번호판 ° C 얼음을 건조합니다. 분젠 버너 근처의 알루미늄 밀봉 판을 엽니 다.
- 10 % 표백제로 (10 초마다) 순차적 핀을 immersing하여 96 핀 복제기를 검사, 70 %의 E에게 H 2 O는 deionized하고,토는 불꽃을 통해 핀을 통과하여 따라 갔다. EtOH 및 화염 단계를 반복합니다.
- 각 핀에 연락처 각 우물의 표면을 확인하는, 냉동 96도 RNAi의 글리세롤 주식에 레 플리 케이 터를 적용 할 수 있습니다.
- 피해 한천 표면없이 각 핀 작은 원을 그려, A / T 판에 기록합니다.
- -80에 다시 인감 및 반품 도서관 접시 ° C. 배양 37 박테리아 성장을위한 ° C 하룻밤에 A / T 접시를 스탬프.
2 일
3. 깊은 우물 블록에서 숙박 RNAi 박테리아 클론을 성장
- 37 ° C에서 A / T 접시를 제거하고 세균 성장을 확인합니다.
- 200 μg / ML carbenicillin과 LB의 1.5 ML로 96 - 웰 깊은 우물 블록의 각 우물을 입력합니다.
- 96 핀 레 플리 케이 (단계 2.3 참조) 소독하다.
- 확실히 핀은 각 세균의 RNAi의 클론과 접촉을 만드는 A / T 플레이트의 상단에 레 플리 케이 터를 적용 할 수 있습니다. 깊은 우물 블록에 레 플리 케이 터와 잠그다 핀을 들어 봐요. 소용돌이, 그리고 천천히 CE을 제거옆에 우물을 오염하지 rtain.
- 숨 쉬어 쉬운 필름으로 블록을 메 웁니다. 37 박 품다 ° C 교반과 (MT Infors Microtiteron II 선호 흔드는, 또는 25mm - 던져 흔들림 보육 250 RPM에서 950 RPM).
3 일
4. 96 - 웰 NGM RNAi의 플레이트로 씨 RNAi 세균 클론
- 4에서 96도 RNAi 플레이트를 제거 ° C, 룸 온도로 따뜻하게.
- 깊은 우물 블록을 제거하고 4,000 X g에서 10 분 원심 분리기.
- 신속하게 미디어를 배출하는 싱크에 블록을 반전하고, 초과 미디어를 제거하기 위해 종이 타월에 반전 기록합니다.
- 층류 흐름 후드에서 무균 영화 각 우물과 인감에 200 μg / ML carbenicillin과 LB의 40 μl를 추가합니다.
- 10 분 알약을 resuspend, 또는 수동주의 pipetting하여 알약을 resuspend하기위한 공간 온도 세균 흔드는로 블록을 반환합니다.
- 층류 흐름 후드에서부터 깊은 멸균 영화 및 전송 세균을 제거96 - 웰 RNAi 판 위에 잘 블록 떨어져 있습니다. 다른 모든 행에서 행 'A'와 'H', 35 μl에 resuspended 박테리아의 40 μl를 추가합니다. 더 많은 액체 overdrying와 아가로 오스의 균열을 방지하기 위해 96도 RNAi 판의 가장자리 우물에 추가됩니다.
- 건조에 대해 정기적으로 검사, 4-6 시간에 후드에 건조 발견 접시를 둡니다. 드라이 박테리아는 흐린하지, 분명히 나타납니다. 커버 플레이트를 반전하고 하룻밤 실온에서 알을 품다.
5. 웜의 동기 인구 준비
많은 gravid 웜으로 가득 두 10cm 플레이트는 매 6 96 - 웰 RNAi 판에 계란 준비를 위해 사용됩니다. 웜은 적어도 두 세대 (7 일) 비에 굶주린도록한다.
- 이전 20 설명 된대로 L1의 동기 인구를 준비합니다. 표백 솔루션의 20 ML를 들어, 한 ML NaOH (10 M), 5 ML은 H 2 O를 deionized, 10 ML M9 버퍼를 사 ML의 표백제를 사용합니다.
- 15 ML 멸균에 10 ML M9에서 하루 아침에 벌레를 동기화20 폴리 프로필렌 튜브 회전 ° C.
4 일
6. RNAi의 접시에 웜을 추가
- 1 분 3,000 XG에서 알 최상의 상태로 준비를 원심 분리기. L1 hatchlings의 펠렛에 빠지지, 표면에 뜨는을 대기음. 0.0005 % 트리톤 X-100과 5 ML M9 버퍼에 Resuspend. 세제의 작은 금액을 추가는 피펫으로 고집에서 웜을 방지하고 지방 착색에 영향을주지 않습니다.
- 현미경으로 벌레를 계산합니다. 필요한 경우, 마이크로 리터 당 10-15 벌레에 농도를 조정합니다.
- 층류 흐름 후드에 놓는 될 각 96 - 웰 플레이트에, 얕은 - 잘 분석 블록의 한 행의 각도에 resuspended 웜의 75 μl를 추가합니다. 수동 멀티 채널 피펫 사용하여 96 - 웰 RNAi 플레이트의 각도에 5 μl에 50-75 웜을 추가합니다.
- 접시는 30-60 분의 후드에 건조 할 수 있습니다. 때 건조 현미경으로, 웜은 대패하지 크롤링 할 나타납니다.
- RNAi 판에 벌레를 성장20 ° C ~ 64 시간에.
7 일
7. 수정과 나일강 빨간색으로 웜을 청바지
- 보육의 RNAi 판을 제거합니다. 이러한 조건 지방 질량에 영향을 미칠으로 현미경과 기록 굶주린 또는 탈곡 (습식) 추가 분석에서 제외 할 우물에서 검사합니다.
- 전자 반복 pipettor를 사용하여 150 μl PBS를 추가 0.01 % 튼 RNAi 판의 각 잘에 X-100. 96 깊은 잘 PCR 플레이트의 해당 행에 대한 웜과 수동 멀티 채널 pipettor, 믹스 및 전송 액체를 갖추고 있습니다. 한천을 방해하지 마십시오. 잘 당 PBS 300 μl 웜의 총 반복합니다.
- 네 접시가 전송 된 경우, 1 분에 500 rpm으로 접시를 원심 분리기.
- 우물의 맨 아래에 ~ 25 μl 액체와 웜 펠릿을 떠나지, 96 핀 진공 흡인기를 사용하여 표면에 뜨는을 대기음.
- 동물 문제를 해결하기 위해 각도에 이소프로판올 40 % 150 μl를 추가합니다. 웜를 섞어 충분히 높은 속도에 pipettor이 있는지 확인하십시오40% 이소프로판올과 펠릿. 3 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 원심 분리기 판은 1 분 500 rpm으로 발견.
- 잘 하단에 25 μl 40% 이소프로판올 + 웜 펠릿을 떠나지, 96 핀 흡인기 또는 수동을 사용하여 표면에 뜨는을 대기음.
- 40% 이소프로판올의 0.5 MG / 아세톤의 ML 일 당 ML 6 μl 나일 붉은 재고 솔루션 : 각도에, 사용하기 전에 바로 준비 나일 붉은 얼룩 솔루션 150 μl를 추가합니다.
- 인감 비 멸균 접착제 필름과 판 최소한 2 시간 동안 짙은 어둠 속 얼룩.
8. 높은 처리량 현미경에 워시 및 이미지 웜
- 1 분 500 rpm으로 원심 분리기와 나일강 붉은 색 염료를 제외한 모든 25 μl를 대기음.
- 와 0.01 % 튼 최소 30 분의 어둠 속에서 각 잘하고 저장할 X-100. PBS 150 μl를 추가합니다
- 1 분 500 rpm으로 원심 분리기.
- 이 X 7 μl 빠른 각 우물의 바닥에서 12 채널 pipettor, 기음 동물을 사용하여96 - 웰 테플론 인쇄 유리 슬라이드에 스트로크 등을 분배. 주의 깊게, 웜을 제거하지 않고, 슬라이드의 각 우물에서 PBS의 9.5 μl를 제거합니다. 귀하의 유리 슬라이드는 현미경 마운트에 직접 맞지 않을 경우, 사용자 정의 가공 알루미늄 슬라이드 홀더는 벌레를 마운트하는 데 사용되어야합니다.
- 96 - 웰 슬라이드로 천천히 낮은 표지 슬라이드. 이 단계는 거품을 방지 또는 기타 우물에 웜의 국경을 넘을 연습이 걸릴 수 있습니다. 접착제 압정으로 고정와 보안 코너.
- GFP / FITC 필터 시야 및 형광의 이미지 슬라이드 자동화 된 현미경을 설정합니다. photobleaching하는 것은 우물 사이의 인공 차이로 이어질 것이기 때문에 지질 신호 photobleaches는 쉽게 그것은 아닌 수동으로 모든 우물에 체계적인 방법으로 이미징해야합니다. 분석에 대한 자세한 내용은 대표 결과 및 토론을 참조하시기 바랍니다.
9. 고체 단계 추출 (SPE) 및 가스 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (GC / MS)를 사용 생화학 지질 결정
- 15 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브에 10 ML M9 버퍼 각 10cm 판에서 2,500-5,000 웜을 씻는다. 펠렛 1 분 500 XG에서 웜, 및 10 ML M9 버퍼로 다시 펠릿을 씻는다. 500 X g에서 펠렛 동물. 질소 구경에서 -80에서 액체 질소와 저장소에 250 μl 총 볼륨으로, 동결 ° C 떠나 대기음R은 나중에 처리 또는 직접 진행합니다.
- 웜 펠렛은 트리글리 세라이드 질량은 인지질 질량 8,13,21로 표준화 할 경우 9.3 단계로 바로 이동 할 수 있습니다. 수사관은 단백질 콘텐츠 나 DNA 콘텐츠를 정상화하고자하는 경우에는 웜 펠릿은 10 분, 4시 30 초에 30 초에서, ° C.를위한 목욕 sonicator에서 가장 높은 강도에 sonicated해야 단백질이나 DNA 정상화가 필요하다면, 5 μl 나누어지는를 제거하고 UV 분광 광도계를 사용하여 열을 정화 한 후 브래드 포드 시약 또는 이와 유사한 또는 총 DNA의 콘텐츠를 사용하여 총 단백질 농도를 결정한다.
- 스레드 붕규산 유리 관 메탄올 : 1.5 ML 2시 1분 클로로포름에 웜을 추가합니다. 유기 용제의 모든 송금이 유리 피펫을 사용하여 수행해야합니다.
- wiretrol 50 μl 피펫 사용하여, 50 μl에서 25 나노 미터 인지질 표준, 50 μl의 16.7 나노 미터 트리글리 세라이드 표준을 추가 할 수 있습니다. 두 표준 2시 1분 클로로포름에 용해되어야한다 : 메탄올, 단단히 덮인및 산화를 방지하기 위해 -80 ° C의 냉동고에서 빛으로부터 보호 질소 아래에 저장됩니다.
- 페놀 캡과 소용돌이와 캡. 매 15 분 vortexing, RT에서 1 시간에 압축을 풉니 다.
- 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기. 붕규산 문화 튜브에 시체없이 낮은 유기 단계를 전송합니다.
- 0.3 ML 0.9 % NaCl, 5 분 1,000 RPM의 소용돌이와 원심 분리기를 추가합니다.
- 수성 단계 중 하나에 전송하지 않도록하고, 신선한 붕규산 문화 튜브에 바닥 유기 층을 전송합니다.
- 질소에 따라 드라이 유기 단계. 시작 고체 상 추출 (SPE) 1 ML 클로로포름에 말린 지질을 resuspend. 또한, 인지질 교실, glycolipids, sphingolipids, diacylglycerols, triacylglycerols, 무료 지방산 및 콜레스테롤 에스테르 등의 독특한 지질 클래스에 대한 자세한 분리 및 분석을 위해, 얇은 층 크로마토 그래피는 C.에있는 와츠 실험실에 의해 개척 elegans (22)는 SPE 대신에 사용할 수 있습니다. 지질은 B하실 수 있습니다e는 HPLC와 질량 분석기로 분석해으로 분석 분수로 구분합니다. liquid-chromatography/MS (LCMS)에 의한 전체 - lipidome 프로파일의 정교한 방법은 23-26을 사용하실 수 있습니다.
- SPE 매니 폴드에 실리카 SPE 열을 조립. 3 ML의 클로로포름으로 미리 평형 열. 중력에 의해 흐름에 용매 할 수 있습니다.
- 첫 번째 분율 (TAG 분율)의 일환으로 스레드 붕규산 튜브에 흐름을 통해 수집, SPE 칼럼에 지질 샘플을로드합니다. 대부분의 중성 지질이 첫번째 1 ML 흐름을 통해 통과 할 것이다. 완전히 TAG 분수 관에서 흐름을 통해 수집 TAG 분율을 elute 할 수있는 3 ML의 클로로포름을 추가합니다.
- 제거하고 첫 번째 컬렉션 튜브를 캡, 깨끗한 수집 튜브로 교체하십시오. 메탄올 : 9시 1분 아세톤의 5 ML을 glycosphingolipids을 Elute. 우리는 정기적으로이 분수의 지방산 성분을 분석하지 않는 그러나, 그것은 귀중한 정보를 포함 할 수 있으며, 활용 추가적인 분석을 위해 메틸 에스테르와 무료 sphingoid 기지의 준비에 저장할 수 있습니다이전 27 설명 된대로 TAG 및 PL에 대한 이러한 별개의 전문 과정.
- 두 번째 스레드 붕규산 수집 관과 glycosphingolipid 수집 튜브를 교체합니다. 3 ML의 메탄올 (PL 분율)로 phospholipids를 Elute.
- 분수는 -80 ° C에서 질소 아래에 단단히 상한선이 시점에서 저장할 수 있습니다. 질소 미만의 지질을 정화 드라이. 33에서 건조 가열 블록에서 건조 속도를 ° C. 사람들이 마른 상태에서 산화에 특히 민감한로, 말린 형태로 지질을 저장하지 마십시오.
- vortexing 및 배양에 의한 메탄올 2 ML 2% H 2 SO 4 Resuspend 건조 지질 분수는 FAMEs를 만드는 55 ° C 물 목욕에 단단히 박 상한선. 주의이 크게 지질의 derivatization을 억제하므로 명예 반응에 절대적으로 물을받을 수 없습니다로 이동합니다. 우리는 하루 아침에 부화하여보다 효율적인 derivatization을 발견하고 문학이 암시 적은 지질 산화는 낮은 온도에서 발생 duriNG 명성 준비 28. 다른 더 빠른 방법은 메탄올에서 2 ML 2.5 % H 2 SO 4를 사용 70 또는 80 ° C 21,22,29에 하나의 시간 derivatize하는 것입니다.
- 다음 날 아침, 욕조에서 제거하고 냉각 할 수 있습니다. 각 태그와 PL 분율 그 다음에 1.5 ML H 2 O (반응을 해소하기 위해)와 0.3 ML 헥산을 (FAMEs를 추출 할 수)를 추가합니다. 힘차게 흔들어서 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기.
- 매우 신중하게 표준 피펫 또는 파스퇴르 피펫를 사용하는 상위 헥산 층을 제거합니다. autosampler 튜브로 분배. 이 GC 열 및 MSD를 파괴 할 것으로, 어떤 산성화의 메탄올을 포함하지 특정합니다.
- GC / MS로 모자 및로드 샘플. 샘플은 PTFE - 실리콘 - PTFE 스크류 캡으로 덮인 마이크로 삽입 애질런트의 유리 병에 헥산에 전송됩니다. 그것은 Supelcowax-10 (24079) 30m, 250 미크론 융합 실리카 모세관 컬럼을 장착 애질런트 질량 분석기로 분석해 모델 6890/5973N로 전송됩니다. 하나의 마이크로 리터는 정수를 주입OA splitless 유입은 250에 ° C 및 13.33 PSI Ultrapure 헬륨은 캐리어 가스를 사용 설정합니다. 프로토콜 실행은 분 당 일정한 한 ML에서 다음입니다 :
| 단계 | 교수 | 목표 온도 |
| 1 | 2 분을 잡아 | 150 ° C |
| 이 | ° C 당 분 램프 10 | 200 ° C |
| 3 | 4 분 잡아 | 200 ° C |
| 4 | 램프 5 ° C 당 분 | 240 ° C |
| 5 | 3 분 잡아 | 240 ° C |
| 6 | ° C 당 분 램프 10 | 270 ° C |
| 7 | 5 분 잡아 | 270 ° C |
3 분 용매 지연은 fil의 마모를 최소화하기 위해 MSD에서 사용ament. 이후 50 550 Daltons 사이의 질량은 270의 열 보조 온도 ° C.로, 150 ° C와 230 ° C에서 설정 MS 소스에서 MS 콰 드러 플 세트 검출
Representative Results
지방 착색 워크 플로우를 통해 촬영 된 이미징 플레이트의 예는 그림 1에 표시됩니다. 높은 지방 (DAF-2 인슐린 수용체 RNAi), 저지방 (내장 RNAi의 지질 저장 과립에 필요한 LPD-3 단백질), 작은 저지방 (fasn-1 지방산 synthase RNAi), 그리고 빈 벡터 (에 대한 특정 컨트롤 제어) 동물의 지방 수준에 따라 형광 강도의 변화, 그리고 GC / MS 분석 (그림 2)에 의해 결정 해당 지질 양을 보여줍니다. 발달 체포로 이어지는 유전자 inactivations이 작은 동물이 자주 관계없이 지방의 신진 대사에 어떤 연결 (그림 3), 성인 제어 동물보다 훨씬 낮은 지방을 가지고 나타납니다. 비슷한 발달 단계의 야생 형 제어 동물의 SPE-질량 분석기로 분석해으로 착색 분석 및 지질 생화학 등의 차 분석은의 유효성을 보장하기 위해 수행되어야합니다작거나 발달 긍정적 안타를 체포했다. fasn-1 RNAi (그림 2), L2 또는 L3 애벌레의 단계 중 하나의 동물 체포, 성인 제어 RNAi보다 낮은 지방 얼룩을 가지고 있지만 L2-L3 단계 제어 RNAi 동물 (지방 얼룩 %까지 풍부한 유사한의 경우 49.9 ± 4.5 fasn-1 RNAi와 20.2에 대한 % ± L2 제어 RNAi에 2.1 %, 그리고 64.7 ± L3 제어 RNAi에 대한 1.3) : 성인 제어 RNAi의. 또한, 생화학 분석 (: 22.5 ± fasn-1 RNAi와 46.1에 대한 2.9 ± 무대 일치 제어 RNAi, P ≤ 0.05에 3.4 TAG / PL) N2 제어 동물을 일치 L2 단계보다 낮은 TAG / PL 비율을 지적했다. 따라서이 경우에는 fasn-1이 아니라 지방 덩어리에 불과 무대에 특정한 감소보다 지질 창고에서 역할을 가지고 생화학 분석을 통해 확인하실 수 있습니다.
이미징 웜의 후속 분석을 사용하여 이러한 셀 프로파일 러 등의 전산 플랫폼에 크게 의존WormToolbox 30. 이미지의 작은 숫자를 들어, NIH에서 자유롭게 사용할 수 ImageJ, 같은 공개 이미지 분석 플랫폼은 사용할 수 있습니다. 우리의 분석을 위해, 독특한 MATLAB 스크립트는 잘을 식별하고, 이후 빈 우물이나 거품이있는 사람들을 제외하고, 웜의 작은 파편을 구분 먼저 사용되었다. 수동 품질 관리는 위에서 언급 한 이유로 제외 신고 이미지에 필요한이었다. 우리는에서 경험적으로 웜 픽셀의 90번째 퍼센트 강도를 발견 잘, 웜 개발의 모든 단계 (그림 3)에서 강도를 얼룩의 측정 항목을 일관성 제공하는 잘 통해 웜 지역에 정상화. , 웜의 지역에 총 지방 질량을 통합 반대로, 큰 희미 웜과 equivalently 작은 밝은 웜의 점수를 노력하게 할 것입니다. 우리의 방법은 강도 퍼센트를 복용에서, 웜의 지역에 총 형광 신호를 통합하지 않기 때문에, 본질적으로 웜의 크기의 변화는 이런 짓을하지t 편견은 강도가 측정. 대신, 픽셀 강도 분포의 차이가 측정됩니다. 그러나,이에도 불구하고, 발음 차이는 서로 다른 발달 단계의 동물 사이의 픽셀 강도 분포를 얼룩에서 볼 때문에 비교 발달 단계 (그림 3)의 동물에 대한 모든 유전자에 대한 RNAi의 효과를 연구하는 것이 중요합니다 수 있습니다. 복제 사이의 평균 변화는 지방 착색 방법의 높은 재현성을 나타내는 그림 4에 표시됩니다. 방법의 강도가 동일한 노출 시간을 사용하여 균일 한 조명 조건 하에서 각 플레이트에 대해 품질 이미지를 얻는 방법에 크게 의존합니다, 그리고 최소한의 거품, 쓰레기, 기타 우물에 웜의 크로스 오버로.
SPE는 태그가 PLS (그림 5A)에서 분리 할 수 할 수있는 정도를 확인하기 위해 기준을 정화, 사전 혼합에서 수행되었다. 이 분석에서, 우리는 100 % s을 (를) 달성TAG와 PL의 eparation는 TAG 샘플에서 PL에서 파생 17시 지방산과 PL 샘플의 TAG (그림 5A)에서 파생 된 13시 지방산 해당 완전한 부재의 전체 부재로 지적했다. 따라서 SPE는 지질 클래스를 분리에 매우 효율적입니다. 이 분석은 다른 체인 길이의 모든 태그는 SPE에 의해 equivalently 정화와 유사한 효율을 질량 분석기로 분석해 의해 감지 될 것을 나타냅니다하지 않습니다. 단지 그 총 TAG와 PL의 지질이 완전히 서로 분리되어 보장합니다.
고체 위상 추출 및 명성 준비를 통해 촬영 N2 야생 유형 동물의 샘플 GC-MS 추적은 그림 5B에 표시됩니다. TAG와 PL 모두를 들어, 봉우리는 유지 시간 및 질량 스펙트럼에서 부모와 딸 이온, 그리고 각각의 내부 표준의 영역으로 표준화 된 식별 봉우리 아래 총 면적에 따라 식별 할 수 있습니다. TAG의 정규화 된 금액이 지역을 확인하려면태그 크로마토 그램의 모든 봉우리 아래에있는 13시 표준 제외하고, 함께 추가 된 및 13시 정상 아래에있는 영역으로 나눈 값입니다. 마찬가지로, 17시 표준을 제외한 정규화 된 총 PL 금액, 모든 봉우리 아래 공간을 결정하기 위해 함께 추가 17시 정상 아래에있는 영역으로 나눈했다. TAG 및 PL 샘플의 정규화 된 값은 다음 예제에 대한 최종 TAG / PL 비율을 계산하는 데 사용됩니다 :
그것은 SPE-질량 분석기로 분석해의 데이터가 PL 비율 총 TAG의 간단한 계산보다 각 지질 분획에 존재하는 지방산 훨씬 더 정교한 분석을 허용 있다는 것을 알아야한다. 예를 들어, 탐정은 단일 지방산에 해당하는 하나의 피크를 통합 할 수 있으며 (예 : C 샘플에 따른 표준화 된 풍부한을 비교DAF-2 RNAi PL 17시 표준 피크 지역으로 나누어 총 PL 질량에 정규화 된 13시 표준 피크,)로 구분 18시 피크의 통합 영역 대비 N2 야생 유형에 omparing :
탐정을 선택해야, 또한 지방산의 총 금액의 비율로 TAG 나 PL의 분수에 주어진 지방산의 비율을 결정하는 것이 가능하다 (N2 웜의 TAG 분율의 예 18시로 quantitated ) :
1 그림. 전체 실험에 대한 일반적인 워크 플로우. 일 1, 냉동 RNAi 라이브러리 플레이트는 앰프 / Tet LB 한천 플레이트에 스탬프를 37 ° C.에 incubated 아르 일 2, 앰프 / Tet 플레이트는 깊은 우물 블록에서 RNAi 클론의 씨앗 액체 문화에 사용됩니다. 3 일, 박테리아는 원심 분리하여 농축하고 96도 RNAi 판으로 전송됩니다. 4 일, L1 hatchling C. elegans는 액체에 RNAi 판에 추가 건조 할 수 있습니다. 7 일, 동물 96 잘 테플론 슬라이드에 장착, 40 % 이소프로판올에 나일강 붉은 색으로 물들, 액체에서 수집 및 높은 처리량 현미경으로 이미징하고 있습니다.
그림 2. 주요 정착액 기반 나일 붉은 얼룩
그림 3. 지방 질량이 다른 애벌레의 단계에서 고정 나일 붉은 착색에 의해 결정. 동물은 OP50 박테리아에 성장하고 L1에서 수집 된, L2, L3, L4 및 gravid 성인 발달 단계. 이미지는 고정 착색에 따라 캡처 90 일 백분위 O를 결정하기 위해 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용하여 분석 하였다확인 된 웜 지역의 F 픽셀 강도. 동물의 지질 수치가 동물 L2에서 L4 단계로 개발로 크게 증가하고 동물이 성인 무대에 germline의 확산으로 칼로리를 돌려 시작으로 약간 감소합니다. 표시 데이터 ± 고약 6-8에 대한 SEM은 복제 (**, P unpaired 두 개의 꼬리 T-테스트에 의해 결정 gravid 성인에 대한 ≤ 0.0001 상대적).
4 그림. 독립적 인 생물에서 높은 재현성은 복제합니다. 표시는 생물 전체 나일 붉은 색 형광 강도의 분산 형 플롯이 복제 (N = 6-8). 각 복제를 들어, 모든 값은 빈 벡터 제어의 평균 강도에 표준화되어 있습니다. 데이터가 표시 ± SEM은 (**, P unpaired 두 개의 꼬리 T-테스트에 의해 결정 제어 ≤ 0.0001 친척, 가정 하시네요동일한 분산).
그림 5. GC-MS SPE의 chromatograms는 표준과 야생 타입 태그와 PL의 풍요 로움을 분리. (A) GC-MS의 흔적이 태그와 PL 표준의 SPE 분리 표시됩니다. PL에서 TAG의 완전한 분리 (tritridecanoin) (1,2 - diheptadecanoyl-SN-glycero를 나타내는, PL 추적에 13시 지방산의 전체 부재와 TAG 추적에 17시 지방산의 해당 부재를 확인 -3-phospho - (1'-RAC-글리세롤)). N2 야생 동물 먹이 종류의 벡터 제어 RNAi (L4440 빈 벡터 RNAi와 HT115 박테리아)의 샘플에서 태그와 PL의 (B) A 대표 풀 스펙트럼. 샘플 중 하나 마이크로 리터는 프로토콜에 따라 애질런트 6890/5973N 질량 분석기로 분석해로 주입되었고, 각각의 봉우리는 rete에 의해 식별 된ntion 시간과 각각의 질량 스펙트럼. 약어 : cyclo, cyclopropane 지방산, ISO :. ISO-메틸 분지 사슬 지방산, GLA, 감마 리놀렌산, 알라, 알파 리놀렌산, DGLA, dihomo 감마 linolenic 산, EPA, eicosapentaenoic 산성 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
제시 프로토콜은 C.의 지질 수준의 신속하고 대규모 검진을 허용 쉽게 높은 처리량 화면에 적용 할 수 elegans. 여러 동결 - 해동 사이클 8,10 다음 paraformaldehyde의 긴 고정 단계를 포함 이전에 사용한 방법과 달리, 우리의 프로토콜은 이소프로판올에서 간단한 3 분 고정이 필요합니다. 우리는 발견 한 그 C. 얼룩으로 40% 이소프로판올의 elegans, 그들은 추가 냉동 해동 또는 고정 단계를 사용하지 않고, 나일 빨간색으로 자유롭게 투과된다. 나일 빨간색 선택적으로 녹색 스펙트럼 18,19,31의 소수성 구획에 fluoresces으로도, 더 destaining이 필요하지 않습니다. 총, 동물 불과 2.5 시간에 스테인드와 준비가 이미지 동물 RNAi 판에서 촬영 할 수 있습니다. 이 방법은 상대적으로 저렴하고 높은 재현성과 수행 할 수 있습니다. 방법은 C.의 능력에 의존하지 않습니다 이해하거나 집중하는 elegans따라서 염료,하고 중요한 염료를 사용하여 기반 방법을 먹이와 같은 제한이 없습니다. 재현성 및 측정의 정확성을 감안할 때, 방법은 RNAi에 의해 유전자 inactivations 많은 수의 검사에 적합합니다. 지질 수준의 quantitation이 고착 력있는 나일 붉은 착색에 따라 필요하다면, 우리는 생물은 해당 컨트롤 및 적용 통계 테스트를 복제 4-6의 사용을 권장합니다.
이 작은 동물로 이어지는 많은 유전자 inactivations (지연되거나 체포 개발을 일으키는 RNAi의 클론으로 인해)는 관계없이 지방의 신진 대사에 어떤 연결, 지방 당국의 화면이 나오는 것을 가능성이 높습니다. 우리가 웜 영역으로 형광 강도를 정규화하여 다양한 크기의 벌레에 대한 계정을 이용하여 이미지 분석 프로그램을하는 동안 각각의 연구자도 비슷한 발달 단계의 야생 형 동물 작은 동물의 지방 착색 수준을 비교하는 것이 좋습니다. 의명백한 저지방 대량으로 작거나 발달 체포 동물의 경우, 우리는 단일 양상이 변경된 지질 대사를 입증하기에 충분하지 않습니다하는 것이 좋습니다. SPE-질량 분석기로 분석해 등 여러 가지 후속 실험은, 이러한 유전자의 지질 규제 기능을 확인할 필요 할 수있다. 알려진 신진 대사 조절에 대한 fasn-1, SPE-질량 분석기로 분석해 분석 발달 일치 N2 L2 제어 동물에 비해 것은 성인 제어 동물에 비해 발견 된 명백한 저지방 표현형을 확인하기 위해 필요했다. 나일 빨간색 지방의 착색이 무대 일치 L2 제어 RNAi 동물에 비해 성인 RNAi를 제어 할 상대 낮은 지방 수준을 표시하지만, 더 명백한 차이는 볼 수 없습니다. 따라서, fasn-1 RNAi는 무대 일치 L2 제어 RNAi 동물의 생화학 적 구별하므로 fasn-1이, 지방 질량의 진정한 레귤레이터인지 확인하기 위해 두 번째 방법을 필요 TAG / PL 비율의 예 생화학 정량화를했습니다 사용합니다.
20 일 또는 테플론 인쇄 종래의 사이즈에 장착 웜에서 이미지를 캡처하는 데 사용할 수있는 8-12 아니라 현미경 슬라이드 . 유일한 제한은 빠르게 나일 붉은 photobleaches 물들 지질 방울의 녹색 형광으로 체계적인, 균일 한 노출 조건 이미지 사이에 comparability을 보장하기 위해 사용해야한다는 것입니다. 우리는 균일 한 이미지 수집 조건에 완전히 자동화 된 현미경이 효과에 가장 적합한 것을 알게됩니다.
이 프로토콜의 위대한 장점 중 하나는 이미지가 수집 된 후 그들은 다시 분석 미래를 위해 저장 될 수 있다는 것입니다. 동일한 이미지가 지방 콘텐츠를 제공 할뿐만 아니라 몸 크기를 결정하는 데 사용 될 수 있습니다. 계산 프로그램 고급 될 때 또한, 통계적으로 의미있는 결과를 생성, 단일 웜 분석을위한 전망이하나의 잘에서. 따라서 높은 처리량 현미경을 이용하여 우리의 방법은 형광 신호를 32,33을 수량화하기 위해 Copas Biosort를 사용하여 게시 화면 방법론을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 방법론은 확실히 무료입니다.
SPE 및 GC / MS에 의한 지질의 콘텐츠 정밀, 생화학 결정은 C.의 주요 지방 점포의 나일 붉은 얼룩을 확인 elegans. 정착액 나일 붉은 착색 및 생화학 지질 결정에서 달성 절대 quantitation은 종종 완벽하게 일치하지 않지만, 두 가지 방법이 질적 동의 높은 재현, 통계적으로 의미있는 결과를 생산하고 있습니다. 또한이 방법은 glycosphingolipids, phospholipids, 또는 다양한 샘플에서 트리글리세리드 존재하는 별도의 클래스의 추가 분석이 필요할 수 있습니다 개별 연구자의 특정 요구를 충족하도록 맞춤 할 수 있습니다. 그것은 다른 그룹 기술 다른 THA를 사용한 것을인지해야합니다N SPE는 GC / MS 22 전에 지질 클래스를 분리합니다. 얇은 층 크로마토 그래피 (TLC)와 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 사람들이 (phosphatidylcholine, 극성 지질의 더 나은 별도의 구분 중성 지질 (예 : TAG, diacylglycerols, 무료 지방산 및 콜레스테롤 에스테르) 할 수있을 점에서 SPE 이상의 장점이 있습니다 phosphatidylethanolamine)과 글리콜 - sphingolipids. 이 물질 (2,500-5,000 웜)를 시작 최소 요구하기 때문에 우리는 SPE 선택은 중성 지질 분획 4의 대부분을 구성하는 주요 장기 에너지 저장, 태그를 강조하고, 빠른 속도이며, 더 전문적인 장비를 필요로하지 않거나 접시. 이것은 표준 혼합물에 따라 점을 강조해야 SPE는 완전히 PLS에서 태그를 분리하고, (그림 5A 참조) 높은 재현하고 신뢰할 수 있습니다. 지방산 메틸 에스테르의 quantitation 및 분석은 GC / MS을 필요로하지만,이 장비는 일반적으로 이용이 가능하며, 그렇지 않으면 로컬, 샘플 수도 있습니다위와 같이 생성하고 공동 작업자 또는 상업적 GC / MS 서비스에 의해 분석이 배치 될 때까지 -80 ° C에서 질소에 저장됩니다.
질량 분석기로 분석해 출력은 각 지질 종의 각 지방산의 고해상도 데이터를 포함합니다. 이 비교 샘플 사이의 자세한 차이점 결정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 탐정은 특정 지방산의 수준 DAF-2, LPD-3 fasn-1 RNAi 대 벡터 제어에서 다른 사람보다 훨씬 풍부하게 변경되었는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 엄청난 강력한 도구 따라서 지질 종은 어떤 실험 조작 풍부하게 변경되는에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.
우리의 분석을 위해, 우리는 가장 자주 PL 질량에 TAG 질량을 정상화. 단백질이나 DNA도 sonicated 웜 펠릿의 나누어지는의 결정에 따라 지질 질량을 정상화하는 데 사용할 수 있지만, 이러한 방법 INT 될 수 있습니다 것을 발견모든 pipetting 단계에서 각 추출에서 샘플 복구에 roduced 인간의 오류가 발생합니다. 우리가 대신 우리의 정규화 요소로 PL 질량을 사용하도록 선택한 이러한 이유에서입니다. 부 자연스러운 표준 프로토콜의 시작 (TAG에 대한 tritridecanoin, 1,2 - diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho - (1'-RAC-글리세롤) PL에 대한)에 도입 된 고체 위상 추출의 단계를 수행하고 명성 준비, TAG 및 PL의 분수 모두의 양적 및 대표 복구를 보장합니다. 조사관 TAG 질량을 정상화하기 위해 단백질이나 DNA를 사용하는 경우 동일한 보장 할 수는 없습니다. 우리는 PL이 샘플에서 TAG 수준을 비교하는으로 가장 강력한 게이지 할 생각이 이전에 PL 만 일분 TAG 수준, 예를 들어 확장 기아의 대형 질량 변화를 effecting 같은 자극에 의해 변경 또는 운동을 34 증가하는 것으로 나타 되었기 때문에 - 36. PL은 막 유동성 및 셀룰러 inte을 보장, 구조 역할을 것으로 생각되고grity하고 오히려 에너지 저장 37-39로보다 신호 역할. 손에서 TAG / PL 비율이 가장 가까운 나일 붉은 색과 정착액 기반 지질 착색 얻은 무엇 일치하고, 다른 그룹 21에 의해 발견과 함께 동의합니다. 다른 전략은 지질 TAG의 비율이 총 지질 9,22,29 비해 계산됩니다 와츠 연구소에 의해 사용됩니다.
TAG 및 PL 표준이 아닌 기본 형식의 사용은 기본 지방산이 정상화 계산에 포함되지 않습니다 보장합니다. 체인 길이의 선택은 순전히 기본 지방산의 질량 스펙트럼에 영향을주지 다음 표준의 필요성에 기반을두고 있습니다. 우리는 13시와 17시의 지방산이 목적에 가장 역할을하는 것으로 확인되었습니다. 우리 부 자연스러운 지방산 표준은 모든 체인 길이 지방산 또는 비교와 체인의 복구를 대표하지 않을 수 있다는 짧은 사슬 지방산의 서로 다른 화학 속성을 주어진 수 있습니다erent 포화 지표. 따라서이 SPE 또는 질량 분석기로 분석해 동안 우리가 정화 또는 다른 체인 길이의 지질 사이 검출의 효율성의 차이를 볼 수 가능성이 있습니다. 이것과 질량 분석기로 분석해에서 다른 지방산의 다른 이온화를 바탕으로, 그것은 특정 지방산의 풍부한에 대한 절대 성명을 발표 할 수 없습니다. 따라서, 우리는 특정 지방산의 단일 실험 abundances에서 샘플 사이의 비교합니다. 사람이 절대적으로 한 방식으로 지방산을 quantitate하기를 원한다면 이것은이 될 수 있도록, 위의 그 또는 이와 유사한 지방산의 안정적 isotopically 표시 13 C 버전의 알려진 양의 마약을 준비 예제를 실행하는 것입니다 달성 할 수 예를 들어, MSD의 부모 이온의 질량에 따라 구별. 우리가에만, 비용의 최소 지질 클래스의 상대적인 양 또는 특정 지방산을 우리 13시 TAG와 17시 PL 표준이 적절하게이 목적을 위해, 비교되는 감안할 때각 지질 클래스의 적절하고 대표 복구를 보장합니다.
이 시점까지, 다양한 방법론에 의해 얻어진 특정 결과의 해석,와 일반적인 방법론이 있어야 무엇인지 합의의 부족이있었습니다. 전체 그것은 고립에 아무도 방법이 이상적 C.의 지방 신진 대사를 공부하기 적합하지 않습니다 것을인지해야합니다 elegans. 그러나, 여러 검사 및 검증 modalities를 사용하여, 하나는 지질 규제 유전자를 획득 데이터에 대한 자신감을 얻을 수 있습니다. 우리 프로토콜 C. 분야에서 미래의 작업에 대한 벤치 마크 역할을 할 따라서, 우리는 예정 elegans 지방 연구.
Disclosures
저자는 공개 할 충돌 관심이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 토론 및 원고를 읽기 위해 기술 지원 및 Lianfeng 우에 마이클 Kacergis 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NIDDK (AAS에 K08DK087941), NIH / NIDDK 훈련 보조금 (ECP로 5T32DK007028), 노화 상 (AAS까지)에서 엘리슨 의료 재단 뉴 학술 및 찰스 H에서 경력 개발 상에 의해 지원되었다 . 후드 재단 어린이 건강 연구 상 (AAS까지).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
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References
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