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Biology

बायोकेमिकल और उच्च Throughput वसा द्रव्यमान का सूक्ष्म आकलन Published: March 30, 2013 doi: 10.3791/50180
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences, Massachusetts Institute of Technology

Summary

हम अध्ययन के लिए मजबूत जैव रासायनिक और सूक्ष्म तरीके प्रस्तुत

Abstract

निमेटोड सी. एलिगेंस संरक्षित आनुवंशिक वसा के चयापचय को विनियमित करने के रूप में यह मानव मोटापा और उसके संबंधित विकृतियों संबंधित रास्ते के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल के रूप में उभरा है. पिछले कई सी. के दृश्य के लिए विकसित के तरीके एलिगेंस ट्राइग्लिसराइड अमीर मोटी दुकानों को गलत हो सकता है, सेलुलर लिपिड बूंदों के अलावा अन्य डिब्बों को उजागर करने के लिए सिद्ध कर दिया है. अन्य विधियों विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, समय लेने वाली हैं, या असंगत परिणाम निकलेगा. हम सी. में तटस्थ लिपिड बूंदों के सही और तेजी से पता लगाने के लिए तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, लगानेवाला आधारित नील लाल धुंधला विधि परिचय एलिगेंस. 40% isopropanol में एक छोटी नियतन कदम पूरी तरह से नील लाल, है जो फिर जानवरों दाग के लिए प्रयोग किया जाता है पारगम्य जानवरों बनाता है. इस lipophilic डाई के वर्णक्रमीय गुण यह दृढ़ता और चुनिंदा स्पेक्ट्रम पीले, हरे प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देते हैं लिपिड युक्त वातावरण में ही है, लेकिन अधिक नहीं जबध्रुवीय वातावरण. इस प्रकार, लिपिड बूंदों केवल एक संक्षिप्त isopropanol में नील लाल धुंधला हो जाना कदम के बाद एक फ्लोरोसेंट सरल GFP इमेजिंग क्षमता के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर देखे जा सकते हैं. गति, सामर्थ्य, और इस प्रोटोकॉल के reproducibility यह आदर्श उच्च throughput स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं. हम भी ट्राइग्लिसराइड्स और गैस क्रोमैटोग्राफी जन - स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर phospholipids के जैव रासायनिक निर्धारण के लिए एक जोड़ी विधि प्रदर्शित करता है. यह अधिक कठोर प्रोटोकॉल नील लाल सूक्ष्म लिपिड दृढ़ संकल्प से प्राप्त परिणामों की पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम आशा करते हैं कि इन तकनीकों नए मानकों सी. के क्षेत्र में हो जाएगा एलिगेंस चयापचय अनुसंधान.

Introduction

मनुष्य और निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस के बीच चयापचय मार्ग के संरक्षण यह मोटापे के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव बनाता है. जबकि सी. एलिगेंस adipocytes स्तनधारियों में की तरह वसा भंडारण के लिए समर्पित नहीं है, वे दुकान ट्राइग्लिसराइड्स लिपिड बूंदों 1 में करते हैं और वसा भंडारण और ऊर्जा का उपयोग करें 2,3 की एक ही नियामकों के कई अधिकारी. सी. में वसा के स्तर के लिए परख एलिगेंस, कई तरीकों आसानी और सफलता के स्तर पर अलग से एक प्रस्ताव किया गया है. फ्लोरोसेंट, महत्वपूर्ण 4-7 रंगों के एक बार आम उपयोग हाल ही में प्रश्न में बुलाया गया था, और इन अभिकर्मकों एक मुख्य सी. वसा भंडारण डिपो से अलग डिब्बे धुंधला हो साबित कर दिया 1,8-11 एलिगेंस. लगानेवाला आधारित सूडान काला और तेल लाल O जैसे गैर फ्लोरोसेंट रंजक, जबकि 12-14 कीड़ा में लिपिड बूंदों को उजागर करने में सफल है, एक बड़े गतिशील रेंज fluores रूप quantitation के लिए नहीं हैप्रतिशत 8,13,15 रंजक. इसके अलावा, दोनों फ्लोरोसेंट और गैर फ्लोरोसेंट रंगों के लिए निर्धारण के मौजूदा तरीकों समय लेने वाली हैं और कई कदम फ्रीज पिघलना और / या विषाक्त 1,9,10 रसायनों के उपयोग शामिल है. विशिष्ट BODIPY लेबल लिपिड analogs का उपयोग करने के लिए लिपिड बूंदों को उजागर जब अल्पकालिक 15 लेबल के साथ रहने वाले कीड़े खिलाया करने के लिए सूचित किया गया है. हालांकि इस डाई तेज पर निर्भर करता है और इसलिए सी. द्वारा पक्षपातपूर्ण एलिगेंस और BODIPY फैटी एसिड analogs की हैंडलिंग चयापचय. एक स्थापित लिपिड धुंधला रंगों के लिए वैकल्पिक लेबल मुक्त, सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन (कार) बिखरने या उत्तेजित रमन (एसआरएस) के बिखरने माइक्रोस्कोपी, जो लिपिड अणु की विशेषता कंपन गुणों का लाभ लेने के लिए मोटी दुकानों 10,16 कल्पना है, 17. हालांकि, इस विधि के लिए महंगी विशेष उपकरणों के लिए आवश्यक है, और throughput में सबसे कम है.

तेजी से, स्केलेबल analy के लिए एक की जरूरत को पूरातटस्थ लिपिड दुकानों के सी. में सीस एलिगेंस चयापचय अनुसंधान, हम एक उपन्यास परिचय, लगानेवाला आधारित नील लाल लिपिड धुंधला हो जाना अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि. Lipophilic डाई नील लाल वर्णक्रमीय और भौतिक गुणों अपने चरम उत्तेजना उत्सर्जन में एक बदलाव पीले सोने वर्णक्रमीय प्रेरित, यह हरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में केवल जब एक लिपिड युक्त वातावरण में नहीं है, लेकिन अधिक ध्रुवीय 18 वातावरण में प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देता है 19. इस प्रकार लिपिड बूंदों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए निर्धारित एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिल्टर (GFP) के उपयोग के द्वारा सरल धुंधला हो जाना के बाद पता लगाया जा सकता है. आसानी और इस तकनीक का सामर्थ्य यह आदर्श उच्च throughput स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाते हैं. हम भी एक जोड़ी, ट्राइग्लिसराइड्स और ठोस चरण निष्कर्षण और गैस क्रोमैटोग्राफी, मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग phospholipids के जैव रासायनिक दृढ़ संकल्प के लिए कठोर विधि प्रदर्शित करता है. बायोकेमिकल लिपिड माप लाल आधारित नील सी. सूक्ष्म दृढ़ संकल्प के साथ संबद्ध है एलिगेंस पिताटी, और बड़े पैमाने पर सूक्ष्म लिपिड दृढ़ संकल्प के साथ किए गए निष्कर्षों की पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

Protocol

1. आयताकार Amp Tet / (ए / टी) लेग अग्रवाल प्लेट्स और एन जी एम IPTG आरएनएआई प्लेट्स की तैयारी

ए / टी प्लेटों 1-4 सप्ताह पहले तैयार किया जाना चाहिए और उपयोग करने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत

  1. मीडिया के 1 एल एल 1 विआयनीकृत पानी, 32 छ लेग अगर, 1.5 मिलीलीटर 2 एम NaOH, और 2 जी Bacto अगर जोड़ने. आटोक्लेव तरल चक्र पर 40 मिनट. 60 के लिए ठंडा करने के बाद डिग्री सेल्सियस, 3 मिलीलीटर टेट्रासाइक्लिन और 0.5 मिलीलीटर एम्पीसिलीन जोड़ने. प्रत्येक थाली में मीडिया के 45 मिलीलीटर डालो.

96-अच्छी तरह से तैयार आरएनएआई प्लेटें अग्रिम में 3 दिन 2 सप्ताह का समय है.

  1. एल 1 विआयनीकृत पानी, 3 जी NaCl, 17 ग्राम agarose, और 2.5 छ bactopeptone: 25 96 अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटें डाल, निमेटोड विकास (एन जी एम) मीडिया का 1 एल तैयार. 121 में आटोक्लेव तरल चक्र ° सी हलचल बार के साथ 40 मिनट के लिए. शांत करते हैं, एक गर्म थाली सेट पर 60 डिग्री सेल्सियस सरगर्मी
  2. 1 मिलीग्राम 1 एम 4 MgSO, 1 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल 5 मिलीग्राम / एमएल, 25 मिलीलीटर 1 एम 2 KH: जब 60 के लिए शांत ° C, निम्नलिखित स्टॉक समाधान जोड़ने 4 पीओ (पीएच 6.0), 1 मिलीग्राम 1 एम 2 CACL 1 मिलीग्राम, 200 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन, और 5 मिलीग्राम 1 एम IPTG (व्यंजनों के लिए सामग्री तालिका देखें).
  3. एक फ्लैट तली 96-अच्छी तरह से एक इलेक्ट्रॉनिक multichannel pipettor का उपयोग प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में आरएनएआई मीडिया के 150 μl बांटना. हवाई बुलबुले से बचें. एक बाँझ स्टेनलेस स्टील वितरण जबकि 60 डिग्री सेल्सियस नहाने के पानी में डूबे गोदाम में मीडिया रखें.
  4. आरएनएआई प्लेटें स्तर रखें जब तक agarose solidifies. प्लेट्स 2 सप्ताह डाला कर सकते हैं और अग्रिम में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत

1 दिन

2. आयताकार Amp / Tet (ए / टी) लेग अग्रवाल प्लेट्स पर जमे हुए लाइब्रेरी प्लेट्स स्टाम्प

  1. गर्म कमरे के तापमान को एक टी / प्लेटें, उन्हें अंधेरे में रखने.
  2. स्थानांतरण -80 से 96 अच्छी तरह से आरएनएआई पुस्तकालय प्लेटें ° C बर्फ करने के लिए सूखी. एक लैम्प बर्नर के पास एल्यूमीनियम सील प्लेट खोलें.
  3. पिन serially (10 सेकंड प्रत्येक) 10% ब्लीच में डुबो कर एक replicator 96-पिन जीवाणुरहित, एच 2 हे विआयनीकृत, और 70% का ईतो एक लौ के माध्यम से गुजर पिन द्वारा पीछा किया. EtOH और लौ कदम दोहराएँ.
  4. जमे हुए 96-अच्छी तरह से आरएनएआई ग्लिसरॉल स्टॉक replicator लागू करें, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पिन हर अच्छी तरह की सतह से संपर्क कर रही है.
  5. ए / टी थाली पर स्टाम्प, हानिकारक अगर सतह के बिना एक पिन के साथ एक छोटी सी सर्कल ड्राइंग.
  6. -80 के लिए पुन: सील और वापसी पुस्तकालय प्लेटें ° सी. सेते 37 ° C बैक्टीरिया विकास के लिए रात में एक टी / प्लेटें मुहर लगी.

2 दिन

3. आरएनएआई बैक्टीरियल क्लोन ओवरनाइट गहरे अच्छी तरह से ब्लाकों में आगे बढ़ें

  1. 37 डिग्री सेल्सियस से एक टी / प्लेटें निकालें और बैक्टीरियल वृद्धि की पुष्टि.
  2. पौंड की 1.5 मिलीलीटर के साथ 200 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन के साथ गहरे अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से ब्लॉक के प्रत्येक अच्छी तरह से भरें.
  3. जीवाणुरहित 96-पिन replicator (2.3 कदम देखें).
  4. एक टी / प्लेट के ऊपर replicator लागू करें, यकीन है कि पिन प्रत्येक बैक्टीरियल आरएनएआई क्लोन के साथ संपर्क बनाने के लिए. गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में लिफ्ट replicator और विसर्जित पिन. भंवर, और धीरे - धीरे हटाने के लिए, CE बनानेआसन्न कुओं नहीं दूषित rtain.
  5. साँस आसान फिल्म के साथ ब्लॉक सील. 37 पर रातोंरात सेते ° C आंदोलन के साथ (मीट्रिक टन INFORS Microtiteron द्वितीय बरतन, पसंदीदा, या एक 25 मिमी फेंक मिलाते इनक्यूबेटर में 250 rpm में 950 rpm).

3 दिन

4. बीज 96-अच्छी तरह से एन जी एम आरएनएआई प्लेट्स पर आरएनएआई बैक्टीरियल क्लोन

  1. 4 से 96-अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटें निकालें डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान पर गर्म है.
  2. गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक निकालें और 4000 x छ पर 10 मिनट अपकेंद्रित्र.
  3. तेजी से सिंक में ब्लॉक करने के लिए मीडिया को नाली पलटना, और अतिरिक्त मीडिया को खत्म करने के लिए कागज तौलिया पर उलटा पैर पटकाना.
  4. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंतर्गत, 200 ग्राम / मिलीलीटर कार्बेनिसिलिन के साथ एक और बाँझ फिल्म के साथ अच्छी तरह से सील करने के लिए लेग की 40 μl जोड़ने.
  5. 10 मिनट छर्रों resuspend, या स्वयं सावधान pipetting द्वारा छर्रों resuspend के लिए कमरे के तापमान जीवाणु हिलनेवाला ब्लॉक लौटें.
  6. लामिना का प्रवाह हुड में, गहरे से बाँझ फिल्म और हस्तांतरण बैक्टीरिया को दूर96-अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटों पर अच्छी तरह से ब्लॉक. पंक्तियों 'ए' और 'एच', और अन्य सभी पंक्तियों से 35 μl resuspended जीवाणुओं की 40 μl जोड़ें. अधिक तरल के लिए 96-अच्छी तरह से आरएनएआई agarose के overdrying और खुर को रोकने की थाली के किनारे कुओं को जोड़ा जाता है.
  7. प्लेटों 4-6 घंटा के लिए हुड में सूखी खुला छोड़ दो, सूखापन के लिए नियमित रूप से निरीक्षण. सूखी बैक्टीरिया स्पष्ट दिखाई नहीं बादल छाए रहेंगे. कवर, प्लेटें पलटना और कमरे के तापमान पर रातोंरात सेते हैं.

5. कीड़े की एक तुल्यकालिक जनसंख्या तैयार

दो 10 सेमी कई गर्भवती कीड़े के साथ भरी प्लेटों को हर 6 96 अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटों के लिए अंडे की तैयारी के लिए किया जाता है. कीड़े गैर की कमी से जूझ रहे हैं कम से कम दो पीढ़ियों (7 दिन) के लिए सुनिश्चित करें.

  1. L1 के एक तुल्यकालिक आबादी तैयार के रूप में पहले 20 में वर्णित है. ब्लीच समाधान के 20 मिलीलीटर के लिए, 4 मिलीलीटर ब्लीच का उपयोग, 1 मिलीग्राम NaOH (10 एम), 5 मिलीग्राम एच 2 हे विआयनीकृत, और 10 मिलीलीटर M9 बफर.
  2. कीड़े रात में एक 15 मिलीलीटर बाँझ 10 मिलीलीटर M9 में सिंक्रनाइज़रोटेशन के साथ 20 वर्ष की उम्र में polypropylene ट्यूब ° सी.

4 दिन

6. आरएनएआई प्लेट्स कीड़े जोड़ें

  1. 1 मिनट के लिए 3000 XG पर अंडा preps अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate, L1 hatchlings की गोली से दूर रहने. 0.0005% ट्राइटन X-100 के साथ 5 मिलीलीटर M9 बफर में Resuspend. डिटर्जेंट की छोटी राशि के अलावा विंदुक के लिए चिपके से कीड़े से बचाता है और वसा धुंधला हो पर कोई प्रभाव नहीं है.
  2. एक खुर्दबीन के नीचे कीड़े गिनो. यदि आवश्यक हो, microliter प्रति 10-15 कीड़े एकाग्रता समायोजित करें.
  3. लामिना का प्रवाह हुड में, प्रत्येक 96 अच्छी तरह से करने के लिए वरीयता प्राप्त की थाली के लिए, एक उथले अच्छी तरह से परख ब्लॉक के एक पंक्ति के प्रत्येक अच्छी तरह से में resuspended कीड़े की 75 μl जोड़ें. एक पुस्तिका multichannel विंदुक का प्रयोग, 5 μl में 96-अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटों के प्रत्येक कुएं में 50-75 कीड़े जोड़ने.
  4. प्लेटें 30 से 60 मिनट के लिए हुड में शुष्क करने की अनुमति दें. जब सूखे, एक खुर्दबीन के नीचे, कीड़े रेंगने, नहीं किया जा ताड़ना दिखाई चाहिए.
  5. आरएनएआई प्लेटों पर कीड़े आगे बढ़ें20 डिग्री सेल्सियस ~ 64 घंटा के लिए.

7 दिन

7. नील लाल कीड़े फिक्स और दाग

  1. इनक्यूबेटर से आरएनएआई प्लेटें निकालें. माइक्रोस्कोप और भूखे रिकॉर्ड या ताड़ना (गीला) आगे के विश्लेषण से बाहर करने के लिए कुओं के तहत जांच, के रूप में इन शर्तों वसा द्रव्यमान को प्रभावित.
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक दोहराने pipettor का उपयोग, साथ 150 μl पीबीएस जोड़ने 0.01% triton एक आरएनएआई प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए X-100. साथ एक मैनुअल pipettor मल्टी चैनल, और कीड़े के साथ एक 96 गहरे अच्छी तरह से पीसीआर थाली में इसी पंक्ति हस्तांतरण तरल मिश्रण. से बचें अगर खलल न डालें. पीबीएस में अच्छी तरह से प्रति 300 μl कीड़े की एक कुल के लिए दोहराएँ.
  3. जब चार प्लेटों का तबादला किया गया है, 500 rpm पर 1 मिनट के लिए प्लेटों अपकेंद्रित्र.
  4. 96-पिन एक वैक्यूम aspirator का उपयोग कर, अच्छी तरह से नीचे ~ 25 μl तरल और कीड़ा गोली छोड़ने तैरनेवाला Aspirate.
  5. प्रत्येक के लिए पशुओं को तय अच्छी तरह से isopropanol 40% की 150 μl जोड़ें. एक उच्च पर्याप्त गति पर कुछ है कि pipettor है कीड़ा मिश्रण40% isopropanol साथ गोली. 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. अपकेंद्रित्र प्लेटें 1 मिनट के लिए 500 rpm पर खुला.
  7. तैरनेवाला Aspirate एक aspirator 96 पिन या मैन्युअल का उपयोग कर, अच्छी तरह से नीचे केवल 25 μl 40% isopropanol + कीड़ा गोली छोड़ने.
  8. 6 μl 40% isopropanol के 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर एसीटोन में 1 प्रति मिलीलीटर की नील लाल स्टॉक समाधान: हर अच्छी तरह से करने के लिए, नील लाल धुंधला हो समाधान के 150 μl जोड़ने के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार.
  9. गैर बाँझ चिपकने वाली फिल्म के साथ सील प्लेट और कम से कम 2 घंटे के लिए अंधेरे में दाग.

8. एक उच्च throughput माइक्रोस्कोप पर धो और छवि कीड़े

  1. 1 मिनट के लिए 500 rpm पर अपकेंद्रित्र और नील लाल रंग के सभी लेकिन 25 μl aspirate.
  2. 0.01% triton प्रत्येक और कम से कम 30 मिनट के लिए अंधेरे में अच्छी तरह से स्टोर करने के लिए X-100 के साथ पीबीएस के 150 μl जोड़ें
  3. 1 मिनट के लिए 500 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  4. 2 x 7 μl त्वरित के साथ एक अच्छी तरह से नीचे से एक pipettor 12-चैनल, Aspirate जानवरों का उपयोग96-अच्छी तरह Teflon मुद्रित गिलास स्लाइड पर स्ट्रोक और बांटना. ध्यान से, कीड़े को हटाने के बिना, स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 9.5 μl हटा दें. यदि अपने गिलास स्लाइड सीधे अपने खुर्दबीन माउंट में फिट नहीं है, एक कस्टम machined एल्यूमीनियम स्लाइड धारक कीड़े माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  5. धीरे धीरे कम 96-अच्छी तरह से स्लाइड पर कवर स्लाइड. यह कदम कुछ अभ्यास ले बुलबुले से बचने के लिए या अन्य कुओं में कीड़े के पार हो सकता है. चिपकने वाला कील के साथ सुरक्षित कोनों.
  6. उज्ज्वल क्षेत्र और प्रतिदीप्ति में / GFP FITC फिल्टर के साथ छवि स्लाइड एक स्वचालित खुर्दबीन पर निर्धारित किया है. लिपिड संकेत photobleaches इतनी आसानी से यह सभी कुओं में एक व्यवस्थित तरीके से imaged किया जाना चाहिए, स्वयं, के रूप में photobleaching कुओं के बीच कृत्रिम अंतर करने के लिए नेतृत्व करेंगे. विश्लेषण पर अधिक जानकारी के लिए, प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा देखने के लिए कृपया.

9. बायोकेमिकल लिपिड ठोस चरण (SPE) निष्कर्षण और गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी / एमएस) का प्रयोग निर्धारण

  1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब में 10 मिलीलीटर M9 बफर के साथ 2,500-5,000 कीड़े प्रत्येक 10 सेमी प्लेट से धो लें. एक मिनट के लिए 500 XG पर गोली कीड़े, और गोली 10 मिलीलीटर M9 बफर के साथ फिर से धोना. X 500 छ में गोली जानवरों. नाइट्रोजन के लिए के तहत 250 μl कुल मात्रा, और तरल नाइट्रोजन और दुकान पर या तो फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस जा Aspirater बाद प्रसंस्करण या सीधे आगे बढ़ना.
  2. कीड़ा गोली सीधे लिया जा सकता है 9.3 कदम अगर ट्राइग्लिसराइड जन फॉस्फोलिपिड 8,13,21 जन समान्य नहीं किया जा रहा है. हालांकि, अगर अन्वेषक प्रोटीन सामग्री या डीएनए सामग्री सामान्यीकरण इच्छाओं, कीड़ा गोली 10 मिनट, 30 सेकंड, 30 सेकंड बंद, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक स्नान sonicator में उच्चतम तीव्रता पर sonicated किया जाना चाहिए यदि प्रोटीन या डीएनए सामान्यीकरण वांछित है, एक 5 μl अशेष भाजक हटाने और कुल प्रोटीन स्तंभ शुद्धि के बाद एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एक ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक या समान या कुल डीएनए सामग्री का उपयोग करने के लिए निर्धारित एकाग्रता.
  3. एक लड़ी borosilicate ग्लास ट्यूब में मेथनॉल: 1.5 मिलीलीटर 02:01 क्लोरोफॉर्म कीड़े जोड़ें. कार्बनिक सॉल्वैंट्स के सभी हस्तांतरण कांच pipettes का उपयोग किया जाना चाहिए.
  4. एक wiretrol 50 μl विंदुक का प्रयोग, μl 50 में 25 एनएम फॉस्फोलिपिड मानक, और 50 μl में 16.7 एनएम ट्राइग्लिसराइड मानक जोड़ने. दोनों मानकों 02:01 क्लोरोफॉर्म में भंग किया जाना चाहिए: मेथनॉल, कसकर छाया हुआ है,और एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऑक्सीकरण से बचने के प्रकाश से संरक्षित नाइट्रोजन के तहत संग्रहीत.
  5. Phenolic टोपी और भंवर के साथ कैप. आरटी पर 1 घंटे के लिए निकालें, हर 15 मिनट vortexing.
  6. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र. स्थानांतरण एक borosilicate संस्कृति ट्यूब कम शवों के बिना जैविक चरण.
  7. 0.3 मिलीलीटर 0.9% NaCl, भंवर और 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र जोड़ें.
  8. एक ताजा borosilicate संस्कृति ट्यूब नीचे कार्बनिक परत स्थानांतरण, जलीय चरण के किसी पर नहीं हस्तांतरण सुनिश्चित बना रही है.
  9. नाइट्रोजन की सूखी जैविक चरण. शुरू करने के लिए ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में सूखे लिपिड resuspend. वैकल्पिक रूप से, विस्तृत और फॉस्फोलिपिड वर्गों, glycolipids, sphingolipids, diacylglycerols, triacylglycerols, मुक्त फैटी एसिड, और कोलेस्ट्रॉल esters सहित अलग लिपिड कक्षाएं, जुदाई विश्लेषण के लिए, पतली परत क्रोमैटोग्राफी के रूप में सी. वत्स प्रयोगशाला द्वारा बीड़ा उठाया 22 एलिगेंस SPE के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है. Lipids भी कर सकते हैं खई HPLC और GCMS द्वारा विश्लेषण fractions द्वारा अलग. (LCMS) liquid-chromatography/MS पूरे lipidome प्रोफाइलिंग के आधुनिकतम तरीकों में भी 23-26 में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  10. सिलिका SPE कई गुना पर SPE स्तंभ को इकट्ठा करो. पूर्व समभार बनाना स्तंभ 3 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म के साथ. विलायक गंभीरता से प्रवाह करने की अनुमति दें.
  11. SPE स्तंभ पर लिपिड नमूना लोड, एक लड़ी पिरोया borosilicate ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से पहला अंश टैग (अंश) के हिस्से के रूप में इकट्ठा. सबसे तटस्थ lipids के माध्यम से यह पहली प्रवाह के माध्यम से 1 मिलीलीटर में आ जाएगा. 3 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें करने के लिए पूरी तरह से टैग अंश elute, टैग अंश ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से एकत्रित.
  12. निकालें और 1 संग्रह ट्यूब टोपी, और एक साफ संग्रह ट्यूब के साथ बदलें. मेथनॉल: 09:01 एसीटोन के 5 मिलीग्राम के साथ glycosphingolipids Elute. हम नियमित रूप से इस अंश के फैटी एसिड की संरचना का विश्लेषण नहीं है, तथापि, यह बहुमूल्य जानकारी हो और मिथाइल esters और मुक्त sphingoid अड्डों की तैयारी के लिए आगे का उपयोग विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है हो सकता हैविशेष टैग और पी एल के लिए उन लोगों के रूप में पहले 27 में वर्णित से अलग प्रक्रियाओं.
  13. एक दूसरे पिरोया borosilicate संग्रह ट्यूब के साथ glycosphingolipid संग्रह ट्यूब बदलें. 3 मिलीग्राम मेथनॉल (PL अंश) के साथ phospholipids Elute.
  14. Fractions -80 डिग्री इस नाइट्रोजन की कसकर छाया बिंदु पर सी संग्रहित किया जा सकता है. शुद्ध नाइट्रोजन की lipids सूखी. 33 में एक सूखी हीटिंग ब्लॉक में सुखाने, गति डिग्री सेल्सियस कभी सूखे के रूप में की दुकान lipids, के रूप में वे विशेष रूप से राज्य में सूखे के ऑक्सीकरण, अतिसंवेदनशील हैं.
  15. Resuspend vortexing और सेते द्वारा 2 मिलीलीटर 2% 2 एच तो मेथनॉल में 4 में सूखे लिपिड fractions एक 55 ° पानी सी fames बनाने के स्नान में कसकर रातोंरात छाया हुआ. देखभाल करने के लिए प्रसिद्धि प्रतिक्रिया में बिल्कुल पानी नहीं मिल के रूप में यह बहुत lipids की derivatization रोकना होगा लिया जाना चाहिए. हम रातोंरात ऊष्मायन द्वारा अधिक कुशल derivatization पाया है और साहित्य से पता चलता है कम लिपिड ऑक्सीकरण कम तापमान पर होता है duriएनजी प्रसिद्धि तैयारी 28. एक वैकल्पिक और अधिक तेजी से विधि मेथनॉल में 2 मिलीलीटर 2.5% एच 2 अतः 4 का उपयोग करें और एक घंटे के लिए 70 या 80 ° C 21,22,29 derivatize है.
  16. अगली सुबह, स्नान से निकालें, और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रत्येक टैग और PL अंश 1.5 मिलीलीटर एच 2 ओ (प्रतिक्रिया बुझाना) और फिर 0.3 मिलीलीटर hexane (fames निकालने) जोड़ें. सख्ती से हिला और 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  17. बहुत सावधानी से केवल शीर्ष हेक्सेन का उपयोग एक मानक विंदुक या पाश्चर विंदुक परत को हटा दें. Autosampler ट्यूब में बांटना. कुछ करने के लिए किसी भी acidified मेथनॉल शामिल नहीं के रूप में इस जीसी स्तंभ और एमएसडी को नष्ट कर देगा.
  18. कैप और जीसी / एमएस पर लोड नमूने. नमूना हेक्सेन में एक सूक्ष्म डालने Agilent PTFE सिलिकॉन PTFE एक पेंच टोपी के साथ छाया शीशी को सौंप दिया है. यह Agilent GCMS मॉडल 6890/5973N (24,079) 30 मीटर Supelcowax-10, 250 माइक्रोन जुड़े सिलिका केशिका स्तंभ के साथ outfitted को सौंप दिया है. एक microliter int इंजेक्शन हैoa splitless इनलेट सेट 250 डिग्री सेल्सियस पर और 13.33 साई Ultrapure हीलियम एक वाहक गैस का प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल रन के रूप में प्रति मिनट एक निरंतर 1 मिलीलीटर में निम्नानुसार है:
कदम अनुदेश लक्ष्य तापमान
1 2 मिनट पकड़ो 150 डिग्री सेल्सियस
2 10 ° प्रति सी मिनट रैंप 200 डिग्री सेल्सियस
3 4 मिनट पकड़ो 200 डिग्री सेल्सियस
4 रैंप 5 ° C प्रति मिनट 240 डिग्री सेल्सियस
5 3 मिनट पकड़ो 240 डिग्री सेल्सियस
6 10 ° प्रति सी मिनट रैंप 270 डिग्री सेल्सियस
7 5 मिनट पकड़ो 270 डिग्री सेल्सियस

एक 3 मिनट विलायक देरी एमएसडी पर प्रयोग किया जाता है fil पर कम से कम पहनतेलड़ी. इसके बाद, 50 और 550 Daltons के बीच जनता एमएस चौगुनी सेट के साथ 150 डिग्री सेल्सियस और 230 डिग्री सेल्सियस पर सेट एमएस स्रोत में पता चला रहे हैं, 270 का एक थर्मल सहायक तापमान डिग्री सेल्सियस के साथ

Representative Results

एक imaged प्लेट है कि वसा धुंधला हो जाना कार्यप्रवाह के माध्यम से ले लिया गया है का एक उदाहरण चित्रा 1 में दिखाया गया है. उच्च वसा (daf-2 इंसुलिन रिसेप्टर आरएनएआई), कम वसा (LPD-3 लिपिड आरएनएआई पेट में भंडारण granules के लिए आवश्यक प्रोटीन), छोटे और कम वसा (FASN-1 फैटी एसिड synthase आरएनएआई), और खाली वेक्टर के लिए विशिष्ट नियंत्रण ( नियंत्रण) जानवरों की वसा के स्तर के अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता में बदलाव, और इसी लिपिड जीसी / एमएस विश्लेषण (2 चित्रा) द्वारा निर्धारित मात्रा दिखाने. ध्यान दें है कि जीन developmentally गिरफ्तार अग्रणी inactivations, छोटे जानवरों अक्सर वयस्क नियंत्रण पशुओं की तुलना में बहुत कम वसा, वसा के चयापचय (3 चित्रा) के लिए किसी भी कनेक्शन के बिना दिखाई देगा. धुंधला हो जाना और जंगली प्रकार नियंत्रण जानवरों के एक समान विकास मंच के SPE GCMS साथ लिपिड जैव रसायन विश्लेषण सहित माध्यमिक विश्लेषण, की वैधता सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिएछोटे या developmentally सकारात्मक हिट को गिरफ्तार कर लिया. FASN - 1 (2 चित्रा) आरएनएआई, या तो L2 या L3 लार्वा चरण में पशुओं गिरफ्तारी, और वसा वयस्क नियंत्रण आरएनएआई की तुलना में कम धुंधला हो जाना है, लेकिन L2 L3 मंच नियंत्रण आरएनएआई जानवरों (वसा दाग प्रतिशत के लिए बहुतायत में इसी तरह के मामले में 49.9 ± FASN 1 आरएनएआई और 20.2 के लिए 4.5% ± L2 नियंत्रण आरएनएआई के लिए 2.1%, और 64.7 ± 1.3 L3 नियंत्रण आरएनएआई के लिए): वयस्क नियंत्रण आरएनएआई की. वैकल्पिक रूप से, जैव रासायनिक विश्लेषण एक कम टैग / L2 चरण से PL अनुपात N2 नियंत्रण जानवरों मिलान (: 22.5 ± FASN 1 आरएनएआई और 46.1 के लिए 2.9 ± 3.4 चरण के मिलान नियंत्रण आरएनएआई, पी 0.05 ≤ के लिए टैग / पी एल) का संकेत दिया. इस प्रकार इस उदाहरण में यह जैव रासायनिक विश्लेषण द्वारा की पुष्टि की जा सकता है है कि FASN-1 वसा द्रव्यमान में कमी के बजाय मंच विशिष्ट लिपिड भंडारण में एक भूमिका है.

अनुवर्ती imaged कीड़े के विश्लेषण सेल Profiler के रूप में इस तरह के एक कम्प्यूटेशनल मंच का उपयोग कर पर काफी निर्भर करता है30 WormToolbox. छवियों की छोटी संख्या के लिए, ऐसे ImageJ, NIH से आसानी से उपलब्ध है, के रूप में एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण मंच का इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे विश्लेषण के लिए अद्वितीय Matlab स्क्रिप्ट पहली बार इस्तेमाल किया गया है की पहचान करने के लिए अच्छी तरह से, और बाद में खाली कुओं या बुलबुले के साथ उन लोगों को बाहर करने के लिए, और कीड़े से छोटे मलबे भेद. मैनुअल गुणवत्ता नियंत्रण उपरोक्त कारणों के लिए बाहर करने के लिए झंडी दिखाकर रवाना किया छवियों के लिए आवश्यक था. हम empirically पाया कि कीड़ा पिक्सल के 90 प्रतिशतक तीव्रता भर में एक अच्छी तरह से,, कीड़ा विकास (3 चित्रा) के सभी चरणों में तीव्रता धुंधला मीट्रिक संगत प्रदान की एक अच्छी तरह से भर कीड़ा क्षेत्र को normalized. कृमि के क्षेत्र पर कुल वसा द्रव्यमान का घालमेल है, पर इसके विपरीत, छोटे उज्ज्वल कीड़े बड़े मंद कीड़े के साथ equivalently स्कोर करते हैं जाएगा. क्योंकि हमारे विधि कृमि के क्षेत्र पर कुल फ्लोरोसेंट संकेत नहीं एकीकृत नहीं एक तीव्रता प्रतिशतक लेने में, से प्रति, कीड़ा आकार में परिवर्तन नहीं कर रहे हैंटी पूर्वाग्रह तीव्रता मापा. इसके बजाय, पिक्सेल तीव्रता वितरण में मतभेदों को मापा जाता है. हालांकि, इस के बावजूद स्पष्ट मतभेद विभिन्न विकास के चरणों के पशुओं के बीच पिक्सेल तीव्रता वितरण धुंधला में देखा जाता है, तो यह आरएनएआई के एक तुलनीय विकास मंच (3 चित्रा) के जानवरों के खिलाफ किसी भी जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. वसा धुंधला विधि का उच्च reproducibility का संकेत replicates के बीच औसत परिवर्तनशीलता 4 चित्र में दिखाया गया है. ध्यान दें कि विधि की ताकत एक थाली के लिए गुणवत्ता छवियों प्राप्त करने, वर्दी रोशनी की शर्तों के तहत, समान जोखिम बार का उपयोग पर अत्यधिक निर्भर है, और कम से कम बुलबुले, मलबे, या अन्य कुओं में कीड़े की विदेशी के साथ.

SPE पूर्व मिश्रित पर प्रदर्शन किया गया था, डिग्री करने के लिए टैग है जो pls (चित्रा 5A) से अलग किया जा सकता है निर्धारित मानकों को शुद्ध करने के लिए है. इस विश्लेषण में, हम एक 100% हासिलटैग और पी एल, के eparation 17:00 फैटी एसिड टैग नमूने में PL से व्युत्पन्न और 13:00 फैटी एसिड PL नमूने में टैग (चित्रा 5A) से प्राप्त की एक इसी अभाव को पूरा करने की एक पूर्ण अभाव के रूप में संकेत दिया. इस प्रकार SPE लिपिड वर्गों को अलग करने में अत्यधिक कुशल है. इस विश्लेषण संकेत नहीं करता है कि विभिन्न श्रृंखला लंबाई के सभी टैग SPE द्वारा शुद्ध equivalently जाएगा और इसी तरह की दक्षता के साथ GCMS द्वारा पता लगाया. यह केवल आश्वासन दिया है और कुल में टैग PL lipids पूरी तरह से एक दूसरे से अलग कर रहे हैं कि.

N2 जंगली प्रकार ठोस चरण निष्कर्षण और प्रसिद्धि तैयारी के माध्यम से उठाए गए जानवरों का एक नमूना ट्रेस जीसी - एमएस चित्रा 5B में दिखाया है. दोनों टैग और पी एल के लिए, चोटियों अवधारण समय और जन स्पेक्ट्रम पर माता पिता और बेटी के आयनों, और संबंधित आंतरिक मानकों के क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत पहचान की चोटियों के तहत कुल क्षेत्र पर आधारित पहचाना जा सकता है. टैग की सामान्यीकृत राशि, क्षेत्र निर्धारितटैग chromatogram के सभी चोटियों के तहत, 13:00 मानक को छोड़कर, एक साथ जोड़ा गया था और 13:00 चोटी के तहत क्षेत्र के द्वारा विभाजित. इसी तरह, सामान्यीकृत PL कुल राशि, 17:00 मानक को छोड़कर सभी चोटियों के तहत क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, एक साथ जोड़ा गया था और 17:00 चोटी के तहत क्षेत्र के द्वारा विभाजित. टैग और PL नमूने लिए सामान्यीकृत मान तो नमूना के लिए अंतिम टैग / PL अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं:

1 समीकरण
यह ध्यान दिया जाना कि विशेष GCMS से डेटा PL अनुपात के लिए कुल टैग की सरल गणना से प्रत्येक लिपिड अंश में मौजूद फैटी एसिड की एक और अधिक परिष्कृत विश्लेषण की अनुमति चाहिए. उदाहरण के लिए, एक अन्वेषक एकल एक एकल फैटी एसिड इसी शिखर एकीकृत और नमूने भर में अपनी सामान्यीकृत बहुतायत की तुलना (जैसे ग कर सकते हैंdaf-2 18:00 13:00 मानक शिखर, कुल PL PL 17:00 मानक चोटी क्षेत्र द्वारा विभाजित जन को normalized) द्वारा विभाजित चोटी के एकीकृत क्षेत्र आरएनएआई बनाम जंगली प्रकार N2 में omparing:

1 समीकरण
अन्वेषक चुनना चाहिए, यह भी संभव हो सकता है या फैटी एसिड की कुल राशि का एक प्रतिशत के रूप में टैग PL fractions में किसी भी फैटी एसिड का प्रतिशत निर्धारित quantitated (टैग अंश में एक N2 कीड़े में उदाहरण के 18:00 के रूप में ):

1 समीकरण

"चित्रा चित्रा 1. समग्र प्रयोग के लिए विशिष्ट कार्यप्रवाह 1 दिन, जमे हुए आरएनएआई पुस्तकालय प्लेटें / Amp Tet लेग अगर प्लेटों पर मुहर लगाई जाती है और 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated 2 दिन, Amp / Tet प्लेटें बीज गहरे अच्छी तरह से ब्लॉक में आरएनएआई क्लोनों की तरल संस्कृतियों के लिए किया जाता है. 3 दिन, बैक्टीरिया centrifugation द्वारा ध्यान केंद्रित कर रहे हैं और 96-अच्छी तरह से आरएनएआई प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर दिया. 4 दिन, L1 hatchling सी. एलिगेंस तरल में आरएनएआई प्लेटों को जोड़ रहे हैं और सूखे की अनुमति दी. 7 दिन, पशुओं तरल में एकत्र कर रहे हैं, 40% isopropanol में नील नदी के लाल रंग से सना हुआ, 96-अच्छी तरह Teflon स्लाइड पर मुहिम शुरू की है, और एक उच्च throughput माइक्रोस्कोप के साथ imaged.

चित्रा 2
चित्रा 2. लगानेवाला आधारित नील लाल प्रमुख दाग FASN (छोटी, कम वसा)-1, lpd 3 (कम वसा) पर दिखाया जाता है, नियंत्रण (खाली सदिश), या daf 2 (उच्च वसा) आरएनएआई क्लोनों. नमूने प्रोटोकॉल (चित्रा 1 में योजनाबद्ध) के प्रति के रूप में प्रोसेस किया गया. पशु तय, नील लाल रंग में दाग, और तुलनीय लिपिड स्तर में imaged परिणाम के रूप में जैव रासायनिक लिपिड माप से प्राप्त. Isopropanol तय नील लाल प्रतिदीप्ति स्तर, कम से कम जैविक 6 replicates से अधिग्रहीत, पहली पंक्ति में दिखाए जाते हैं. मात्रात्मक ट्राइग्लिसराइड का स्तर, समग्र तटस्थ लिपिड दुकानों को प्रतिबिंबित करता है जब समग्र फॉस्फोलिपिड (टैग / पी एल) के स्तर, 4 जैविक से लिया सामान्यीकृत replicates, दूसरी पंक्ति में दिखाए जाते हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि पूर्ण लगानेवाला नील लाल धुंधला हो जाना और जैव रासायनिक लिपिड दृढ़ संकल्प से हासिल quantitation अक्सर पूरी तरह से मेल नहीं खाती है. इस उदाहरण में, गुणात्मक हालांकिlpd-3, इसी तरह, FASN 1 (आरएनएआई) अधिक अलग ट्राइग्लिसराइड जन बनाम जैव रासायनिक विधियों द्वारा नियंत्रण से माइक्रोस्कोपी द्वारा संकेत है comparably अलग है, और daf-2 (आरएनएआई) कम अलग है, हालांकि सभी मतभेदों को अत्यधिक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हैं और मापन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे. दिखाया गया डेटा मतलब ± SEM (*, पी 0.01 ≤; **, पी ≤ 0.०,००१ नियंत्रण के सापेक्ष, unpaired, दो पूंछ बराबर विचरण संभालने टी परीक्षण द्वारा निर्धारित की जाती है).

चित्रा 3
चित्रा 3. वसा द्रव्यमान विभिन्न लार्वा चरणों में नियतन नील लाल धुंधला हो जाना द्वारा निर्धारित पशु OP50 बैक्टीरिया पर हो रहे थे और L1 पर एकत्र, L2, L3, L4, और सगर्भ वयस्क विकास के चरणों. छवियाँ निर्धारण धुंधला हो जाना के बाद कब्जा कर लिया गया और एक स्वनिर्धारित Matlab स्क्रिप्ट का उपयोग करने के लिए 90 वें शतमक ओ निर्धारित का विश्लेषणच की पहचान कीड़ा क्षेत्र से अधिक पिक्सेल तीव्रता. ध्यान दें कि पशुओं के लिपिड स्तर बहुत रूप में जानवर L2 से L4 चरण के लिए विकसित बढ़ाने के लिए, और फिर थोड़ा कम के रूप में जानवर वयस्क अवस्था में germline के प्रसार की ओर कैलोरी को हटाने के लिए शुरू होता है. दिखाया गया डेटा मतलब ± 6-8 के लिए SEM replicates (**, पी ≤ .0001 सगर्भ वयस्क के सापेक्ष, unpaired, दो पूंछ टी परीक्षण द्वारा निर्धारित की जाती है).

चित्रा 4
चित्रा 4. स्वतंत्र जैविक भर में उच्च reproducibility replicates जैविक भर में नील लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता के एक तितर बितर साजिश दिखाई है replicates (n = 6-8). प्रत्येक को दोहराने के लिए, सभी मूल्यों खाली वेक्टर नियंत्रण के मतलब तीव्रता normalized हैं. दिखाया गया डेटा मतलब ± SEM (**, पी ≤ .0001 नियंत्रण रिश्तेदार, unpaired, दो पूंछ टी परीक्षण द्वारा निर्धारित संभालनेबराबर विचरण).

चित्रा 5
चित्रा 5. जीसी - एमएस SPE के chromatograms मानकों और जंगली प्रकार टैग और पीएल बहुतायत अलग (ए) जीसी - एमएस निशान टैग और पीएल मानकों के SPE जुदाई के दिखाए जाते हैं. PL का पता लगाने में 13:00 फैटी एसिड के अभाव को पूरा करने और टैग का पता लगाने में 17:00 फैटी एसिड की इसी अभाव नोट, टैग की पूरी जुदाई (tritridecanoin) से पी एल (1,2 diheptadecanoyl - एस.एन. ग्लिसरो का संकेत -3-phospho (1'आरएसी - ग्लिसरॉल)). (बी) N2 जंगली जानवरों की तरह खिलाया वेक्टर नियंत्रण आरएनएआई (L4440 खाली वेक्टर आरएनएआई साथ HT115 बैक्टीरिया) के एक नमूना से एक प्रतिनिधि टैग और पीएल का पूरा स्पेक्ट्रम. नमूना के एक microliter प्रोटोकॉल के अनुसार एक Agilent 6890/5973N GCMS में इंजेक्ट किया गया था, और व्यक्तिगत चोटियों rete द्वारा की पहचान की गई हैntion समय और उनके संबंधित जन स्पेक्ट्रा. , Cyclo आईएसओ, cyclopropane फैटी एसिड: संकेताक्षर आईएसओ मिथाइल branched श्रृंखला फैटी एसिड, GLA, गामा linolenic एसिड, ALA, अल्फा लिनोलेनिक एसिड, DGLA, dihomo गामा linolenic एसिड, EPA, eicosapentaenoic एसिड बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल तेजी से, सी. में लिपिड स्तर के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है एलिगेंस, जो आसानी से उच्च throughput स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. पहले तरीकों का इस्तेमाल किया है, जो कई फ्रीज पिघलना 8,10 चक्र द्वारा पीछा paraformaldehyde में एक लंबा नियतन कदम शामिल के विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल isopropanol में एक सरल नियतन 3 मिनट की आवश्यकता है. हमने पाया है कि सी. धुंधला 40% isopropanol में एलिगेंस, वे स्वतंत्र रूप से नील लाल पारगम्य अतिरिक्त कदम फ्रीज पिघलना या निर्धारण के उपयोग के बिना हो गया है. इसके अलावा, के रूप में नील लाल चुनिंदा हरी 18,19,31 स्पेक्ट्रम में hydrophobic डिब्बों में fluoresces, कोई destaining आवश्यक है. कुल में, जानवरों आरएनएआई प्लेटों से दाग और करने के लिए तैयार छवि जानवरों के लिए किया जा सकता है बस पर 2.5 घंटा लिया. इस विधि अपेक्षाकृत सस्ते और उच्च reproducibility के साथ किया जा सकता है. विधि सी. की क्षमता पर निर्भर नहीं करता है तेज या ध्यान केंद्रित करने के लिए एलिगेंसडाई और इसलिए आधारित महत्वपूर्ण रंजक तरीकों का उपयोग कर खिलाने के रूप में एक ही सीमाओं नहीं है. Reproducibility और माप की शुद्धता को देखते हुए, विधि आरएनएआई द्वारा जीन inactivations की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है. लिपिड स्तर के quantitation लगानेवाला नील लाल धुंधला हो के आधार पर वांछित है, हम 4-6 के उपयोग के उचित नियंत्रण और सांख्यिकीय लागू परीक्षण के साथ जैविक replicates की सलाह देते हैं.

यह संभावना है कि कई छोटे जानवरों के लिए प्रमुख जीन inactivations (देरी या गिरफ्तार विकास के कारण आरएनएआई क्लोनों के कारण) वसा नियामकों के लिए एक स्क्रीन के बाहर आते हैं, वसा के चयापचय से किसी भी संबंध की परवाह किए बिना होता है. छवि विश्लेषण कार्यक्रम जबकि हम कीड़ा क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्य से विभिन्न आकार के कीड़े के लिए खातों का उपयोग, व्यक्तिगत शोधकर्ताओं ने यह भी एक समान विकास मंच के जंगली जानवरों के लिए छोटे जानवरों की चर्बी धुंधला हो जाना के स्तर की तुलना करने पर विचार करना चाहते हो सकता है. मेंस्पष्ट कम वसा द्रव्यमान के साथ छोटे या developmentally गिरफ्तार कर लिया जानवरों के मामले में, हम बताते हैं कि कोई भी साधन बदल लिपिड चयापचय को प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त है. विशेष GCMS सहित कई पालन प्रयोगों, इन जीनों के समारोह लिपिड नियामक का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है. जाना चयापचय नियामक के लिए एक FASN, विशेष GCMS विश्लेषण developmentally मिलान N2 L2 नियंत्रण पशुओं की तुलना में स्पष्ट कम वसा पाया जब वयस्क नियंत्रण जानवरों के लिए तुलना phenotype की पुष्टि के लिए आवश्यक था. जबकि नील लाल वसा धुंधला हो कम वसा रिश्तेदार का स्तर संकेत वयस्क आरएनएआई, जब मंच मिलान L2 नियंत्रण आरएनएआई जानवरों की तुलना में नियंत्रित करने के लिए कोई स्पष्ट अंतर देखा गया था. तदनुसार, एक दूसरी विधि का उपयोग करते हैं, यानी अनुपात / टैग PL के जैव रासायनिक मात्रा का ठहराव आवश्यक निर्धारित करने के लिए किया गया था कि FASN-1 वसा द्रव्यमान का एक सच्चे नियामक है, FASN-1 के रूप में आरएनएआई biochemically चरण मिलान L2 नियंत्रण आरएनएआई जानवरों से अलग पहचाना है.

20 या पारंपरिक Teflon मुद्रित आकार पर घुड़सवार कीड़े से छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 8 12 अच्छी तरह से खुर्दबीन स्लाइड . केवल सीमा यह है कि लिपिड नील लाल photobleaches के साथ दाग जल्दी बूंदों की हरी प्रतिदीप्ति के रूप में, व्यवस्थित, वर्दी जोखिम शर्तों छवियों के बीच तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हम पाते हैं कि वर्दी छवि अधिग्रहण शर्तों के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित खुर्दबीन इस प्रभाव के लिए सबसे अच्छा काम करता है.

इस प्रोटोकॉल के महान शक्तियों में से एक यह है कि छवियों को एकत्र कर रहे हैं के बाद वे फिर से विश्लेषण भविष्य के लिए बचाया जा सकता है. एक ही छवियों वसा सामग्री के अलावा शरीर के आकार का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, कम्प्यूटेशनल कार्यक्रमों के रूप में और अधिक उन्नत हो, वहाँ एक कीड़ा विश्लेषण के लिए संभावना है, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम पैदाएक ही अच्छी तरह से. इस प्रकार हमारे तरीका है कि उच्च throughput माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल प्रकाशित स्क्रीन तरीके में है कि एक Copas Biosort उपयोग फ्लोरोसेंट संकेत 32,33 मात्रा ठहराना पर कुछ फायदे हैं. हालांकि, के तरीके में निश्चित रूप से पूरक हैं.

सटीक, SPE और जीसी / एमएस द्वारा लिपिड सामग्री के जैव रासायनिक निर्धारण सी. में प्रमुख मोटी दुकानों के नील लाल धुंधला हो की पुष्टि एलिगेंस. हालांकि पूर्ण लगानेवाला नील लाल धुंधला हो जाना और जैव रासायनिक लिपिड दृढ़ संकल्प से हासिल quantitation अक्सर पूरी तरह से मेल नहीं खाते, दोनों तरीकों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम है कि गुणात्मक सहमत हूँ उत्पादन. इसके अलावा, इस विधि के लिए व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की विशिष्ट आवश्यकताओं जो glycosphingolipids, phospholipids, या विभिन्न नमूनों में मौजूद ट्राइग्लिसराइड्स के अलग - अलग वर्गों के आगे के विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है को पूरा करने के लिए सिलवाया जा सकता है. ऐसा लगता है कि अन्य समूहों प्रौद्योगिकी अन्य था इस्तेमाल किया जाना चाहिएn SPE लिपिड जीसी / एमएस 22 पहले वर्गों को अलग करने के लिए. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) SPE से अधिक लाभ है कि वे बेहतर अलग ध्रुवीय lipids से अलग तटस्थ lipids (जैसे टैग diacylglycerols, मुक्त फैटी एसिड, और कोलेस्ट्रॉल एस्टर) करने में सक्षम हो सकता है (phosphatidylcholine है, ) phosphatidylethanolamine और glycol - sphingolipids. हम SPE चुन क्योंकि यह सामग्री (2,500-5,000 कीड़े) शुरू करने की एक न्यूनतम आवश्यकता है, यह प्रमुख लंबी अवधि के ऊर्जा भंडार, टैग, जो तटस्थ लिपिड 4 अंश के सबसे बनाने पर जोर देती है, और तेजी से है, कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है या प्लेटें. बात पर बल दिया जा सकता है कि मानक के मिश्रण पर आधारित होना चाहिए, SPE पूरी तरह से pls से टैग अलग, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है (चित्रा 5A देखें). जबकि quantitation और फैटी एसिड मिथाइल esters के विश्लेषण एक जीसी / एमएस की आवश्यकता है, इस उपकरण सामान्य रूप से उपलब्ध है, और यदि नहीं, स्थानीय नमूने हो सकता हैइसके बाद के संस्करण के रूप में उत्पन्न और -80 डिग्री नाइट्रोजन के अंतर्गत सी संग्रहीत जब तक एक सहयोगी या वाणिज्यिक जीसी / एमएस सेवा द्वारा विश्लेषण की व्यवस्था है.

GCMS उत्पादन प्रत्येक लिपिड प्रजाति के भीतर प्रत्येक फैटी एसिड पर उच्च संकल्प डेटा शामिल हैं. यह तुलना में नमूने के बीच विस्तृत मतभेद के निर्धारण की. एक उदाहरण के रूप में, अन्वेषक का निर्धारण कर सकता है कि क्या कुछ फैटी एसिड का स्तर बहुतायत में बदल रहे थे daf-2, lpd-3 या FASN 1 आरएनएआई बनाम वेक्टर नियंत्रण में दूसरों की तुलना में काफी अधिक है. इसलिए यह अत्यधिक शक्तिशाली उपकरण में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं जिस पर लिपिड प्रजातियां बहुतायत में किसी भी प्रयोगात्मक हेरफेर के साथ बदल रहे हैं.

हमारे विश्लेषण के लिए, हम सबसे अधिक बार टैग PL बड़े पैमाने पर करने के लिए बड़े पैमाने पर मानक के अनुसार. जबकि प्रोटीन या डीएनए भी sonicated कीड़ा गोली की अशेष भाजक से निर्धारण के बाद लिपिड जन सामान्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तो हम पाते हैं कि इन तरीकों int अधीन हैंसभी pipetting चरणों के दौरान और प्रत्येक निष्कर्षण से नमूना वसूली में roduced मानव त्रुटि. यह इस कारण है कि हम करने के बजाय हमारे सामान्य कारक के रूप में PL जन का उपयोग करने के लिए चुना है. अप्राकृतिक मानकों (टैग के लिए tritridecanoin, पी एल के लिए 1,2 diheptadecanoyl एस.एन. ग्लिसरो तीन phospho (1'आरएसी - ग्लिसरॉल)) प्रोटोकॉल के शुरू में पेश कर रहे हैं ठोस चरण निष्कर्षण के सभी चरणों के माध्यम से किया जाता है और प्रसिद्धि तैयारी, और दोनों टैग और PL fractions के मात्रात्मक और प्रतिनिधि वसूली की गारंटी. एक ही गारंटी अगर जांचकर्ताओं प्रोटीन या डीएनए का उपयोग टैग जन सामान्य नहीं किया जा सकता है. हम PL जिसके द्वारा नमूने भर TAG स्तर की तुलना करने के लिए सबसे मजबूत गेज होने के लिए विश्वास है, के रूप में यह पहले से दिखाया गया है कि PL प्रतिमिनट केवल एक ही TAG स्तर, जैसे विस्तारित भुखमरी में बड़े बड़े पैमाने पर बदलाव का प्रभावशाली उत्तेजना द्वारा बदल दिया है या 34 व्यायाम बढ़ - 36. PL एक संरचनात्मक भूमिका निभा लगा रहे हैं, झिल्ली तरलता और सेलुलर inte सुनिश्चित करनेgrity और 37-39 भंडारण ऊर्जा के रूप में बजाय संकेत भूमिका. हमारे हाथ में, टैग / PL अनुपात सबसे अधिक बारीकी से मेल खाती है क्या लगानेवाला आधारित नील लाल के साथ लिपिड धुंधला हो जाना द्वारा प्राप्त की है, और 21 अन्य समूहों द्वारा पाया गया कि के साथ सहमत. एक वैकल्पिक रणनीति वत्स प्रयोगशाला, जहां लिपिड टैग का प्रतिशत कुल 9,22,29 lipids बनाम गणना की है के द्वारा किया जाता है.

टैग और पी एल मानक के गैर देशी प्रकार के उपयोग सुनिश्चित करता है कि कोई देशी फैटी एसिड सामान्यीकरण गणना में शामिल किया जाएगा. श्रृंखला लंबाई का चयन विशुद्ध रूप से देशी फैटी एसिड की जन स्पेक्ट्रा के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए इन मानकों की जरूरत पर आधारित है. हमने पाया है कि इस उद्देश्य के लिए 13:00 और 17:00 के फैटी एसिड की सेवा सबसे अच्छा है. यह संभव है, कम श्रृंखला फैटी एसिड के विभिन्न रासायनिक गुणों को देखते हुए, कि हमारे अप्राकृतिक फैटी एसिड मानकों सभी श्रृंखला लंबाई फैटी एसिड या diff के साथ श्रृंखला की वसूली के प्रतिनिधि नहीं हो सकताerent संतृप्ति सूचकांक. इस प्रकार यह संभव है कि SPE या GCMS दौरान हम या शुद्धि विभिन्न श्रृंखला लंबाई के lipids के बीच पता लगाने की क्षमता में अंतर देख सकते हैं. इस और GCMS में विभिन्न फैटी एसिड के विभिन्न ionization पर आधारित है, यह संभव है किसी भी फैटी एसिड की बहुतायत के बारे में एक निरपेक्ष बयान करना नहीं है. इसलिए, हम केवल किसी भी फैटी एसिड के एक ही प्रयोग abundances भीतर नमूनों के बीच तुलना करें. यदि एक बिल्कुल एक फैटी एसिड quantitate करना चाहता था, एक तरह से यह हासिल करने के लिए एक के रूप में एक stably isotopically लेबल 13 कि या इसी तरह के फैटी एसिड की सी संस्करण के एक ज्ञात मात्रा के साथ बालीदार ऊपर तैयार नमूना चलाने होगा सकता है, इतना है कि यह हो सकता है एमएसडी में माता पिता के उदाहरण के लिए, आयन के बड़े पैमाने पर आधारित प्रतिष्ठित. यह देखते हुए कि हम केवल लागत का कम से कम कर रहे हैं लिपिड वर्गों के रिश्तेदार मात्रा में या किसी भी फैटी एसिड हमारे 13:00 टैग और 17:00 PL मानकों इस उद्देश्य के पर्याप्त रूप से सेवा, की तुलना करने के लिए,प्रत्येक वर्ग के लिपिड पर्याप्त और प्रतिनिधि वसूली का आश्वासन देता हूं.

इस बिंदु तक, वहाँ एक आम सहमति की कमी कुछ परिणामों की व्याख्या विभिन्न के तरीके से प्राप्त करने के लिए, और प्रचलित तरीके में क्या किया जाना चाहिए के रूप में किया गया है. कुल मिलाकर यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अलगाव में कोई एक विधि आदर्श सी. में वसा के चयापचय का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है एलिगेंस. हालांकि, कई जांच और सत्यापन के तौर तरीकों का उपयोग करके, एक लिपिड नियामक जीन पर प्राप्त आंकड़ों में विश्वास प्राप्त कर सकते हैं. इस प्रकार, हम इरादा लिए हमारे प्रोटोकॉल सी. के क्षेत्र में भविष्य के काम के लिए एक बेंचमार्क के रूप में सेवा करने के लिए एलिगेंस वसा अनुसंधान.

Disclosures

लेखक परस्पर विरोधी हितों का खुलासा करने के लिए नहीं है.

Acknowledgments

हम चर्चा और पांडुलिपि पढ़ने के लिए माइकल Kacergis तकनीकी सहायता और Lianfeng वू के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. इस काम में एक कैरियर विकास पुरस्कार द्वारा NIH / NIDDK (K08DK087941 आस), / NIH NIDDK प्रशिक्षण अनुदान (5T32DK007028 ECP), एलिसन मेडिकल फाउंडेशन नई विद्वान एजिंग पुरस्कार (आस) में, और चार्ल्स एच से समर्थित किया गया हूड फाउंडेशन बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार (आस).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

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References

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बायोकेमिकल और उच्च Throughput वसा द्रव्यमान का सूक्ष्म आकलन<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em
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Pino, E. C., Webster, C. M., Carr,… More

Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).

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