Summary
Vi præsenterer robuste biokemiske og mikroskopiske metoder til undersøgelse
Abstract
Nematoden C. elegans har vist sig som en vigtig model til undersøgelse af konserverede genetiske veje regulerer fedtstofskiftet som den vedrører human fedme og associerede sygdomme. Flere tidligere metoder udviklet til visualisering af C. elegans triglycerid-rige fedtdepoter har vist sig at være fejlagtige, fremhæver cellulære andre rum end lipiddråber. Andre fremgangsmåder kræver specialiseret udstyr, er tidskrævende, eller give inkonsistente resultater. Vi introducerer en hurtig, reproducerbar, fixativ-baserede Nile rødfarvning metode til nøjagtig og hurtig påvisning af neutrale lipiddråber i C. elegans. En kort fiksationstrin i 40% isopropanol gør dyrene fuldstændig permeable for Nile rødt, som derefter anvendes til at farve dyr. Spektrale egenskaber af dette lipofile farvestof gør det muligt at kraftigt og selektivt fluorescerer i det gul-grønne spektrum, når i et lipid-rigt miljø, men ikke i merepolære miljøer. Således kan lipiddråber visualiseres på et fluorescensmikroskop udstyret med enkle GFP billeddannende evne efter kun en kort Nile rødfarvning trin i isopropanol. Hastigheden, overkommelige priser, og reproducerbarhed af denne protokol gør det ideelt til high throughput skærme. Vi viser også en parret fremgangsmåde til biokemisk bestemmelse af triglycerider og phospholipider ved hjælp af gaschromatografi massespektrometri. Denne mere rigoristiske protokol bør anvendes som bekræftelse af resultater opnået fra Nilen rød mikroskopisk lipid beslutsomhed. Vi forventer, at disse teknikker vil blive nye standarder inden for C. elegans metabolisk forskning.
Introduction
Bevarelse af metaboliske veje mellem mennesker og nematoden Caenorhabditis elegans gør det til en kraftig modelorganisme til undersøgelse af fedme. Mens C. elegans har ikke adipocyter dedikeret til fedt oplagring ligesom hos pattedyr, de gør butik triglycerider i lipiddråber 1 og besidder mange af de samme regulatorer af fedt oplagring og anvendelse af energi 2,3. Til analyse for fedt i C. elegans, er flere metoder blevet foreslået med varierende niveauer af lethed og succes. Den engang så udbredte brug af fluorescerende, vitale farvestoffer 4-7 nylig blev draget i tvivl, og disse reagenser viste sig at komme pletter et rum adskilt fra de vigtigste fedt lager af C. elegans 1,8-11. Fikservæske-baserede ikke-fluorescerende farvestoffer, såsom Sudan sort og olie-rød-O, mens succes med at fremhæve lipiddråber i ormen 12-14, ikke har så stort et dynamikområde til kvantificering som fluorescerendecent farvestoffer 8,13,15. Endvidere nuværende metoder til fiksering for både fluorescerende og ikke-fluorescerende farvestoffer er tidskrævende og involverer flere fryse-tø trin og / eller anvendelsen af toksiske kemikalier 1,9,10. Anvendelsen af specifikke BODIPY-mærket lipid-analoger er blevet rapporteret at fremhæve lipiddråber, når tilføres til levende orme med kortvarig mærkning 15. Men dette er afhængig af optagelse af farvestoffet og derfor forspændt ved C. elegans håndtering og metabolisme af BODIPY fedtsyreanaloger. En etableret alternativ til lipid-farvning farvestoffer er etiket-fri, sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) eller stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi, som udnytter de karakteristiske vibrationelle egenskaber af lipidmolekyler at visualisere fedtdepoter 10,16, 17. Imidlertid dyrt specialudstyr er nødvendigt for denne metode, og gennemløbet er lav i bedste.
For at opfylde et behov for hurtig, skalerbar anasis af neutralt lipid butikker i C. elegans metabolisk forskning, vi indfører en roman, meget reproducerbar metode til fixativ-baserede Nile rød lipidfarvningen. Spektrale og fysisk-kemiske egenskaber af den lipofile farvestof Nile red inducere en gul-guld-spektral forskydning i sin excitation-emission peak, gør det muligt at fluorescere i den grønne emissionsspektret når den er i en lipid-rigt miljø, men ikke i mere polære miljøer 18 , 19. Således lipiddråber kan detekteres efter simpel farvning ved anvendelse af et grønt fluorescerende protein (GFP) filter indstillet til fluorescensmikroskopi. Den lethed og overkommelige af denne teknik gør det ideelt til high throughput skærme. Vi viser også en parret, stringent fremgangsmåde til biokemisk bestemmelse af triglycerider og phospholipider ved hjælp af fastfase-ekstraktion og gaschromatografi-massespektrometri. Biochemical lipid måling korrelerer med Nile red-baseret mikroskopisk bestemmelse af C. elegans fat masse, og bør bruges som en bekræftelse af konklusionerne med mikroskopisk lipid beslutsomhed.
Protocol
1. Fremstilling af Rectangular Amp / Tet (A / T) LB-agarplader og NGM IPTG RNAi Plates
A / T plader skal fremstilles 1-4 uger før anvendelse og opbevares i mørke ved 4 ° C.
- For 1 liter media tilsættes 1 I deioniseret vand, 32 g LB-agar, 1,5 ml 2 M NaOH, og 2 g Bacto agar. Autoklavér 40 min på flydende cyklus. Efter afkøling til 60 ° C, tilsættes 3 ml tetracyclin og 0,5 ml ampicillin. Hæld 45 ml medium i hver plade.
Forbered 96-brønds RNAi plader 3 dage op til 2 uger i forvejen.
- At hælde 25 96 brønde RNAi plader, fremstilling 1 I nematodevækst medier (NGM): 1 I deioniseret vand, 3 g NaCl, 17 g agarose og 2,5 g bactopepton. Autoklaven væskekredsløb ved 121 ° C i 40 min med en omrører. Lad afkøle, omrøring på en varmeplade indstillet til 60 ° C.
- Når cool til 60 ° C, skal du tilføje følgende stamopløsninger: 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KH 2 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 200 mg / ml carbenicillin, og 5 ml 1 M IPTG (se Materialer tabellen opskrifter).
- Dispensér 150 gl af RNAi-mediet i hver brønd i en fladbundet plade med 96 brønde under anvendelse af en elektronisk multikanalpipette. Undgå luftbobler. Holde mediet i en steril rustfrit stål beholder nedsænket i et 60 ° C vandbad under dispensering.
- Hold RNAi plader niveau indtil agarose størkner. Pladerne kan hældes op til 2 uger i forvejen og opbevares ved 4 ° C.
Dag 1
2. Stempel Frosne Library Plader på Rectangular Amp / Tet (A / T) LB-agarplader
- Varm A / T plader til stuetemperatur, holde dem i mørke.
- Transfer 96-brønds RNAi bibliotek plader fra -80 ° C til tøris. Åbne aluminium-forseglede plade i nærheden af en bunsenbrænder.
- Sterilisere en 96-pin replicator ved neddypning tappe serielt (10 sekunder hver) i 10% blegemiddel, deioniseret H2O, og 70% EToh efterfulgt af passage tappe gennem en flamme. Gentag EtOH og flammen trin.
- Anvendelse replikator med frosset 96-brønds RNAi glycerolstamopløsning, at sikre hvert ben i kontakt med overfladen af hver brønd.
- Stempel på A / T plade, der trækker en lille cirkel med hvert ben uden at skade agaroverfladen.
- Re-sæl og returnere bibliotek plader til -80 ° C. Inkuber stemplet A / T pladerne ved 37 ° C natten over for bakterievækst.
Dag 2
3. Grow RNAi Bakterielle kloner Overnatning i Deep-brønds Blocks
- Fjern A / T plader fra 37 ° C og bekræft bakterievækst.
- Fyld hver brønd i en 96-brønds dyb-og blok med 1,5 ml LB med 200 pg / ml carbenicillin.
- Steriliser 96-pin replicator (se trin 2,3).
- Anvendelse replikator til toppen af den A / T plade, og sørg pins får kontakt med hver bakteriel RNAi klon. Løft replikator og fordybe stifter i det dybe brønde blok. Swirl, og langsomt fjerne, hvilket gør certain ikke forurener det tilstødende brønde.
- Seal blok med indånder-nem film. Inkuber natten over ved 37 ° C med omrøring (950 rpm i MT Infors Microtiteron II shaker, foretrukne eller 250 rpm i en 25 mm-kaste rysteinkubator).
Dag 3
4. Seed RNAi Bakterielle kloner over på 96-brønds NGM RNAi Plates
- Fjern 96-brønds RNAi plader fra 4 ° C og opvarmes til stuetemperatur.
- Fjern deep-well blokke og centrifugeres 10 minutter ved 4.000 x g.
- Hurtigt invertere blokke i vasken at dræne medier, og stemple omvendt på et stykke køkkenrulle til at fjerne overskydende medie.
- Under en laminar strømningshætte, tilsættes 40 pi LB med 200 ug / ml carbenicillin til hver brønd og forsegling med sterilt film.
- Returnerer blokke til stuetemperatur bakteriel rysteapparat i 10 min for at resuspendere pillerne, eller manuelt resuspendere pellets ved forsigtig pipettering.
- I laminar flow hætte, fjerne steril film og overføre bakterier fra dyb-og blokke over på 96-brønds RNAi plader. Tilsæt 40 ul resuspenderede bakterier til rækker 'A' og 'H', og 35 pi fra alle andre rækker. Mere væske tilsættes til kant brøndene i 96-brønds RNAi pladen for at undgå overtørring og revnedannelse i agarosen.
- Lad pladerne afdækket til tørre i hætte for 4-6 timer, inspektion regelmæssigt for tørhed. Tørre bakterier fremstår klart, ikke uklar. Omfatte, vendes pladerne om og inkuberes ved stuetemperatur natten over.
5. Forbered en Synkron Befolkning i Worms
To 10 cm plader fyldt med mange drægtige orme anvendes til æg forberedelse til hver 6. 96 brønde RNAi plader. Vær sikker orme er ikke-sultet i mindst to generationer (7 dage).
- Der fremstilles en synkron population af L1 som tidligere beskrevet 20. For 20 ml blegemiddelopløsning, skal du bruge 4 ml blegemiddel, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml deioniseret H 2 O, og 10 ml M9 buffer.
- Synkronisere orme natten over i 10 ml M9 i en 15 ml sterilpolypropylenrør med rotation ved 20 ° C.
Dag 4
6. Tilføj Worms til RNAi Plates
- Centrifuger æg preps ved 3.000 x g i 1 min. Aspirer supernatanten, opholder sig væk fra pelleten af L1 larver. Resuspender i 5 ml M9-puffer med 0,0005% Triton X-100. Tilsætningen af den lille mængde detergent forhindrer orme i at klæbe til pipetten, og har ingen virkning på fedt farvning.
- Tæl orme under et mikroskop. Hvis det er nødvendigt, justeres koncentrationen til 10-15 orme pr mikroliter.
- I laminar strøm-hætte, for hver 96-brønds plade, der skal podes tilsættes 75 ul resuspenderede orme i hver brønd af én række af en flad-brønds assay blok. Under anvendelse af en manuel multikanalpipette, 50-75 orme tilsættes i 5 pi til hver brønd i 96-brønds RNAi plader.
- Tillader pladerne at tørre i stinkskab i 30 til 60 min. Efter tørring under et mikroskop, skal orme synes at gennemgå, ikke prygle.
- Grow orme på RNAi pladerved 20 ° C i ~ 64 timer.
Dag 7
7. Fix og Stain Worms i Nile Red
- Fjern RNAi plader fra inkubatoren. Undersøg under mikroskop og optage udsultet eller Prygl (våd) brønde til at udelukke fra yderligere analyse, da disse forhold påvirker fedtmasse.
- Ved hjælp af en elektronisk repeat pipettor, tilsættes 150 pi PBS med 0,01% triton X-100 til hver brønd i en RNAi plade. Med en manuel multikanals pipette, mix og overføre væske med orme til den tilsvarende række i en 96-deep-brønds PCR-plade. Undgå at forstyrre agar. Gentag for i alt 300 ul orme i PBS per brønd.
- Når fire plader er blevet overført, centrifugeres pladerne ved 500 rpm i 1 min.
- Aspirer supernatanten under anvendelse af en 96-polet vakuum aspirator, hvilket efterlader ~ 25 ul væske og orm pellet på bunden af brønden.
- Tilsæt 150 pi af 40% isopropanol til hver brønd for at løse dyr. Sørg for, at pipette er på et højt nok hastighed til at blande ormpellet med 40% isopropanol. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min.
- Centrifugeres pladerne afdækket ved 500 rpm i 1 min.
- Aspirer supernatanten under anvendelse af en 96-polet aspirator eller manuelt, hvilket kun efterlader 25 gl 40% isopropanol + orm pellet på bunden af brønden.
- 6 pi Nile rød stamopløsning af 0,5 mg / ml i acetone per 1 ml 40% isopropanol: Til hver brønd, 150 ul Nile rød farvningsopløsning tilberedes umiddelbart før brug tilføje.
- Forseglingsplade med usterilt klæbende film og pletter i mørke i mindst 2 timer.
8. Vask og Image Worms på et Højkapacitetsforskning Microscope
- Der centrifugeres ved 500 rpm i 1 minut, og der opsuges alle undtagen 25 ul Nile rødt farvestof.
- Tilsæt 150 pi PBS med 0,01% triton X-100 til hver brønd og opbevares i mørke i mindst 30 min.
- Der centrifugeres ved 500 rpm i 1 min.
- Under anvendelse af en 12-kanals pipette, aspireres dyr fra bunden af hver brønd med 2 x 7 pi praktiskeslagtilfælde og dispensere på en 96-brønds Teflon-trykte objektglas. Omhyggeligt, uden at fjerne orme, fjerne 9,5 pi PBS fra hver brønd af dias. Hvis din objektglas ikke passer direkte i din mikroskop mount, skal en brugerdefineret bearbejdet aluminium slide holder bruges til at montere orme.
- Langsomt lavere cover slide på 96-brønds dias. Dette trin kan tage nogle praksis at undgå bobler eller krydse over af orme i andre brønde. Sikker hjørner med klæbestof klæbeevne.
- Billede slide i lyse felt og fluorescens med en GFP / FITC-filter sat på et automatiseret mikroskop. Lipid-signal photobleaches nemt, så det burde blive afbildet på en systematisk måde i alle brønde, ikke manuelt, da fotoblegning vil føre til kunstige forskelle mellem brønde. For yderligere oplysninger om analysen, se venligst Repræsentative Resultater og diskussion.
9. Biokemisk Lipid Bestemmelse Brug Solid Phase Extraction (SPE) og gaskromatografi-massespektrometri (GC / MS)
- Vask 2,500-5,000 orme fra hver 10 cm plade med 10 ml M9-puffer til en 15 ml konisk polypropylenrør. Pellet orme ved 500 x g i et minut, og vask pellet igen med 10 ml M9-puffer. Pellet dyr ved 500 x g. Aspirér forlader 250 ul samlede volumen, og enten fastfrysning af flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C under nitrogen for senere forarbejdning eller gå direkte.
- Ormen pellet kan tages direkte til trin 9,3, hvis triglycerid masse skal normaliseres til phospholipid masse 8,13,21. Hvis investigator ønsker normalisering til proteinindhold eller DNA-indhold, bør ormen pellet skal sonikeret på den højeste intensitet i et bad-sonikator i 10 minutter, 30 sekunder på, 30 sec off, ved 4 ° C. Hvis protein eller DNA normalisering ønskes, fjerne en 5 pi aliquot og bestemme total proteinkoncentration anvendelse af et Bradford-reagens eller lignende eller total DNA indhold, efter søjleoprensning under anvendelse af en UV-spektrofotometer.
- Læg orme til 1,5 ml 2:1 chloroform: methanol i en gevindskåret borosilikat glasrør. Alle overførsel af organiske opløsningsmidler skal ske ved hjælp af glas pipetter.
- Under anvendelse af en wiretrol 50 pi pipette, 25 nM phospholipid standard i 50 pl, og 16,7 nM triglycerid standard i 50 pi tilsættes. Begge standarder bør opløses i 2:1 chloroform: methanol, lukkes tæt,og opbevaret under nitrogen beskyttet mod lys i en -80 ° C fryser for at undgå oxidation.
- Cap med phenolisk hætte og vortex. Ekstraheres i 1 time ved stuetemperatur, vortexbehandling hver 15 min.
- Der centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 min. Overfør nedre organiske fase uden slagtekroppe til et borsilicat dyrkningsrør.
- Tilsættes 0,3 ml 0,9% NaCI, vortex og der centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 min.
- Overfør nederste organiske lag til en frisk borsilicat dyrkningsrør, idet det sikres ikke at foregå via en af den vandige fase.
- Tør organisk fase under nitrogen. Til at begynde fastfase-ekstraktion (SPE) resuspenderes tørret lipid i 1 ml chloroform. Alternativt til detaljeret separation og analyse af forskellige lipidklasser, herunder phospholipidklasser, glycolipider, sphingolipider, diacylglyceroler, triacylglyceroler, frie fedtsyrer og kolesterol estere, tyndtlagskromatografi efter forbillede fra Watts lab i C. elegans 22 kan anvendes i stedet for SPE. Lipiderne kan også be separeret ved HPLC, og fraktioner blev analyseret ved GCMS. Sofistikerede metoder til hel-lipidome profilering af liquid-chromatography/MS (LCMS) kan også anvendes 23-26.
- Saml silica-SPE-søjle på SPE manifold. Præ-ækvilibrere søjlen med 3 ml chloroform. Tillad solvent til at flyde ved hjælp af tyngdekraften.
- Indlæse lipid prøve på SPE-søjle, indsamling af gennemstrømning i en gevindskåret borsilicat rør som en del af den første fraktion (TAG fraktion). Mest neutrale lipider vil komme igennem i denne første 1 ml gennemstrømning. 3 ml chloroform til fuldt ud at eluere TAG fraktion, indsamling af gennemstrømning i TAG fraktion røret.
- Tag og loft over de første kollektion rør, og erstatte med en ren samling rør. Eluere glycosphingolipider med 5 ml 9:1 acetone: methanol. Vi ikke rutinemæssigt analysere fedtsyresammensætningen af denne fraktion, men det kan indeholde værdifuld information og kan gemmes til fremstilling af methylestere og frie sphingoid baser til yderligere analyse under anvendelse afspecialiserede procedurer adskiller sig fra dem, for TAG og PL som tidligere beskrevet 27.
- Udskift glycosphingolipid opsamlingsrør med en anden gevindsektion borosilicate opsamlingsrør. Eluere phospholipider med 3 ml methanol (PL fraktionen).
- Fraktioner kan opbevares ved -80 ° C på dette tidspunkt lukkes tæt under nitrogen. Kemisk oprensede lipider under nitrogen. For at fremskynde tørring i en tør varmeblok ved 33 ° C. Opbevar aldrig lipider i tørret form, da de er særligt modtagelige for oxidation i tørret tilstand.
- Resuspender tørrede lipidfraktioner i 2 ml 2% H 2 SO 4 i methanol ved omhvirvling og inkuberes lukkes tæt natten over i en 55 ° C vandbad for at skabe fames. Der skal udvises forsigtighed for at få absolut ingen vand i FAME reaktion som dette i høj grad vil hæmme derivatisering af lipider. Det har vist sig mere effektiv derivatisering ved inkubering natten over og i litteraturen foreslås mindre lipidoxidation finder sted ved lavere temperaturer During FAME fremstilling 28. En alternativ og hurtigere fremgangsmåde er at anvende 2 ml 2,5% H 2 SO 4 i methanol og derivatisere i en time ved 70 eller 80 ° C 21,22,29.
- Den næste morgen, fjerne fra badet, og lad den afkøle. Tilsættes 1,5 ml H2O (for at standse reaktionen) og derefter 0,3 ml hexan (til at udtrække fames) til hvert TAG og PL fraktionen. Omrystes kraftigt og centrifugeres ved 1.000 rpm i 5 min.
- Meget forsigtigt fjerne kun top Hexanfasen hjælp af en standard pipette eller Pasteur pipette. Dispensere til autosampler rør. Sørg for ikke at inkludere nogen syrnet methanol, da dette vil ødelægge GC-kolonne og MSD.
- Cap og belastning prøver på GC / MS. Prøven overføres i hexan til en mikro-insert Agilent hætteglas lukket med en PTFE-silikone-PTFE skruelåg. Det overføres til Agilent GCMS model 6890/5973N udstyret med en Supelcowax-10 (24079) 30 meter, 250 mikrometer kapillarsøjle med sintret silica. En mikroliter injiceres intoa splitless indløb indstillet på 250 ° C og 13,33 PSI ultrarent Helium anvendes en bæregas. Protokollen løb er som følger ved en konstant 1 ml per minut:
| Trin | Instruktion | Goal Temperatur |
| 1 | Hold 2 min | 150 ° C |
| 2 | Rampe 10 ° C pr minut | 200 ° C |
| 3 | Hold 4 min | 200 ° C |
| 4 | Rampe 5 ° C pr minut | 240 ° C |
| 5 | Hold 3 min | 240 ° C |
| 6 | Rampe 10 ° C pr minut | 270 ° C |
| 7 | Hold 5 min | 270 ° C |
En 3 min opløsningsmiddel forsinkelse anvendes ved MSD for at minimere slid på filAment. Derefter masser fra 50 til 550 dalton påvist med MS firedobbelt sæt ved 150 ° C og MS, der er indstillet ved 230 ° C, med en termisk ekstra temperatur på 270 ° C.
Representative Results
Et eksempel på et afbildet plade, der er taget gennem fedtet farvning arbejdsprocessen er vist i figur 1.. Specifik kontrol for højt fedtindhold (DAF-2 insulinreceptor RNAi), lavt fedtindhold (LPD-3 protein er nødvendig for lipid-storage granulat i tarmen RNAi), små og lavt fedtindhold (fasn-1 fedtsyresyntase RNAi), og tom vektor ( kontrol) viser de variationer i fluorescensintensitet efter de fedtindhold af dyrene og de tilsvarende lipid beløb bestemt ved GC / MS-analyse (fig. 2). Bemærk at gen inactivations fører til udviklingshæmmede arresteret, vil små dyr ofte synes at have meget lavere fedt end voksne kontroldyr, uanset eventuel forbindelse til fedtstofskiftet (Figur 3). Sekundære analyser, herunder farvning analyse og lipid biokemi med SPE-GCMS af vildtype kontrol dyr på tilsvarende udviklingstrin må gøres for at sikre gyldigheden aflille eller udviklingsmæssigt anholdt positive hits. I tilfælde af fasn-1 RNAi (figur 2), dyr arrest i enten L2 eller L3 larvestadiet, og har fedt farvning lavere end voksne kontrol RNAi, men tilsvarende i overflod til L2-L3 fase kontrol RNAi dyr (fedt plet procent af voksen kontrol RNAi: 49,9 ± 4,5% for fasn-1 RNAi og 20,2 ± 2,1% for L2 kontrol RNAi, og 64,7 ± 1,3 for L3 kontrol RNAi). Alternativt biokemisk analyse indikerede en lavere TAG / PL-forhold end L2 scene matchede N2 kontroldyr (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 for fasn-1 RNAi og 46,1 ± 3,4 for fase-matchede kontrol RNAi, P ≤ 0,05). Således i dette tilfælde det kan bekræftes ved biokemisk analyse, at fasn-1 spiller en rolle i lipid storage snarere end blot en trinspecifik reduktion af fedtmasse.
Den opfølgende analyse af afbillede orme er stærkt afhængig af en computermodel platform som Cell Profiler hjælpDen WormToolbox 30. For mindre antal billeder, kan en offentligt tilgængelig billedanalyse platform såsom ImageJ, frit tilgængelig fra NIH, anvendes. For vores analyse blev unikke Matlab scripts bruges først at identificere godt, og efterfølgende at udelukke tomme brønde eller dem med bobler, og skelne små vragrester fra orme. Manuel kvalitetskontrol var nødvendig for billeder er markeret til udelukkelse af de grunde, der er nævnt ovenfor. Vi fandt empirisk, at 90 pct.-fraktilen intensitet af ormen pixels på tværs af en brønd, normaliseret til orm område på tværs af en godt, forudsat konsekvent metrik af farvningsintensitet i alle faser af orm udvikling (Figur 3). Integration total fedtvæv over området af ormen, tværtimod ville have tendens til at score små lyse orme ækvivalent med store dim orme. Fordi vores metode ikke integrere samlede fluorescerende signal over området af ormen, i at tage en intensitet percentil, ændringer i orm størrelse i sig selv ikke gøret forspænding intensiteten måles. I stedet er forskelle i pixel intensitetsfordeling målt. Til trods for dette er der tydelige forskelle ses i farvning pixelintensitet fordeling mellem dyr af forskellige udviklingsstadier, så det er vigtigt at studere virkningen af RNAi til helst gen af dyr af en tilsvarende udviklingstrin (figur 3). Gennemsnitlige variation mellem replikater, er vist i figur 4 indikerer høj reproducerbarhed af fedtstoffet farvningsmetode. Bemærk, at styrken af fremgangsmåden er meget afhængig af opnåelse kvalitet billeder for hver plade under ensartet belysning betingelser, under anvendelse af identiske eksponeringstider, og med minimale bobler, aflejringer eller crossover af orme i andre brønde.
SPE blev udført på forblandet, oprenset henblik på at fastlægge, i hvilken grad TAG kunne adskilles fra PLs (fig. 5A). I denne analyse har vi opnået en 100% separation af TAG-og PL, angivet som et fuldstændigt fravær af 17:00 fedtsyrer afledt af PL i TAG prøven og en tilsvarende fuldstændigt fravær af 13:00 fedtsyrer hidrørende fra TAG i PL prøve (fig. 5A). Således SPE er meget effektiv til at adskille lipidklasser. Denne analyse indikerer ikke, at alle TAG med forskellige kædelængder vil blive renset ækvivalent ved SPE og detekteres ved GCMS med lignende effektivitet. Den kun sikrer, at TAG og PL lipider i alt er helt adskilt fra hinanden.
En prøve GC-MS spor af N2 vildtypedyr taget gennem fastfaseekstraktion og FAME fremstilling er vist i figur 5B. For både TAG og PL, kan toppe identificeres baseret på retentionstid og moder-og datter-ioner på massespektrum, og det totale areal under de identificerede toppe normaliseret til området for de respektive interne standarder. For at bestemme den normaliserede værdi af TAG, i områdetunder alle toppene af TAG kromatogrammet, bortset fra 13:00 standard blev tilsat sammen og divideret med arealet under 13:00 top. Ligeledes for at bestemme den normaliserede samlede PL beløb, området under alle toppene, bortset fra 17:00 standard, blev tilsat sammen og divideret med arealet under 17:00 top. De normaliserede værdier af TAG og PL prøver anvendes derefter til at beregne den endelige TAG / PL-forhold for prøven:
Det skal bemærkes, at dataene fra SPE-GCMS tillader en langt mere avanceret analyse af fedtsyrerne i hvert lipidfraktion end simpel beregning af det samlede TAG til PL-forhold. For eksempel kan investigator integrere en enkelt top svarende til en enkelt fedtsyre og sammenligne dens normaliseret tæthed på tværs af prøver (f.eks comparing i N2 vildtype versus DAF-2 RNAi det integrerede område af 18:00 top divideret med 13:00 standardtop, normaliseret til total PL masse divideret med PL 17:00 standard peak area):
Bør forsøgslederen vælge, ville det også være muligt at bestemme den procentdel af en bestemt fedtsyre i TAG eller PL fraktioner som en procentdel af den samlede mængde fedtsyre kvantificeret (som eksempel 18:00 i TAG fraktion i N2 orme ):
Figur 1. Typisk arbejdsgang for det samlede forsøg. Dag 1, er frosne RNAi bibliotek plader stemplet på Amp / Tet LB-agarplader og inkuberet ved 37 ° C. Dag 2, er Amp / Tet-plader anvendt til frø flydende kulturer af RNAi kloner i dyb brønd blokke. Dag 3, bakterier koncentreret ved centrifugering og overført til 96-brønds RNAi plader. Dag 4, L1 Hatchling C. elegans sættes til RNAi plader i væske og tillades at tørre. Dag 7, er dyr opsamlet i væsken, farvet med Nile rødt i 40% isopropanol, monteret på 96-brønds Teflon slides, og afbildes med et højt gennemløb mikroskop.
Figur 2. Fiksativ-baserede nilrødt pletter store
Figur 3. Fedtmasse bestemt ved fiksering Nile rødfarvning på forskellige larvestadier. Dyr blev dyrket på OP50 bakterier og opsamlet ved L1, L2, L3, L4 og drægtige voksne udviklingsstadier. Billeder blev taget til fange efter fiksering farvning og analyseret ved hjælp af et tilpasset Matlab script til at bestemme 90-percentilen of pixel intensitet over den identificerede ormen området. Bemærk, at lipidniveauer af dyr i høj grad øge som dyret udvikler sig fra L2 til L4 fase, og derefter falde lidt som dyret begynder at aflede kalorier mod proliferation af kimcellelinjen i det voksne stadium. De viste data er gennemsnit ± SEM for 6 til 8 gentagelser (**, P ≤ 0,0001 forhold til gravide voksne, bestemt ved uparret, tohalet t-test).
Figur 4. Høj reproducerbarhed tværs uafhængig biologisk replikater. Vist er et scatter plot af nilrødt fluorescensintensiteter tværs biologisk replikater (n = 6-8). For hver gentagelse er alle værdier normaliseret til den gennemsnitlige intensitet af de tomme vektor kontrol. Viste data er middel ± SEM (**, P ≤ 0,0001 i forhold til kontrol, bestemt ved uparret, tohalet t-test under forudsætning aflige varians).
Figur 5. GC-MS kromatogrammer af SPE separeret standarder og vildtype TAG og PL overflod. (A) GC-MS spor er vist af SPE adskillelse af TAG og PL-standarder. Bemærk den fuldstændige mangel på 13:00 fedtsyre i PL spor og det tilsvarende fravær af 17:00 fedtsyre i TAG spor, hvilket indikerer fuldstændig adskillelse af TAG (tritridecanoin) fra PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero -3-phospho-(1'-rac-glycerol)). (B) En repræsentant hele spektret af TAG og PL fra en prøve af N2 vildtype dyr fodret vektorkontrol RNAi (HT115 bakterier med L4440 tom vektor RNAi). En mikroliter af prøven blev injiceret i en Agilent 6890/5973N GCMS ifølge protokollen, og individuelle toppe blev identificeret ved retention tid og deres respektive massespektre. Forkortelser: cyclo, cyclopropan fedtsyre, iso:. Iso-methyl forgrenede fedtsyre, GLA, gamma linolensyre, ALA, alfa-linolensyre, DGLA, dihomo gamma linolensyre, EPA, eicosapentaensyre Klik her for at se større figur .
Discussion
Den præsenterede protokol tillader hurtig, omfattende screening af lipidniveauer i C. elegans, som let kan tilpasses til højt gennemløb skærme. Modsætning til tidligere anvendte fremgangsmåder, der medfører en langvarig fiksering trin i paraformaldehyd efterfulgt af flere fryse-tø cykler 8,10, kræver vores protokol en simpel 3-min fiksering i isopropanol. Det har vist sig, at ved farvning C. elegans i 40% isopropanol, de bliver frit permeabel for Nile rødt, uden brug af yderligere fryse-tø-eller fiksering trin. Også, som Nile rødt selektivt fluorescerer i hydrofobe rum i den grønne spektrum 18,19,31, ingen affarvning er nødvendig. I alt kan dyrene tages fra RNAi plader til indfarvede og klar til billede dyr i lidt over 2,5 timer. Denne fremgangsmåde kan udføres relativt billigt og med høj reproducerbarhed. Fremgangsmåden er ikke afhængig af evnen af C. elegans til optagelse eller koncentratfarvestoffet, og derfor ikke har de samme begrænsninger som fodring baserede metoder ved hjælp af vitale farvestoffer. Given reproducerbarhed og præcision, er fremgangsmåden egnet til screening af store antal gen inactivations ved RNAi. Hvis kvantificering af lipidniveauer ønskes baseret på fiksativ Nile rødfarvning, anbefaler vi brug på 4-6 biologisk replikater med de relevante kontroller og statistisk anvendt test.
Det er sandsynligt, at mange gen inactivations fører til små dyr (på grund af RNAi kloner forårsager forsinket eller arresteret udvikling) ville komme ud af en skærm for fede regulatorer, uanset enhver forbindelse til fedtforbrændingen. Mens billedet analyseprogram vi udnyttet konti for orme af forskellige størrelser ved at normalisere fluorescensintensiteten til ormen område, kan de enkelte forskere også overveje at sammenligne de fede farvningsegenskaber niveauer af små dyr til vildtype dyr på tilsvarende udviklingstrin. Itale om små eller udviklingsmæssigt anholdt dyr med tilsyneladende lavt fedtmasse, foreslår vi, at ingen enkelt modalitet er tilstrækkelig til at påvise ændret lipidmetabolisme. Adskillige opfølgende forsøg, herunder SPE-GCMS, kunne være forpligtet til at fastslå lipid-regulerende funktion af disse gener. For kendt metabolisk regulator fasn-1, SPE-GCMS-analyse sammenlignet med udviklingsmæssigt matchede N2 L2 kontroldyr var nødvendigt at bekræfte den tilsyneladende fedtfattig fænotype fundet, når sammenlignet med voksne kontroldyr. Mens Nile rødt fedt farvning angivet lavere fedtindhold i forhold til kontrol voksen RNAi, sammenlignet med fase-matchede L2 kontrol RNAi dyr, blev ingen åbenlyse forskelle ses. Følgelig anvendelse af en anden metode blev dvs biokemisk kvantificering af TAG / PL-forhold nødvendigt at bestemme, at fasn-1 er en sand regulator af fedtmasse, som fasn-1 RNAi er biokemisk skelnes fra fase-matchede L2 kontrol RNAi dyr.
20 eller på konventionel størrelse Teflon-trykte 8 til 12 og mikroskopobjektglas . Den eneste begrænsning er, at den grønne fluorescens af lipiddråber farvet med Nile Red photobleaches hurtigt, systematisk, ensartet eksponeringsbetingelser skal bruges til at sikre sammenlignelighed mellem billeder. Vi finder, at en fuldt automatiseret mikroskop med ensartede Image Acquisition betingelser virker bedst til dette formål.
En af de store styrker ved denne protokol er, at efter billederne indsamles de kan gemmes til senere re-analyse. De samme billeder kan anvendes til at bestemme kropsstørrelse foruden fedtindhold. Desuden som beregningsmæssige programmer bliver mere avancerede, er der udsigt til en enkelt orm analyse, genererer statistisk signifikante resultaterfra en enkelt boring. Således vores metode, der anvender high-throughput mikroskopi har nogle fordele i forhold til offentliggjorte skærm metoder, der bruger en Copas Biosort at kvantificere fluorescerende signaler 32,33. Men de metoder er absolut gratis.
Præcis, biokemisk bestemmelse af fedtindholdet ved SPE og GC / MS bekræfter Nilen rødfarvning af de store fedtdepoter i C. elegans. Selv om den absolutte kvantificering opnås fra fiksativ Nile rød farvning og biokemisk lipid beslutsomhed ofte ikke passer perfekt, begge metoder producere meget reproducerbare, statistisk signifikante resultater, der er enige kvalitativt. Desuden kan denne fremgangsmåde tilpasses til at opfylde de specifikke behov hos individuelle forskere, som kan kræve yderligere analyse af de separate klasser af glycosphingolipider, phospholipider eller triglycerider til stede i forskellige prøver. Det skal bemærkes, at andre grupper har brugt teknologi andre than SPE at adskille lipidklasser Inden GC / MS 22. Tyndtlagskromatografi (TLC) og højtryksvæskekromatografi (HPLC) har fordele i forhold SPE, idet de kunne være i stand til bedre separate forskellige neutrale lipider (fx TAG, diacylglyceroler, frie fedtsyrer og cholesterol estere) fra polære lipider (phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin) og glycol-sphingolipider. Vi vælger SPE, fordi det kræver et minimum af udgangsmateriale (2,500-5,000 orme), det fremhæver de store langsigtede energipolitiske butikker, Tags, der udgør det meste af det neutrale lipid fraktion 4, og er hurtig og kræver ingen specialiseret udstyr eller plader. Det skal understreges, at på grundlag af standardblandinger, SPE fuldstændigt adskiller TAG fra PL'er, og er yderst reproducerbar og pålidelig (se figur 5A). Mens kvantificering og analyse af fedtsyremethylestere kræver en GC / MS, dette udstyr er almindeligt tilgængelige, og hvis ikke lokalt, prøver kangenereres som ovenfor og opbevaret ved -80 ° C under nitrogen indtil analyse ved aktiv eller kommercielt GC / MS tjenesten er anbragt.
Den GCMS output indeholder højopløselige data om hver fedtsyre inden for hver lipidarter. Dette tillader bestemmelse af detaljerede sammenlignet forskelle mellem prøver. Som et eksempel kunne undersøgeren afgøre, om niveauerne af visse fedtsyrer blev ændret i overflod mere signifikant end andre i DAF-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi versus vektorkontrol. Denne enormt kraftfulde værktøj kan derfor give detaljerede oplysninger om, hvor lipidarter ændres i overflod med nogen eksperimentel manipulation.
For vores analyse, oftest vi normalisere TAG masse til PL masse. Mens protein eller DNA også kan anvendes til at normalisere lipid masse efter bestemmelse af en alikvot af sonikerede orm pellet, finder vi, at disse metoder er omfattet af introduced menneskelig fejl under alle pipetteringstrin og i prøven fra hver ekstraktion. Det er grunden til, at vi valgte at i stedet bruge PL masse som vores normalisering faktor. Unaturlige standarder indføres ved starten af protokollen (tritridecanoin for TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) for PL) føres gennem alle trin af fastfaseekstraktion og FAME forberedelse, og sikre kvantitativ og repræsentativ inddrivelse af både TAG og PL fraktioner. Det samme garanti kan ikke foretages, hvis efterforskere bruge protein eller DNA til at normalisere TAG masse. Vi mener PL for at være den mest robuste sporvidde ved at sammenligne TAG niveauer på tværs af prøver, som det tidligere er blevet vist, at PL kun minutiøst ændres af den samme stimulus bevirke stor masse forskydninger i TAG niveauer, f.eks udvidet sult eller øget motion 34 - 36. PL menes at spille en strukturel rolle, sikrer membranfluiditet og cellulære integrity og signalanlæg roller snarere end som energilager 37-39. I vores hænder, mest TAG / PL-forholdet svarer til det opnås ved fiksativ-baserede lipidfarvningen med Nile rødt, og er enig med den, der findes af andre grupper 21. En alternativ strategi anvendes af Watts laboratoriet, hvor procentdelen af lipid TAG beregnes versus total lipider 9,22,29.
Brugen af ikke-hjemmehørende typer af TAG og PL standard sikrer, at ingen indfødte fedtsyrer vil blive medtaget i normaliseringen beregningen. Valget af kædelængden er udelukkende baseret på behovet af disse standarder til ikke interfererer med massespektre af native fedtsyrer. Det har vist sig, at fedtsyrer 13:00 og 17:00 tjene bedst til dette formål. Det er muligt på grund af de forskellige kemiske egenskaber af kortere kædede fedtsyrer, at vores unaturlige fedtsyrer standarder måske ikke repræsentativ for at hente alle kædelængde fedtsyrer eller kæder med different mætning indekser. Det er således muligt, at der i SPE eller GCMS vi kan se forskelle i effektiviteten af oprensning eller detektion mellem lipider med forskellige kædelængder. Baseret på denne og de forskellige ionisering af forskellige fedtsyrer i GCMS, er det ikke muligt at foretage en absolut erklæring om forekomsten af en given fedtsyre. Derfor har vi kun sammenligne mellem prøver inden et enkelt eksperiment mængderne af enhver given fedtsyre. Hvis man ønskede at absolut kvantificering en fedtsyre, en måde dette kan opnås er at køre en prøve, fremstillet som ovenfor tilsat en kendt mængde af en stabilt isotopmærket 13C version af denne eller tilsvarende fedtsyre, således at det kunne være skelnes baseret på massen af moderion i MSD, f.eks. Da vi kun sammenligner relative mængder af lipidklasser eller enhver given fedtsyre, vores 13:00 TAG og 17:00 PL-standarder tjener dette formål tilstrækkeligt, på et minimum af omkostninger, atsikre en passende og repræsentative genopretning af hver lipid-klasse.
Indtil dette punkt, har der været en mangel på konsensus med hensyn til fortolkningen af visse resultater opnået ved forskellige metoder, og i hvilket de fremherskende metoder bør være. Samlet skal det bemærkes, at ingen fremgangsmåde isoleret ideelt egnet til at studere fedtstofskiftet i C. elegans. Men ved hjælp af multiple screening og validering modaliteter, kan man opnå tillid til data opnået på lipid regulatoriske gener. Således agter vi for vores protokol til at tjene som et benchmark for det fremtidige arbejde på området C. elegans fedt forskning.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Michael Kacergis til teknisk bistand og Lianfeng Wu til diskussioner og læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en karriereudvikling udmærkelse fra NIH / NIDDK (K08DK087941 til AAS), en NIH / NIDDK træning tilskud (5T32DK007028 til ECP), den Ellison Medical Foundation New Scholar i Aging Award (til AAS) og Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (til AAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
- Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
- Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
- Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
- Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
- Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
- Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
- McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
- Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York. 304 (1999).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
- Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
- Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
- Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
- Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
- Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
- Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. , Oily Press. 69-111 (1993).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
- Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
- Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
- Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
- Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
- Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
