Summary
Vi presenterer robuste biokjemiske og mikroskopiske metoder for å studere
Abstract
Hvalkveisen C. elegans har dukket opp som en viktig modell for studiet av konserverte genetiske trasé som regulerer energiomsetningen som gjelder fedme hos mennesker og tilhørende sykdommer. Flere tidligere metoder utviklet for visualisering av C. elegans triglyserid-rike fett butikker har vist seg å være feilaktig, fremhever cellene enn lipid dråper. Andre metoder krever spesialisert utstyr, er tidkrevende, eller gi inkonsistente resultater. Vi introduserer en rask, reproduserbar, fiksativ-baserte Nile rød farging fremgangsmåte for nøyaktig og rask påvisning av nøytrale lipid dråper i C. elegans. En kort fiksering trinn i 40% isopropanol gjør dyrene helt permeable til Nile rødt, som deretter brukes til å flekke dyr. Spektrale egenskaper av denne lipofil fargestoff la den sterkt og selektivt fluoresce i den gulgrønne spektrum bare når i en lipid-rikt miljø, men ikke i merpolare miljøer. Dermed kan lipid dråper bli visualisert på en fluorescerende mikroskop utstyrt med enkle GFP imaging evne etter bare en kort Nile rød farging trinn i isopropanol. Hastighet, kostnader og reproduserbarhet av denne protokollen gjør den ideell for høy gjennomstrømming skjermer. Vi viser også en sammenkoblet fremgangsmåte for biokjemisk bestemmelse av triglyserider og fosfolipider ved hjelp av gasskromatografi-masse spektrometri. Dette strengere protokollen bør brukes som en bekreftelse på resultatene fra Nilen rød mikroskopiske lipid besluttsomhet. Vi forventer at disse teknikkene vil bli nye standarder innen C. elegans metabolsk forskning.
Introduction
Bevaring av metabolske veier mellom mennesker og nematode Caenorhabditis elegans gjør det et kraftig modell organisme for studiet av fedme. Mens C. har elegans ikke har adipocytter dedikert til fettlagring som i pattedyr, de store triglyserider i lipid dråper 1 og har mange av de samme regulatorer av fettlagring og energibruk 2,3. Til analysen for fett nivåer i C. elegans, har flere metoder blitt foreslått med varierende grad av letthet og suksess. Den en gang så vanlige bruken av fluorescerende, vitale fargestoffer 4-7 ble nylig kalt inn spørsmålet, og disse reagensene viste seg å være flekker en kupé distinkt fra de viktigste fett lagring depot av C. elegans 1,8-11. Fiksativ-baserte non-fluorescerende fargestoffer, som for eksempel Sudan svart og Olje-red-O, mens vellykket på å fremheve lipid dråper i ormen 12-14, ikke har så stor dynamisk rekkevidde for kvantifisering som fluorescerendecent fargestoffer 8,13,15. Videre dagens metoder for fiksering for både fluorescerende og ikke-fluorescerende fargestoffer er tidkrevende og involverer flere fryse-tine trinn og / eller bruk av giftige kjemikalier 1,9,10. Bruk av spesifikke BODIPY-merkede lipid analogene har blitt rapportert å utheve lipid dråper når matet til levende ormer med kortsiktig merking 15. Men dette er avhengig opptak av fargestoff, og er derfor forspent av C. elegans håndtering og metabolisme av BODIPY fettsyre-analoger. En etablert alternativ til lipid-flekker fargestoffer er label-fri, sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) eller stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi, som tar seg av de karakteristiske vibrasjonen egenskaper lipidmolekylene å visualisere fete butikker 10,16, 17. Imidlertid, er dyrt spesialutstyr er nødvendig for denne fremgangsmåte, og gjennomstrømning er lav i beste fall.
Å oppfylle et behov for rask og skalerbar analysersis av nøytrale lipid butikker i C. elegans metabolsk forskning, introduserer vi en ny, svært reproduserbar metode for fiksativ-baserte Nile rød lipid farging. Spektral og fysikalsk-kjemiske egenskaper av den lipofile fargestoff Nile rød indusere en gul-gull-spektral forskyvning i sin eksitasjon-emisjonstopp, slik at det til å fluorescere i grønn emisjonsspektrum bare når i en lipid-rikt miljø, men ikke i mer polare miljøer 18 , 19. Således lipid dråper kan oppdages etter enkel farging ved bruk av en grønn fluorescerende protein (GFP) filter satt for fluorescens mikroskopi. Den enkle og kostnader i denne teknikken gjør den ideell for høy gjennomstrømming skjermer. Vi viser også en sammenkoblet, streng metode for biokjemisk bestemmelse av triglyserider og fosfolipider ved hjelp av fastfase ekstraksjon og gasskromatografi-massespektrometri. Biokjemiske lipid måling korrelerer med Nile rød-baserte mikroskopisk bestemmelse av C. elegans fat masse, og bør brukes som en bekreftelse på funnene laget med mikroskopisk lipid bestemmelse.
Protocol
1. Utarbeidelse av Rectangular Amp / Tet (A / T) LB agarplater og NGM IPTG RNAi Plates
A / T plater bør være forberedt 1-4 uker før bruk og lagret i mørke ved 4 ° C.
- For 1 L av medier tilsett 1 L deionisert vann, 32 g LB agar, 1,5 ml 2 M NaOH, og 2 g Bacto agar. Autoklaveres 40 min på flytende syklus. Etter avkjøling til 60 ° C, tilsett 3 ml tetracyklin og 0,5 ml ampicillin. Hell 45 ml av mediet i hver plate.
Forbered 96-vel RNAi plater 3 dager opp til 2 uker i forveien.
- Å helle 25 96-brønns plater RNAi, forberede en L av nematode vekstmedier (NGM): 1 L deionisert vann, 3 g NaCl, 17 g agarose, og 2,5 g bactopeptone. Autoklav flytende syklus ved 121 ° C i 40 min med en rørestav. La avkjøles, rør på en varm plate satt til 60 ° C.
- Når avkjøl til 60 ° C, tilsett følgende stamløsninger: 1 ml 1 M 4 MgSO, 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KH 2 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 200 mg / ml Carbenicillin, og 5 ml 1 M IPTG (se Materialer tabell for oppskrifter).
- Dispenser 150 pl av RNAi medier i hver brønn av en flatbunnet 96-brønns plate ved hjelp av en elektronisk multikanalpipette. Unngå luftbobler. Oppbevar medier i en steril rustfri stål receptacle nedsenket i et 60 ° C vannbad under dispensering.
- Hold RNAi plater nivå til agarose stivner. Plater kan helles opp til 2 uker i forveien og lagret ved 4 ° C.
Dag 1
2. Stemple Frosne Bibliotek Plater på Rectangular Amp / Tet (A / T) LB agarplater
- Varm A / T plater til romtemperatur, og holder dem i mørket.
- Transfer 96-brønns RNAi bibliotek plater fra -80 ° C til tørris. Åpne aluminium-forseglet plate i nærheten av en gassbrenner.
- Steriliser en 96-pinners portreplikator ved å dyppe pins serielt (10 sek hver) i 10% blekemiddel, avionisert H 2 O, og 70% EToh etterfulgt av passerer kartnålene gjennom en flamme. Gjenta EtOH og flamme trinn.
- Påfør replikator til frosset 96-brønns RNAi glyserol lager, gjør at hver pinnekontakter overflaten av hver brønn.
- Stempel på A / T plate, tegne en liten sirkel med hver pin uten å skade agaroverflaten.
- Re-forsegling og retur bibliotek platene til -80 ° C. Inkuber stemplet A / T plater ved 37 ° C over natten for bakterievekst.
Dag 2
3. Grow RNAi Bakterielle Clones Overnatting i Deep-brønners Blocks
- Fjern en / T plater fra 37 ° C og bekreft bakterievekst.
- Fyll hver brønn av en 96-brønns dyp-brønn blokk med 1,5 ml av LB med 200 ug / ml Carbenicillin.
- Steriliser 96-pin portreplikator (se trinn 2.3).
- Påfør replikator til toppen av A / T plate, å sørge kartnålene gjør kontakt med hver bakteriell RNAi klone. Løft portreplikator og fordype pins inn i den dype-brønnen blokk. Virvel, og sakte fjernes, og gjøre certain ikke å forurense tilstøtende brønner.
- Forsegle blokk med puste-lett film. Inkuber over natten ved 37 ° C med omrøring (950 rpm i MT Infors Microtiteron II shaker, foretrukket, eller 250 rpm i en 25 mm-kaste risteinkubator).
Dag 3
4. Seed RNAi Bakterielle Clones bort på 96-brønners NGM RNAi Plates
- Fjern 96-brønns RNAi plater fra 4 ° C og varmes opp til romtemperatur.
- Fjerne dype-brønners blokker og sentrifuger 10 min ved 4000 x g..
- Raskt snu blokker i vasken å tappe media, og stemple vendes på papir håndkle for å fjerne overflødig medier.
- Under en laminær hette, tilsett 40 pl LB med 200 ug / ml Carbenicillin til hver brønn og tetning med steril film.
- Returner blokker til romtemperatur bakteriell shaker for 10 min å resuspendere pellets, eller manuelt resuspender pellets ved nøye pipettering.
- I laminær hette, fjerne steril film og overføre bakterier fra dype-vel blokker bort på 96-brønners RNAi plater. Tilsett 40 pl resuspenderte bakterier til rader 'A' og 'H', og 35 pl fra alle andre rader. Mer væske er lagt til kanten brønner på 96-brønners RNAi plate for å hindre uttørring og sprekkdannelse i agarose.
- La plater avdekket tørke i hette for 4-6 timers, inspeksjon regelmessig for tørrhet. Tørre bakterier vises tydelig, ikke regn. Dekker, inverterer platene og inkuber ved romtemperatur over natten.
5. Forbered en Synkron populasjon av Worms
To 10 cm plater fylt med mange gravid ormer benyttes for egg forberedelse for hver 6 96-brønners RNAi platene. Være sikker ormer er ikke-sultet i minst to generasjoner (7 dager).
- Forbered en synkron befolkning på L1 som tidligere beskrevet 20. For 20 ml blekemiddel, bruke 4 ml blekemiddel, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml avionisert H 2 O, og 10 ml M9 buffer.
- Synkroniser ormer natten i 10 ml M9 i et 15 ml steriltpolypropylenrør med rotasjon ved 20 ° C.
Dag 4
6. Legg Worms til RNAi Plates
- Sentrifuger egg preps ved 3000 xg i 1 min. Aspirer supernatant, bor borte fra pellet av L1 hatchlings. Resuspender i 5 ml M9 buffer med 0,0005% Triton X-100. Tilsetning av den lille mengden av vaskemiddel hindrer ormer fra stikker til pipetten og har ingen effekt på fett farging.
- Telle ormer under et mikroskop. Hvis det er nødvendig, justere konsentrasjonen til 10-15 ormer per mikroliter.
- I det laminære strømning hetten, for hver 96-brønns plate som skal sås, tilsett 75 pl av resuspenderte ormer i hver brønn av en rad av et grunt-vel assay blokk. Ved hjelp av en manuell multikanal pipette legg 50-75 ormer i 5 pl i hver brønn av de 96-brønners RNAi platene.
- Tillat platene tørke i hetten i 30 til 60 min. Når tørr, under et mikroskop, bør ormer synes å gjennomgå, ikke thrashing.
- Grow ormer på RNAi platerved 20 ° C i ~ 64 timer.
Dag 7
7. Fikse og Stain Worms i Nile Red
- Fjern RNAi plater fra inkubatoren. Undersøke under mikroskop og ta sultet eller juling (våt) brønner for å utelukke fra videre analyse, da disse forholdene påvirker fettmasse.
- Å bruke en elektronisk gjenta pipetten, tilsett 150 pl PBS med 0,01% Triton X-100 til hver brønn av en RNAi plate. Med en manuell flerkanals pipetten, bland og overføring væske med ormer til tilsvarende rad i en 96-dyp-brønns PCR-plate. Unngå å forstyrre agar. Gjenta til totalt 300 ul ormer i PBS per brønn.
- Når fire plater er blitt overført, sentrifuger platene ved 500 opm i 1 min.
- Aspirer supernatant ved hjelp av en 96-pinners vakuum aspirator, forlater ~ 25 pl væske og orm pellet ved bunnen av brønnen.
- Tilsett 150 ul av 40% isopropanol i hver brønn for å fikse dyr. Vær sikker på at pipetten er på et høyt nok fart til å blande ormenpellet med 40% isopropanol. Inkuber ved romtemperatur i 3 min.
- Sentrifuger platene avdekket ved 500 opm i 1 min.
- Aspirer supernatant ved hjelp av en 96-pinners aspirator eller manuelt, slik at bare 25 pl 40% isopropanol + ormen pellet ved bunnen av brønnen.
- Til hver brønn, tilsett 150 pl av Nil rød farging løsning tilberedes umiddelbart før bruk: 6 pl Nile rød stamoppløsning av 0,5 mg / ml i aceton per 1 ml 40% isopropanol.
- Seal plate med usterile klebefilmen og flekken i mørke i minst 2 timer.
8. Vask og bilde Worms på en High-throughput Microscope
- Sentrifuger ved 500 opm i 1 min og aspirere alle men 25 pl av Nile rødt fargestoff.
- Tilsett 150 ul PBS med 0,01% Triton X-100 til hver brønn og oppbevar i mørke i minst 30 min.
- Sentrifuger ved 500 opm i 1 min.
- Ved hjelp av en 12-kanals pipette, aspirer dyr fra bunnen av hver brønn med 2 x 7 pl raskslag og dispensere på en 96-brønners Teflon-trykte glass lysbilde. Nøye, uten å fjerne ormer, fjerne 9,5 ul PBS fra hver brønn lysbilde. Hvis glass lysbildet ikke passer direkte i mikroskop mount, må en tilpasset maskinert aluminium lysbildeholder brukes til å montere ormer.
- Sakte lavere dekning gli over 96-vel lysbilde. Dette trinnet kan ta litt praksis for å unngå bobler eller krysse over av ormer i andre brønner. Sikre hjørner med lim tack.
- Bilde lysbilde i lyse feltet og fluorescens med GFP / FITC filter satt på en automatisert mikroskop. Lipid signal photobleaches lett så det bør bli avbildet i en systematisk måte i alle brønnene, ikke manuelt, som photobleaching vil føre til kunstige forskjeller mellom brønnene. For mer informasjon om analyse, se Representant Resultater og Diskusjon.
9. Biokjemiske Lipid Bestemmelse Bruke Solid Phase Extraction (SPE) og gasskromatografi-massespektrometri (GC / MS)
- Vask 2,500-5,000 ormer fra hver 10 cm plate med 10 ml M9 buffer i en 15 ml konisk polypropylenrør. Pellet ormer ved 500 xg i ett minutt, og vaske pellet igjen med 10 ml M9-buffer. Pellet dyr på 500 x g. Aspirer forlater 250 pl totalt volum, og enten fryse på flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C under nitrogen for senere behandler eller gå direkte.
- Ormen pellet kan tas direkte til trinn 9.3 hvis triglyceride masse skal normalisert til phospholipid masse 8,13,21. Imidlertid hvis undersøkeren ønsker normalisering til proteininnholdet eller DNA innhold, bør ormen pellet bli sonikert på den høyeste intensiteten i et bad sonikator i 10 min, 30 sek på, 30 sek av, ved 4 ° C. Hvis proteinet eller DNA normalisering er ønsket, fjerne en 5 pl alikvot og bestemme total proteinkonsentrasjon ved hjelp av en Bradford reagens eller lignende eller totalt DNA innhold etter kolonnerensing bruke en UV spektrofotometer.
- Legg ormer til 1,5 ml 02:01 kloroform: metanol i et gjenget borsilikat glassrør. All overføring av organiske oppløsningsmidler bør skje ved bruk av glass pipetter.
- Ved hjelp av en 50 ul wiretrol pipette tilsett 25 nM fosfolipid standard i 50 pl, og 16,7 nM triglyceride standard i 50 pl. Begge standarder bør oppløses i 2:1 kloroform: metanol, avkortet tett,og lagret under nitrogen beskyttet mot lys i et -80 ° C fryser å unngå oksydasjon.
- Cap med fenoliske cap og virvle. Ekstraher i 1 time ved RT, vortexblanding hver 15 min.
- Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min. Overføre lavere organisk fase uten skrotter til en borosilicate kultur tube.
- Legg 0,3 ml 0,9% NaCl, Vortex og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min.
- Overføre bunn organiske lag til en frisk borsilikat kultur tube, sørge for ikke å overføre over noen av den vandige fase.
- Tørr organiske fase under nitrogen. Å begynne fastfase ekstraksjon (SPE) resuspender tørket lipid i 1 ml kloroform. Alternativt, for detaljert separasjon og analyse av distinkte lipidklasser, herunder fosfolipid klasser, glykolipider sphingolipids, diacylglyceroler, triacylglyceroler, frie fettsyrer, og kolesterolestere, tynnsjiktskromatografi som utviklet av Watts lab i C. elegans 22 kan brukes i stedet for SPE. Lipider kan også be separert ved HPLC, og fraksjoner analysert ved GCMS. Sofistikerte metoder for hel-lipidome profilering av liquid-chromatography/MS (LCMS) kan også brukes 23-26.
- Monter silika SPE kolonne på SPE manifold. Pre-ekvilibrere kolonnen med 3 ml kloroform. Tillat løsningsmiddel å strømme ved hjelp av tyngdekraften.
- Last lipid prøven ut SPE kolonne, samle gjennomstrømning i et gjenget borsilikat rør som en del av den første fraksjon (TAG fraksjon). Mest nøytrale lipider vil komme gjennom i denne første 1 ml gjennomstrømning. Tilsett 3 ml kloroform å fullt eluere TAG fraksjon, samle gjennomstrømning i TAG brøkdel røret.
- Fjern og cap den første samlingen tube, og erstatte med en ren samling rør. Eluere glykosfingolipider med 5 ml 09:01 aceton: metanol. Vi ikke rutinemessig analysere fettsyresammensetningen av denne fraksjon, kan det imidlertid inneholde verdifull informasjon og kan lagres for fremstilling av metylestere og gratis sphingoid baser for ytterligere analyse utnyttespesialiserte prosedyrer distinkte fra de for TAG og PL som tidligere beskrevet 27.
- Erstatt glykosphingolipid samling rør med en andre gjenget borosilicate samling rør. Eluere fosfolipider med 3 ml metanol (PL fraksjon).
- Fraksjoner kan bli lagret ved -80 ° C ved dette punktet avkortet tett under nitrogen. Tørr renset lipider under nitrogen. Til hastighet tørking, i en tørr varmeblokk ved 33 ° C. Aldri lagre lipider i tørket form, som de er spesielt utsatt for oksidasjon i tørket tilstand.
- Resuspender tørket lipid fraksjoner i 2 ml 2% H 2 SO 4 i metanol ved å virvle og inkuber avkortet tett over natten i en 55 ° C vannbad for å opprette Slike fettsyremetylestere. Care må tas for å få absolutt ingen vann i FAME reaksjon som dette vil i stor grad hemme derivatisering av lipider. Vi har funnet mer effektiv derivatisering av natten inkubering og litteraturen antyder mindre lipid oksidasjon skjer ved lavere temperaturer during FAME forberedelse 28. En alternativ og mer rask metode er å bruke 2 ml 2,5% H 2 SO 4 i metanol og derivatize i én time ved 70 eller 80 ° C 21,22,29.
- Neste morgen, fjerne fra bad og avkjøl. Tilsett 1,5 ml H 2 O (for å stanse reaksjonen) og deretter 0,3 ml heksan (for å trekke ut de Slike fettsyremetylestere) til hver TAG og PL fraksjon. Rist kraftig og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min.
- Veldig forsiktig fjerne bare topp heksan lag med en standard pipette eller Pasteur pipette. Dispensere inn autosampler tube. Vær sikker på å ikke inkludere noen sur metanol som dette vil ødelegge GC kolonne og MSD.
- Cap og last prøver på GC / MS. Prøven blir overført i heksan til en mikro-innlegget Agilent hetteglasset avkortet med en PTFE-silikon-PTFE skrukork. Det overføres til Agilent GCMS modellen 6890/5973N utstyrt med en Supelcowax-10 (24079) 30 meter, 250 mikron smeltet silisiumdioksyd kapillarkolonne. En mikroliter injiseres intoa splitless fjord innstilt på 250 ° C og 13,33 PSI Ultrapure Helium brukes en bærergass. Protokollen kjøre er som følger ved en konstant 1 ml per min:
| Trinn | Instruksjon | Målet Temperatur |
| 1 | Hold 2 min | 150 ° C |
| 2 | Rampe 10 ° C per minutt | 200 ° C |
| 3 | Hold 4 min | 200 ° C |
| 4 | Ramp 5 ° C per minutt | 240 ° C |
| 5 | Hold 3 min | 240 ° C |
| 6 | Rampe 10 ° C per minutt | 270 ° C |
| 7 | Hold 5 min | 270 ° C |
En 3 min oppløsningsmiddel forsinkelse brukes ved MSD å minimere slitasje på filAment. Deretter blir massene mellom 50 og 550 dalton påvist med MS firedoble settet på 150 ° C og MS kilden satt ved 230 ° C, med en termisk hjelpesystemer temperatur av 270 ° C.
Representative Results
Et eksempel på en avbildes plate som har blitt tatt gjennom fettet farging arbeidsflyten er vist i Figur 1. Spesifikke kontroller for høy fett (daf-2 insulin receptor RNAi), lav fett (lpd-3 protein som kreves for lipid lagring granulater i tarmen RNAi), liten og lite fett (fasn-1 fettsyre syntase RNAi), og tom vektor ( kontroll) viser variasjoner i fluorescensintensitet henhold til fett nivåer av dyrene, og de tilsvarende lipid beløp bestemmes av GC / MS-analyse (Figur 2). Vær oppmerksom på at genet inactivations fører til utviklingshemmede arrestert, vil små dyr ofte synes å ha mye lavere fett enn voksne kontroll dyr, uavhengig av tilknytning til energiomsetningen (figur 3). Sekundære analyser, inkludert farging analyse og lipid biokjemi med SPE-GCMS av vill-type kontroll dyr av en lignende utviklingsstadiet må gjøres for å sikre gyldigheten avliten eller utviklingshemmede arrestert positive treff. I tilfelle av fasn-1 RNAi (figur 2), dyr arrest i enten L2 eller L3 larvestadiet, og har fett farging lavere enn voksenkontroll RNAi, men ligner i overflod til L2-L3-kontrollene RNAi dyr (fett flekken prosent av voksen kontroll RNAi: 49,9 ± 4,5% for fasn-1 RNAi og 20,2 ± 2,1% for L2-kontroll RNAi, og 64,7 ± 1,3 for L3 kontroll RNAi). Alternativt, angitt biokjemisk analyse lavere TAG / PL ratio enn L2 scenen matchet N2 kontrolldyr (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 for fasn-1 RNAi og 46,1 ± 3,4 for scene-matchet kontroll RNAi, P ≤ 0,05). Dermed i dette tilfellet kan det være bekreftet av biokjemiske analysen at fasn-1 har en rolle i lipid lagring i stedet for bare en scene-spesifikk reduksjon i fettmasse.
Oppfølgingen analyse for bildebehandlet ormer avhenger svært mye på en beregningsorientert plattform som Cell Profiler hjelpden WormToolbox 30. For mindre antall bilder, kan en offentlig tilgjengelig bildeanalyse plattform som ImageJ, fritt tilgjengelig fra NIH, brukes. For vår analyse, var unik Matlab skript brukes først for å identifisere brønnen, og deretter å utelukke tomme brønner eller de med bobler, og skille små rusk fra ormer. Manuell kvalitetskontroll var nødvendig for bilder som er flagget for utelukkelse av grunner som er nevnt ovenfor. Vi fant empirisk at 90-persentilen intensiteten ormen piksler over en godt, normalisert til ormen området over en brønn, forutsatt konsekvent beregning av fargeintensitet i alle faser av ormen utvikling (figur 3). Integrering total fettmasse over området av ormen, tvert imot, ville tendens til å score små lyse ormer ekvivalent med store dim ormer. Fordi vår metode ikke integrere total fluorescenssignalet over området av ormen, i å ta en intensitet persentil, endringer i ormen størrelse per se gjør ingent skjevhet intensiteten målt. I stedet er forskjeller i pikselintensiteten fordelingen målt. Imidlertid, på tross av dette, er store forskjeller sett i farging pikselintensiteten fordeling mellom dyr av ulike utviklingsstadier, så det er viktig å studere effekten av RNAi til enhver genet mot dyr med en sammenlignbar utviklingsstadiet (figur 3). Gjennomsnitt variabilitet mellom replikater er vist i Figur 4 indikerer høy reproduserbarhet av fettet farging metoden. Merk at styrken av metoden er svært avhengig skaffe kvalitetsbilder for hver plate under ensartet belysning veibane ved hjelp identiske eksponeringstider, og med minimale bobler, rusk eller krysset av ormer i andre brønner.
SPE ble utført på pre-blandet, renset standarder for å bestemme i hvilken grad TAGs kunne skilles fra PLS (figur 5A). I denne analysen oppnådde vi en 100% separation av TAG og PL, indikert som en fullstendig fravær av 17:00 fettsyrer avledet fra PL i TAG prøven og en tilsvarende fullstendig fravær av 13:00 fettsyrer avledet fra TAG i PL prøven (Figur 5A). Dermed SPE er svært effektiv til å skille lipidklasser. Denne analysen indikerer ikke at alle kodene i ulik kjedelengde vil bli renset ekvivalent av SPE og oppdaget av GCMS med liknende effektivitet. Det sikrer bare at TAG og PL lipider totalt er helt atskilt fra hverandre.
En prøve GC-MS spor av N2 villtype dyr, tatt gjennom fastfase ekstraksjon og FAME forberedelse er vist i figur 5B. For både TAG og PL, kan topper identifiseres basert på retensjonstid og foreldre og datter ioner på massespektrum, og det totale areal under de identifiserte toppene normalisert til området av de respektive interne standarder. For å bestemme mengden av normaliserte TAG, områdetunder alle toppene av TAG kromatogrammet, unntatt 13:00 standarden, ble lagt sammen og delt på arealet under 13:00 peak. Likeledes, for å bestemme den normaliserte totale PL beløp, arealet under alle topper, unntatt 17:00 standarden, ble lagt sammen og delt på arealet under 17:00 peak. De normaliserte verdier for TAG og PL prøvene blir deretter brukt til å beregne den endelige TAG / PL-forholdet for prøven:
Det bør bemerkes at dataene fra SPE-GCMS tillater en mye mer sofistikert analyse av fettsyrer som er tilstede i hver lipidfraksjonen enn enkel beregning av den totale TAG til PL-forhold. For eksempel, kan undersøkeren integrere en enkelt topp som tilsvarer en enkelt fettsyre og sammenlign den normalisert overflod tvers prøver (f.eks comparing i N2 villtype versus daf-2 RNAi den integrerte delen av 18:00 peak delt på 13:00 standard topp, normalisert til total PL masse delt på PL 17:00 standard peak område):
Bør undersøkeren velge, ville det også være mulig å bestemme prosentandelen av enhver fettsyre i TAG eller PL fraksjoner som en prosentandel av den totale mengden av fettsyre kvantitert (som eksempel 18:00 i TAG fraksjonen i N2 ormer ):
Figur 1. Typisk arbeidsflyt for den samlede eksperimentet. Dag 1, er frosne RNAi bibliotek platene stemplet bort Amp / Tet LB agarplater og inkubert ved 37 ° C. Dag 2, Amp / Tet plater som brukes til å frø flytende kulturer av RNAi kloner i dyp brønn blokker. Dag 3, er bakterier konsentrert ved sentrifugering og overført til 96-brønns RNAi platene. Dag 4, L1 hatchling C. elegans tilsettes RNAi platene i væske og får tørke. Dag 7, er dyr samles i væske, farget med Nile rødt i 40% isopropanol, montert på 96-brønners Teflon lysbilder, og avbildes med en high-throughput mikroskop.
Figur 2. Fiksativ-baserte Nile røde flekker store
Figur 3. Fettmasse bestemmes av fiksering Nile rød flekker på ulike larvestadier. Dyr ble dyrket på OP50 bakterier og samlet på L1, L2, L3, L4 og gravid voksen utviklingsstadier. Bilder ble tatt etter fiksering flekker og analysert ved hjelp av en tilpasset Matlab skript for å fastslå den 90 persentilen of pikselintensiteten over identifiserte ormen området. Merk at lipidnivåer av dyr øke som dyret utvikles fra L2 til L4 stadium, og deretter redusere litt som dyret begynner å viderekoble kalorier mot spredning av kimlinje i voksne stadiet. Data som vises er gjennomsnitt ± SEM for 6-8 replikater (**, P ≤ 0,0001 i forhold til gravid voksen, bestemt av uparet, tosidige T-test).
Figur 4. Høy reproduserbarhet over uavhengige biologiske replikater. Vist er et punktplott av Nile røde fluorescensintensiteter tvers biologisk replikater (n = 6-8). For hver gjengivelse, er alle verdier normalisert til den midlere intensitet av den tomme vektor kontrollene. Data som vises er gjennomsnitt ± SEM (**, P ≤ 0,0001 i forhold til kontroll, bestemmes av uparet, tosidige T-test forutsattlik varians).
Figur 5. GC-MS kromatogrammer av SPE skilt standarder og villtype Tags og PL overflod. (A) GC-MS spor vises av SPE separasjon av TAG og PL standarder. Obs fullstendig fravær av 13:00 fettsyre i PL kurven og korresponderende fravær 17:00 fettsyre i TAG spor, indikerer fullstendig skille TAG (tritridecanoin) fra PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero -3-fosfo-(1'-rac-glycerol)). (B) En representant hele spekteret av TAG og PL fra et utvalg av N2 villtype dyr fôres vektor kontroll RNAi (HT115 bakterier med L4440 tom vektor RNAi). En mikroliter av prøven ble injisert inn i en Agilent 6890/5973N GCMS i henhold til protokollen, og enkelte topper ble identifisert ved retention tid og deres respektive massespektra. Forkortelser: cyclo, cyclopropane fettsyrer, iso:. Iso-metyl forgrenet fettsyre; GLA, gamma linolenic acid; ALA, alfa linolensyre, DGLA, dihomo gamma linolenic acid; EPA, eikosapentaensyre Klikk her for å se større figur .
Discussion
Den presenterte Protokollen tillater hurtig, storskala screening av lipidnivåer i C. elegans, som lett kan tilpasses høy gjennomstrømning skjermer. I motsetning til tidligere brukte metoder, som innebærer en lang fiksering skritt i paraformaldehyd etterfulgt av flere fryse-tine sykluser 8,10, krever vår protokoll en enkel 3-min fiksering i isopropanol. Vi har funnet at ved å farge C. elegans i 40% isopropanol, blir de fritt gjennomtrengelig for Nile rødt, uten bruk av ytterligere fryse-tine eller fiksering trinnene. Også, som Nile rød selektivt fluorescerer i hydrofobe oppbevaringsrom i grønne spektrum 18,19,31, er ingen destaining nødvendig. Totalt, kan dyr bli tatt fra RNAi platene til farget og klar til å ta bilder dyr i overkant 2,5 hr. Denne metoden kan utføres relativt billig og med høy reproduserbarhet. Metoden avhenger ikke evnen av C. elegans til opptak eller konsentratfargestoff, og derfor ikke har de samme begrensninger som fôring baserte metoder ved hjelp av vitale fargestoffer. Gitt reproduserbarhet og presisjon av målinger, er metoden egnet for screening stort antall genet inactivations etter RNAi. Hvis kvantifisering av lipid nivåer er ønskelig basert på fiksativ Nile rød flekker, anbefaler vi bruk på 4-6 biologiske replikater med de riktige kontrollene og statistisk testing brukes.
Det er sannsynlig at mange gener inactivations fører til små dyr (på grunn av RNAi kloner forårsaker forsinket eller arrestert utvikling) vil komme ut av en skjerm for fett regulatorer, uavhengig av tilknytning til energiomsetningen. Mens bildeanalyse programmet vi utnyttet står for ormer i forskjellige størrelser ved å normalisere fluorescensintensiteten til ormen området, kan enkelte forskere ønsker også å vurdere å sammenligne fett flekker nivåer av små dyr med villtype dyr av en lignende utviklingsstadiet. IVed små eller utviklingshemmede arrestert dyr med tilsynelatende lav fettmasse, foreslår vi at ingen enkelt modalitet er tilstrekkelig til å demonstrere endret lipidmetabolismen. Flere oppfølgingseksperimenter inkludert SPE-GCMS, kan være nødvendig for å fastslå den lipid-regulerende funksjon av disse genene. For kjent metabolsk regulator fasn-1, SPE-GCMS analyse i forhold til utviklingshemmede matchet N2 L2 kontroll dyr var nødvendig for å bekrefte den tilsynelatende lite fett fenotype funnet når sammenlignet med voksne kontroll dyr. Mens Nile rød fett flekker indikert lavere fettinnhold i forhold til å kontrollere voksen RNAi, sammenlignet med scene-matchet L2 kontroll RNAi dyr, ble ingen åpenbar forskjell sett. Følgelig, bruk av en annen metode, ble dvs. biokjemiske kvantifisering av TAG / PL ratio er nødvendig for å fastslå at fasn-1 er en sann regulator av fettmasse, som fasn-1 RNAi er biokjemisk skjelnes fra scenen matchet L2 kontroll RNAi dyr.
20 eller på konvensjonelle størrelse Teflon-trykt 8-12 vel mikroskopobjektglass . Den eneste begrensningen er at som den grønne fluorescens av lipid dråper farget med Nile røde photobleaches raskt, systematiske, ensartede eksponeringsforhold må brukes til å sikre sammenlignbarhet mellom bildene. Vi finner at en helautomatisk mikroskop med ensartede bildetakingsenheter forhold fungerer best om dette.
En av de store styrkene til denne protokollen er at etter bildene er samlet de kan lagres for fremtidig re-analyse. Samme bilder kunne brukes til å bestemme kroppsstørrelse i tillegg til fettinnhold. Videre, ettersom beregningsorientert programmer blir mer avansert, er utsiktene for enkelt ormen analyse, genererer statistisk signifikante resultaterfra en enkelt brønn. Dermed vår metode som benytter high-throughput mikroskopi har noen fordeler fremfor publiserte skjermen metoder som bruker en Copas Biosort å kvantifisere fluorescerende signaler 32,33. Men de metoder er definitivt gratis.
Presis, biokjemisk bestemmelse av fettinnhold av SPE og GC / MS bekrefter Nilen rød flekker av de store fete butikker i C. elegans. Selv om det absolutte kvantifisering oppnådd fra fiksativ Nile rød flekker og biokjemiske lipid besluttsomhet ofte ikke matche perfekt, begge metodene produsere svært reproduserbare, statistisk signifikante resultater som samtykker kvalitativt. I tillegg kan denne metoden være skreddersydd for å møte de spesielle behovene til den enkelte forsker som kan kreve ytterligere analyse av de enkelte klasser av glykosfingolipider, fosfolipider, eller triglyserider er tilstede i forskjellige prøver. Det bør bemerkes at andre grupper har brukt teknologi andre than SPE å skille lipidklasser før GC / MS 22. Tynnsjiktskromatografi (TLC) og høytrykks væske-kromatografi (HPLC) har fordeler fremfor SPE i at de kan være i stand til å bedre separate distinkte nøytrale lipider (f.eks Tag, diacylglyceroler, frie fettsyrer, og kolesterolestere) fra polare lipider (fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin) og glykol-sphingolipids. Vi velger SPE fordi det krever et minimum av utgangsmaterialet (2,500-5,000 ormer), understreker det store langsiktige energi butikker, tags, som utgjør mesteparten av den nøytrale lipidfraksjonen 4, og er rask, krever ingen spesialisert utstyr eller platene. Det bør understrekes at basert på standard blandinger, skiller SPE helt koder fra PL, og er reproduserbar og pålitelig (se figur 5A). Mens quantitation og analyse av fettsyremetylestere trenger en GC / MS, er dette utstyret allment tilgjengelig, og hvis ikke lokalt, prøver kanbli generert som ovenfor og lagret ved -80 ° C under nitrogen inntil analyse av en samarbeidspartner eller kommersielle GC / MS-tjenesten er anordnet.
Den GCMS utgang inneholder høyoppløselige data på hver fettsyre innen hver lipid arter. Dette tillater bestemmelse av detaljerte forskjeller mellom prøver sammenlignet. Som et eksempel, kunne undersøkeren avgjøre om nivåene av visse fettsyrer ble endret i overflod mer betydelig enn andre i DAF-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi versus vektorkontroll. Dette enormt kraftig verktøy kan derfor gi detaljert informasjon om hvilke lipid arter endres i overflod med noen eksperimentelle manipulasjon.
For vår analyse, vi oftest normalisere TAG masse til PL masse. Mens protein eller DNA kan også bli brukt til å normalisere lipid massen etter bestemmelse fra en aliquot av sonikert ormen pellet, finner vi at disse metodene forutsetter introduced menneskelige feil i alle pipetteringsutstyr trinn og i prøve utvinning fra hver utvinning. Det er av denne grunn at vi valgte å i stedet bruke PL masse som vår normalisering faktor. Unaturlige standarder innføres ved starten av protokollen (tritridecanoin for TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) for PL) føres gjennom alle trinnene av fastfase ekstraksjon og FAME forberedelse, og garanterer kvantitativ og representativ utvinning av både TAG og PL fraksjoner. Samme garanti kan ikke gjøres dersom etterforskerne bruke protein eller DNA å normalisere TAG masse. Vi tror PL for å være den mest robuste måleren som å sammenligne TAG nivåer over prøvene, som det tidligere har vært vist at PL bare minuttbasis endret av samme stimulans bevirke stor masse skift i TAG nivåer, f.eks utvidet sult eller økt mosjon 34 - 36. PL er tenkt å spille en strukturell rolle, sikre membran flyt og mobilnettet integrity og signalering roller snarere enn som energilager 37-39. I våre hender, TAG / PL ratio ligner mest det som oppnås ved fiksativ-baserte lipid farging med Nile rødt, og er enig med det som ble funnet av andre grupper 21. En alternativ strategi er brukt av Watts laboratoriet, hvor andelen av lipid TAG beregnes versus totale lipider 9,22,29.
Bruken av ikke-innfødte typer TAG og PL standard garanterer at ingen innfødte fettsyrer vil bli inkludert i normalisering beregningen. Valget av kjedelengde er utelukkende basert på behovet av disse standardene for å ikke forstyrre den massespektra av innfødte fettsyrer. Vi har funnet at fettsyrer av 13:00 og 17:00 tjener best for dette formål. Det er mulig, gitt de forskjellige kjemiske egenskaper kortere fettsyrer, at våre unaturlige fettsyre standarder ikke kan være representativ for gjenvinning av alle kjedelengde fettsyrer eller kjeder med different metning indekser. Således er det mulig at i løpet SPE eller GCMS kan vi se forskjeller i effektiviteten av rensing eller påvisning mellom lipider av forskjellige kjedelengder. Basert på dette og annen ionisering av forskjellige fettsyrer i GCMS, er det ikke mulig å foreta en absolutt uttalelse om overflod av enhver fettsyre. Derfor har vi bare sammenligne mellom prøvene innenfor ett enkelt eksperiment abundances av enhver fatty acid. Hvis man ønsker å absolutt kvantifisere en fettsyre, en måte dette kan oppnås er å kjøre en prøve fremstilt som ovenfor tilsatt en kjent mengde av en stabilt isotopically merket 13 C versjon av det eller lignende fettsyre, slik at det kunne være skilles basert på massen til den ion i MSD, for eksempel. Gitt at vi bare sammenligne relative mengder lipidklasser eller enhver fettsyrer, vår 13:00 TAG og 17:00 PL standarder tjene dette formålet tilstrekkelig, på et minimum av kostnader, for åsikre tilstrekkelig og representativt utvinning av hver lipid klasse.
Til dette punktet, har det vært en mangel på konsensus om tolkningen av visse resultater erholdt ved forskjellige metoder, og i hvilken de rådende metoder bør være. Samlet det bør bemerkes at ingen metode isolert er ideell for å studere fettstoffskiftet i C. elegans. Men ved å bruke flere screening og validering modaliteter, kan man oppnå tillit data fremskaffet på lipid regulatoriske gener. Dermed vil vi for vår protokoll for å tjene som en målestokk for det videre arbeidet innen C. elegans fett forskning.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser å utlevere.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Michael Kacergis for teknisk bistand og Lianfeng Wu for diskusjoner og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en karriereutvikling pris fra NIH / NIDDK (K08DK087941 til AAS), en NIH / NIDDK trening stipend (5T32DK007028 til ECP), den Ellison Medical Foundation New Scholar i Aldring Award (til AAS), og Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (til AAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
- Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
- Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
- Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
- Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
- Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
- Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
- McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
- Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York. 304 (1999).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
- Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
- Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
- Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
- Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
- Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
- Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. , Oily Press. 69-111 (1993).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
- Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
- Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
- Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
- Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
- Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
