Summary
Vi presenterar robusta biokemiska och mikroskopiska metoder för att studera
Abstract
Nematoden C. elegans har blivit en viktig modell för studier av bevarade genetiska vägar reglerar fettomsättningen eftersom det gäller mänskliga fetma och dess associerade sjukdomar. Flera tidigare metoder utvecklats för visualisering av C. elegans triglycerid-rika fettdepåer har visat sig vara felaktiga, lyfta cellulära fack än lipid droppar. Andra metoder kräver specialutrustning, är tidskrävande, eller ge motsägande resultat. Vi introducerar en snabb, reproducerbar, fixativ-baserade Nilen röd färgning metod för noggrann och snabb detektion av neutral lipid droppar i C. elegans. En kort fixering steg 40% isopropanol gör djuren helt genomsläppliga för Nile Red, som sedan används för att färga djur. Spektrala egenskaperna hos denna lipofila färgämne gör det möjligt att starkt och selektivt fluorescerar i det gulgröna spektrum endast när en lipid-rik miljö, men inte i merpolära miljöer. Således kan lipiddroppar visualiseras på ett fluorescerande mikroskop utrustat med enkel GFP avbildande förmåga efter endast en kort Nile röd färgning steg i isopropanol. Hastigheten, överkomliga och reproducerbarhet av detta protokoll gör den idealisk för hög kapacitet skärmar. Vi visar också en parad metod för biokemisk bestämning av triglycerider och fosfolipider med gaskromatografi-masspektrometri. Detta strängare protokoll ska användas som en bekräftelse på resultaten från Nilen röd mikroskopisk lipid beslutsamhet. Vi räknar med att dessa tekniker blir nya standarder inom C. elegans metabolisk forskning.
Introduction
Bevarande av metaboliska vägar mellan människa och nematoden elegans Caenorhabditis gör den till en kraftfull modell organism för att studera fetma. Medan C. elegans har inte adipocyter tillägnad fett lagring som i däggdjur, de lagrar triglycerider i lipiddroppar 1 och har många av samma regulatorer av fett lagring och energianvändning 2,3. För att analysera fettnivåer i C. elegans, har flera metoder föreslagits med varierande nivåer av lätthet och framgång. Den en gång gemensamma användningen av fluorescerande, viktiga färgämnen 4-7 nyligen ifrågasatts, och dessa reagenser visade sig vara färgning en avdelning skild från den huvudsakliga fett lager som av C. elegans 1,8-11. Fixativ-baserade icke-fluorescerande färgämnen, såsom Sudan svart och Oil-röd-O, medan framgångsrika i att belysa lipid droppar i masken 12-14, inte har så stor dynamiskt område för kvantifiering som fluorescerandecent färgämnen 8,13,15. Dessutom, nuvarande metoder för fixering för både fluorescerande och icke-fluorescerande färgämnen är tidskrävande och innebär flera frys-tö steg och / eller användning av giftiga kemikalier 1,9,10. Användning av särskilda BODIPY-märkta lipid-analoger har rapporterats att belysa lipiddroppar när de ges till levande maskar med kortsiktiga märkning 15. Men detta bygger på upptag av färgämnet och därför förspänd med C. elegans hantering och metabolism av BODIPY fettsyraanaloger. En etablerad alternativ till lipid-färgning färgämnen är etikett-fri, sammanhängande anti-Stokes Ramanspridning (CARS) eller stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi, som utnyttjar de karakteristiska vibrationella egenskaper lipidmolekyler att visualisera fettdepåer 10,16, 17. Emellertid är dyrbar specialiserad utrustning som behövs för denna metod, och genomströmningen är låg i bästa.
För att uppfylla ett behov av snabba, skalbara anasis av neutrala lipid butiker i C. elegans metabolisk forskning, introducerar vi en ny, mycket reproducerbar metod för fixativ-baserade Nilen röd lipid färgning. Spektrala och fysikalisk-kemiska egenskaper hos lipofila färgämnet Nile Red inducerar en guldgul-spektral förändring i sin excitation-emissionstoppen, gör det möjligt att fluorescera i det gröna emissionsspektrum endast när i en lipid-rik miljö, men inte i mer polära miljöer 18 , 19. Sålunda lipiddroppar kan detekteras efter enkel färgning med användning av ett grönt fluorescerande protein (GFP)-filter in för fluorescensmikroskopi. Den lätthet och överkomliga priser på denna teknik gör den idealisk för hög kapacitet skärmar. Vi visar också en parad, rigorös metod för biokemisk bestämning av triglycerider och fosfolipider med fastfasextraktion och gaskromatografi-masspektrometri. Biokemisk lipid mätning korrelerar med Nile Red-baserad mikroskopisk bestämning av C. elegans fat massa och bör användas som en bekräftelse av iakttagelser som gjorts med mikroskopisk lipid beslutsamhet.
Protocol
1. Beredning av Rektangulär Amp / Tet (A / T) LB agarplattor och NGM IPTG RNAi Plattor
A / T plattorna bör framställas 1-4 veckor före användning och lagrades i mörker vid 4 ° C.
- För 1 liter medium tillsätt 1 L avjoniserat vatten, 32 g LB-agar, 1,5 ml 2 M NaOH, och 2 g Bacto-agar. Autoklav 40 min på flytande cykel. Efter kylning till 60 ° C, tillsätt 3 ml tetracyklin och 0,5 ml ampicillin. Häll 45 ml av media i varje platta.
Förbered 96-håls RNAi plattor 3 dagar upp till 2 veckor i förväg.
- Att hälla 25 96-brunnars plattor RNAi, förbereda 1 L nematod tillväxt medium (NGM): 1 L avjoniserat vatten, 3 g NaCl, 17 g agaros, och 2,5 g baktopepton. Autoklav flytande cykel vid 121 ° C under 40 min med en omrörarstav. Låt svalna, under omrörning på en het platta inställd på 60 ° C.
- Låt svalna till 60 ° C, tillsätt följande stamlösningar: 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KH 2 4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaClj 2, 1 ml 200 mg / ml karbenicillin och 5 ml 1 M IPTG (se Material tabell för recept).
- Dispensera 150 pl av RNAi medium i varje brunn i en flatbottnad 96-brunnsplatta med en elektronisk multikanalspipett. Undvik luftbubblor. Förvara media i en steril rostfri behållare nedsänkt i ett 60 ° C vattenbad under dispensering.
- Håll RNAi plattor nivå tills agaros stelnar. Plattor kan hällas upp till 2 veckor i förväg och lagras vid 4 ° C.
Dag 1
2. Stämpel Frysta Bibliotek Plattor på Rektangulär Amp / Tet (A / T) LB agarplattor
- Värm A / T-plattor till rumstemperatur, hålla dem i mörkret.
- Transfer 96-brunnars RNAi bibliotek plattor från -80 ° C för att torka is. Öppna aluminium-förseglade plattan nära en bunsenbrännare.
- Sterilisera en 96-polig replikator genom nedsänkning stift seriellt (10 sek vardera) i 10% blekmedel, avjoniserat H 2 O och 70% EToh följt av passage stift genom en flamma. Upprepa EtOH och flamma steg.
- Applicera replikator till frysta 96-håls RNAi glycerol lager, se varje stift i kontakt med ytan av varje brunn.
- Stamp på A / T platta, ritar en liten cirkel med varje stift utan att skada agarytan.
- Re-tätning och retur bibliotek plattor till -80 ° C. Inkubera stämplade A / T-plattor vid 37 ° C över natten för bakterietillväxt.
Dag 2
3. Grow RNAi Bakteriekloner Övernattning i Deep brunnar block
- Ta bort en / T plattor från 37 ° C och bekräfta bakterietillväxt.
- Fyll varje brunn i en 96-brunnars djupt väl blocket med 1,5 ml LB med 200 pg / ml karbenicillin.
- Sterilisera 96-stifts replikator (se steg 2,3).
- Applicera replikator till toppen av A / T-platta, att se till stift gör kontakt med varje bakteriell RNAi klon. Lyft replikator och fördjupa stift i den djupa brunnar blocket. Snurra, och långsamt bort, vilket gör certain inte förorena intilliggande brunnar.
- Täta block med andas-lätt film. Inkubera över natten vid 37 ° C med omröring (950 rpm i MT Infors Microtiteron II skakapparat, föredras, eller 250 rpm i en 25 mm-kasta skakinkubator).
Dag 3
4. Seed RNAi Bakteriekloner på 96-och NGM RNAi Plattor
- Avlägsna 96-brunnars plattor RNAi från 4 ° C och värm till rumstemperatur.
- Avlägsna djupt väl block och centrifugera 10 minuter vid 4.000 x g..
- Snabbt invertera block i diskhon för att dränera media och stämpel inverterad på papper handduk för att eliminera överflödigt material.
- Under en huv med laminärt flöde, tillsätt 40 pl LB med 200 pg / ml karbenicillin till varje brunn och tätning med steril folie.
- Återgå block till rumstemperatur bakteriell skakare under 10 minuter för att återsuspendera pellets eller manuellt återsuspendera pelletar genom försiktig pipettering.
- I laminärt flöde huva, ta bort steril film och bakterier överföring från djup-väl block på 96-och RNAi-plattor. Tillsätt 40 pl återsuspenderade bakterier till raderna "A" och "H", och 35 | il från alla andra rader. Mer vätska tillsätts till kant brunnar på 96-brunnars RNAi platta för att förhindra övertorkning och sprickbildning av agarosen.
- Låt plattorna avslöjats torka i huven för 4-6 timmar, inspektera regelbundet för torrhet. Torra bakterier verkar klart inte grumlig. Omslag, vänd plattorna och inkubera vid rumstemperatur över natten.
5. Förbered en synkron Befolkning i Worms
Två 10 cm plattor fyllda med många gravida maskar används för ägg inför varje 6 96-brunnars RNAi plattor. Var noga med maskar är inte svalt i minst två generationer (7 dagar).
- Förbered en synkron population av L1 som tidigare beskrivits 20. För 20 ml blekmedel, använd 4 ml blekmedel, 1 ml NaOH (10 M), 5 ml avjoniserat H 2 O och 10 ml M9 buffert.
- Synkronisera maskar natten i 10 ml M9 i en 15 ml sterilpolypropylenrör med rotation vid 20 ° C.
Dag 4
6. Lägg Worms till RNAi Plates
- Centrifugera ägg preps vid 3.000 x g under 1 min. Sug supernatanten borta från pelleten av L1 ungar. Återsuspendera i 5 ml M9-buffert med 0,0005% Triton X-100. Tillsättning av den lilla mängd tvättmedel förhindrar maskar från att fastna pipetten och har ingen effekt på fett färgning.
- Räkna maskar under ett mikroskop. Om det behövs justerar koncentrationen till 10-15 maskar per mikroliter.
- I huv med laminärt flöde, för varje 96-brunnsplatta som skall ympas, tillsätt 75 pl återsuspenderade maskar i varje brunn av en rad av ett grunt väl analys blocket. Med hjälp av en manuell multikanalpipett, lägg 50-75 maskar i 5 pl till varje brunn i 96-brunnars plattor RNAi.
- Låt plattorna torka i huven under 30 till 60 min. När torr, under ett mikroskop, bör maskar verkar krypa, inte stryk.
- Odla maskar på RNAi-plattorvid 20 ° C under ~ 64 timmar.
Dag 7
7. Fix och Stain Worms i Nile Röd
- Avlägsna RNAi plattor från inkubatorn. Undersök i mikroskop och spela svalt eller stryk (våt) brunnar som ska undantas från vidare analys, eftersom dessa tillstånd påverkar fettmassa.
- Användning av en elektronisk repetitionspipetten lägg 150 pl PBS med 0,01% Triton X-100 till varje brunn i en platta RNAi. Med en manuell flerkanalig pipett, blanda och överföra vätska med maskar till motsvarande rad i en 96-djupt väl PCR-platta. Undvik att störa agar. Upprepa för totalt 300 pl maskar i PBS per brunn.
- När fyra plåtar har överförts, centrifugera plattorna vid 500 rpm under 1 minut.
- Aspirera supernatanten med användning av en 96-polig vakuumsug, lämnar ~ 25 | il vätska och mask pellet vid botten av brunnen.
- Tillsätt 150 | il 40% isopropanol till varje brunn för att fixera djur. Se till att pipetten är på en tillräckligt hög hastighet för att blanda maskenpelleten med 40% isopropanol. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter.
- Centrifugera plattor avslöjats vid 500 rpm under 1 minut.
- Aspirera supernatanten med användning av en 96-polig suganordning eller manuellt, vilket innebär att endast 25 pl 40% isopropanol + mask pellet vid botten av brunnen.
- Till varje brunn, tillsätt 150 pl av Nile Red färglösning framställdes omedelbart före användning: 6 pl Nile Red förrådslösning av 0,5 mg / ml i aceton per 1 ml 40% isopropanol.
- Tätningsplattan med icke-steril självhäftande film och fläckar i mörker under minst 2 timmar.
8. Tvätta och Bild maskar på en hög kapacitet mikroskop
- Centrifugera vid 500 rpm under 1 minut och aspirera alla utom 25 il Nile röd färg.
- Tillsätt 150 pl PBS med 0,01% Triton X-100 till varje brunn och lagra i mörker under minst 30 minuter.
- Centrifugera vid 500 rpm under 1 minut.
- Med hjälp av en 12-kanals pipett, aspirera djur från botten av varje brunn med 2 x 7 ul snabbstroke och fördela på en 96-brunnars Teflon-tryckt glasskiva. Försiktigt, utan att ta bort maskar, ta bort 9,5 il PBS från varje brunn i bild. Om glasskiva inte passar direkt i mikroskop montering måste en anpassad maskinbearbetad aluminium hållaren användas för att montera maskar.
- Sakta lägre lock skjut på 96-brunnars objektglas. Detta steg kan ta lite övning för att undvika bubblor eller gå över av maskar i andra brunnar. Säkra hörn med adhesiv fästanordning.
- Bild bilden i ljusa fält och fluorescens med GFP / FITC-filter satt på en automatiserad mikroskop. Lipid signal photobleaches lätt så det bör avbildas på ett systematiskt sätt i alla brunnar, inte manuellt, eftersom fotoblekning kommer att leda till konstgjorda skillnader mellan brunnar. För mer information om analysen, se Representativa Resultat och diskussion.
9. Biokemisk Lipid Fastställande Använda Solid Phase Extraction (SPE) och gaskromatografi-masspektrometri (GC / MS)
- Tvätta 2,500-5,000 maskar från varje 10 cm platta med 10 ml M9-buffert i ett 15 ml koniskt polypropylenrör. Pellet maskar vid 500 x g under en minut, och tvätta pelleten återigen med 10 ml M9-buffert. Pelletsbrännare djur vid 500 x g.. Sug lämna 250 ul total volym, och antingen frysa på flytande kväve och förvaras vid -80 ° C under kväve FOr bearbetning senare eller gå direkt.
- Masken pellets kan tas direkt till steg 9,3 om triglycerid massa ska normaliseras till fosfolipid massa 8,13,21. Men om utredaren önskar normalisering till proteinhalten eller DNA-halt, skall masken pelleten sonikeras på den högsta intensiteten i en badsonikator under 10 min, 30 sek på, 30 sekunder av, vid 4 ° C. Om protein eller DNA-normalisering önskas, avlägsna en 5 pl alikvot och bestämma total proteinkoncentration med användning av en Bradford-reagens eller liknande eller totala DNA-innehållet efter kolonnrening med användning av en UV-spektrofotometer.
- Lägg maskar till 1,5 ml 2:1 kloroform: metanol i en gängad borosilikat glasrör. All överföring av organiska lösningsmedel bör göras med glaspipetter.
- Med hjälp av en wiretrol 50 ul pipett, tillsätt 25 standarden nM fosfolipid i 50 ^, och 16,7 nM triglycerid standard 50 pl. Båda standarderna ska lösas upp i 2:1 kloroform: metanol, maximerad tätt,och lagrades under kväve skyddas från ljus i en -80 ° C frys för att undvika oxidering.
- Keps med fenol lock och skaka. Extrahera under 1 timme vid RT, vortexa varje 15 min.
- Centrifugera vid 1.000 rpm under 5 min. Överför lägre organisk fas utan slaktkroppar till en borosilikat kultur rör.
- Lägg 0,3 ml 0,9% NaCl, vortexa och centrifugera vid 1.000 rpm under 5 minuter.
- Överför botten organiska skiktet till ett nytt borsilikat kultur rör, se till att inte överföra över någon av vattenfasen.
- Torr organiska fasen under kväve. Till att börja fastfasextraktion (SPE) återsuspendera torkad lipid i 1 ml kloroform. Alternativt, för detaljerad separering och analys av distinkta lipidklasser, inklusive fosfolipid klasser, glykolipider, sfingolipider, diacylglyceroler, triacylglyceroler, fria fettsyror och estrar kolesterol, pionjärer tunnskiktskromatografi som av Watts labb i C. elegans 22 kan användas i stället för SPE. Lipider kan också be separerades genom HPLC och fraktionerna analyserades med GCMS. Sofistikerade metoder för hel-lipidome profilering av liquid-chromatography/MS (LCMS) kan också användas 23-26.
- Montera kolumn kisel SPE på SPE grenröret. Pre-utjämnas kolonn med 3 ml kloroform. Låt lösningsmedel rinna av tyngdkraften.
- Ladda lipid prov på SPE-kolonn, samla genomströmning i ett gängat borsilikat tub som en del av den första fraktionen (TAG fraktion). De flesta neutrala lipider kommer att gå igenom i denna första 1 ml genomflöde. Tillsätt 3 ml kloroform till fullo eluera TAG fraktion, samla genomströmning i taggen fraktionen röret.
- Ta bort och sätta ett tak första uppsamlingsröret och ersätt med en ren samling rör. Eluera glykosfingolipider med 5 ml 9:1 aceton: metanol. Vi har inte rutinmässigt analysera fettsyrasammansättningen av denna fraktion, kan det emellertid innehålla värdefull information och kan sparas för beredning av metylestrar och fria baser sphingoid för vidare analys använderspecialiserade förfaranden skiljer sig från de för TAG och PL som tidigare beskrivits 27.
- Byt glykosfingolipid samling rör med en andra gängad borosilikat provröret. Eluera fosfolipider med 3 ml metanol (PL-fraktion).
- Fraktioner kan lagras vid -80 ° C vid denna punkt tillslöts tätt under kväve. Torr renade lipider under kväve. Att påskynda torkning, i en torr värmeblock vid 33 ° C. Förvara aldrig lipider i torkad form, eftersom de är särskilt känsliga för oxidation i torkat tillstånd.
- Återsuspendera torkade lipidfraktioner i 2 ml 2% H 2 SO 4 i metanol genom skakning och inkubera utjämnade tätt över natten i en 55 ° C vattenbad för att skapa FAME. Försiktighet måste vidtas för att få absolut inget vatten i FAME reaktion eftersom detta kommer att kraftigt hämma derivatisering av lipider. Vi har funnit effektivare derivatisering genom inkubation över natten och litteraturen antyder mindre lipid oxidation uppstår vid lägre temperaturer During FAME framställning 28. En alternativ och snabbare metod är att använda 2 ml 2,5% H 2 SO 4 i metanol och derivatisera under en timme vid 70 eller 80 ° C. 21,22,29.
- Nästa morgon, ta bort från badet och låt svalna. Lägg 1,5 ml H 2 O (för att avbryta reaktionen) och därefter 0,3 ml hexan (för att extrahera FAME) för varje TAG och PL fraktion. Skaka kraftigt och centrifugera vid 1.000 rpm under 5 minuter.
- Mycket försiktigt bort bara översta hexanskiktet med en vanlig pipett eller pasteurpipett. Fördela i autosampler röret. Göra vissa att inte inkludera någon surgjord metanol eftersom det kommer att förstöra GC-kolonnen och MSD.
- Cap och prover belastning på GC / MS. Provet överföres i hexan till en mikro-insats Agilent flaskan tillslöts med en PTFE-silikon-PTFE-skruvlock. Det överförs till Agilent GCMS-modellen 6890/5973N utrustad med en Supelcowax-10 (24.079) 30 meter, 250 mikron Kapillärkolonn av kvarts. En mikroliter injiceras intoa splitless inlopp inställd på 250 ° C och 13,33 PSI Ultrapure Helium användes en bärargas. Protokollet kör är följande vid en konstant 1 ml per minut:
| Steg | Instruktion | Mål Temperatur |
| 1 | Håll 2 minuter | 150 ° C |
| 2 | Ramp 10 ° C per minut | 200 ° C |
| 3 | Håll 4 min | 200 ° C |
| 4 | Ramp 5 ° C per minut | 240 ° C |
| 5 | Håll 3 min | 240 ° C |
| 6 | Ramp 10 ° C per minut | 270 ° C |
| 7 | Håll 5 minuter | 270 ° C |
En 3 min lösningsmedel fördröjning används i MSD att minimera slitage på filament. Därefter massorna mellan 50 och 550 Dalton detekterades med MS fyrdubbla uppsättningen vid 150 ° C och MS källan inställd på 230 ° C, med en termisk extra temperatur av 270 ° C.
Representative Results
Ett exempel på ett avbildat platta som har tagits genom fettet färgning arbetsflödet visas i figur 1. Specifika kontroller för hög fetthalt (daf-2 insulinreceptorn RNAi), låg fetthalt (LPD-3-protein som krävs för granulat lipid lagring i tarmen RNAi), liten och låg fetthalt (fasn-1 fettsyrasyntas RNAi), och tom vektor ( kontroll) visar variationerna i fluorescensintensitet enligt de fettnivåer av djuren, och de motsvarande belopp lipid bestämdes genom GC / MS-analys (figur 2). Observera att gen inactivations leder till utvecklingsstörda gripits, kommer små djur ofta tycks ha mycket lägre fett än vuxna kontrolldjur, oberoende av koppling till fettmetabolismen (Figur 3). Sekundära analyser, inklusive färgning analys och lipid biokemi med SPE-GCMS av vildtyp kontrolldjur med liknande utvecklingsstadium måste göras för att säkerställa att giltigheten avsmå eller utvecklingsmässigt greps positiva träffar. I fallet med fasn-1 RNAi (figur 2), djur gripande i antingen L2 eller L3 larvstadiet, och har fett färgning lägre än vuxna kontroll RNAi, men liknande i överflöd till L2-L3 stegsstyrning RNAi djur (fett fläck procent av vuxna kontroll RNAi: 49,9 ± 4,5% för fasn-1 RNAi och 20,2 ± 2,1% för L2-kontroll RNAi och 64,7 ± 1,3 för L3 styrning RNAi). Alternativt visade biokemisk analys lägre TAG / PL-förhållande än L2 fas matchas N2 kontrolldjur (TAG / PL: 22,5 ± 2,9 för fasn-1 RNAi och 46,1 ± 3,4 för steg matchade kontroll RNAi, P ≤ 0,05). Alltså i detta fall kan det bekräftas genom biokemisk analys som fasn-1 har en roll i lipid lagring i stället för bara en etapp-specifik minskning av fettmassa.
Uppföljningen analys av avbildade maskar är starkt beroende av en computational plattform som Cell Profiler medden WormToolbox 30. För mindre antal bilder, kan en allmänt tillgänglig bildanalys plattform såsom ImageJ, fritt tillgängligt från NIH, användas. För vår analys har unika Matlab-skript används först för att identifiera bra och därefter att utesluta tomma brunnar eller personer med bubblor, och skilja små skräp från maskar. Manuell kvalitetskontroll var nödvändig för bilder flaggade för uteslutning av de skäl som nämns ovan. Vi fann empiriskt att 90: e percentilen intensitet mask pixlar över en brunn, normaliserad till masken område över en brunn, som konsekvent mått av färgningsintensitet i alla stadier av mask utveckling (Figur 3). Integrera den totala fettmassan över området masken, tvärtom skulle tendera att göra mål små ljusa maskar ekvivalent med stora dim maskar. Eftersom vår metod inte integrerar totala fluorescerande signal över området masken, att ta en intensitet percentilen, förändringar i mask storlek i sig inte görat förspänna intensitet mätt. Istället skillnader i pixlar intensitetsfördelningen uppmättes. Trots detta, är markanta skillnader ses i färgning pixelintensiteten fördelning mellan djur av olika utvecklingsstadier, så det är viktigt att studera effekten av RNAi till vilken gen som helst mot djur av en jämförbar utvecklingsstadium (figur 3). Genomsnittliga variabilitet mellan replikat visas i Figur 4 indikerar hög reproducerbarhet av fett färgningsmetoden. Observera att styrkan av metoden är mycket beroende på att få högkvalitativa bilder för varje platta, under enhetliga belysningsförhållanden, med identiska exponeringstider, och med minimala bubblor, skräp eller crossover av maskar i andra brunnar.
SPE utfördes på färdigblandad, renade standarder för att fastställa i vilken grad taggar kan skiljas från PL (figur 5A). I denna analys har vi uppnått en 100% separation av TAG och PL, som anges som en fullständig frånvaro av 17:00 fettsyror härledda från PL i TAG provet och en motsvarande total avsaknad av 13:00 fettsyror härledda från TAG i PL-provet (figur 5A). Således SPE är mycket effektiv på att separera lipidklasser. Denna analys innebär inte att alla taggar av olika kedjelängder kommer att renas likvärdigt med SPE och detekteras av GCMS med liknande effektivitet. Det försäkrar bara att TAG och PL lipider totalt är helt separerade från varandra.
Ett prov GC-MS-spår av N2 vildtyp djur tagna genom fastfasextraktion och FAME beredning visas i figur 5B. För både TAG och PL, kan toppar identifieras baserat på uppehållstid och förälder och dotter joner på masspektrum, och den totala arean under de identifierade toppar normaliserade till området av respektive interna standarder. För att bestämma den normaliserade mängden TAG, områdetunder alla toppar TAG kromatogrammet, utom 13:00 standarden, tillsattes tillsammans och divideras med arean under toppen 13:00. Likaså att bestämma den normaliserade totala PL belopp området under alla toppar, utom 17:00 standarden sattes ihop och divideras med arean under 17:00 toppen. De normaliserade värdena för TAG och PL prover används sedan för att beräkna den slutliga TAG / PL-förhållandet för provet:
Det bör noteras att uppgifterna från SPE-GCMS medger en mycket mer sofistikerad analys av fettsyrorna i varje lipidfraktion än enkel beräkning av den totala TAG till PL-förhållande. Till exempel kan forskaren integrera en enda topp motsvarande en enda fettsyra och jämföra dess normaliserade överflöd över prover (t.ex. Comparing i N2 vildtyp kontra daf-2 RNAi den integrerade delen av 18:00 toppen dividerat med 13:00 standarden topp, normaliserat till den totala PL massa dividerad med PL 17:00 standarden topparean):
Skulle utredaren välja, skulle det också vara möjligt att bestämma den procentuella andelen av varje givet fettsyra i TAG eller PL fraktioner som en procentandel av den totala mängden fettsyra kvantifierades (såsom ett exempel 18:00 i TAG fraktionen i N2 maskar ):
Figur 1. Typisk arbetsflöde för hela experimentet. Dag 1, frysta RNAi bibliotek plattor stämplat på Amp / Tet LB-agarplattor och inkuberades vid 37 ° C. Dag 2, Amp / Tet plattor som används för att utsäde flytande kulturer av RNAi-kloner i djupa väl block. Dag 3, är bakterierna koncentreras genom centrifugering och överfördes till 96-brunnars plattor RNAi. Dag 4, L1 hatchling C. elegans tillsätts RNAi plattorna vätska och fick torka. Dag 7, djuren samlas i vätska, färgades med Nile Red i 40% isopropanol, monterad på 96-brunnars objektglas Teflon, och avbildas med en hög genomströmning mikroskop.
Figur 2. Fixativ-baserade Nile röda fläckar stora
Figur 3. Fettmassa bestäms genom fixering Nile rödfärgning vid olika larvstadier. Odlades på OP50 bakterier och uppsamlas vid L1 Djur, L2, L3, L4 och gravida vuxna utvecklingsstadier. Bilder fångades efter fixering färgning och analyseras med hjälp av en anpassad Matlab-skript för att bestämma 90: e percentilen Of pixelintensiteten över den identifierade masken området. Notera att lipidnivåer djur kraftigt öka när djur utvecklas från L2 till L4 steg, och sedan minska något när djuret börjar att avleda kalorier mot proliferationen av bakterielinje i sitt vuxna stadium. Data som visas är medelvärdet ± SEM för 6-8 replikat (**, P ≤ 0,0001 i förhållande till gravida vuxna, bestämdes genom oparat, tvåsvansat T-test).
Figur 4. Hög reproducerbarhet över oberoende biologiska replikat. Visas är ett punktdiagram av Nile Red fluorescensintensitet över biologiska replikat (n = 6-8). För varje replikat, är alla värden normaliserades till medelvärdet intensiteten hos de tomma vektor kontrollerna. Visade data är medelvärde ± SEM (**, P ≤ 0,0001 jämfört med kontroll, bestämdes genom oparat, tvåsvansat t-test under antagandelika varians).
Figur 5. GC-MS kromatogram av SPE separerade standarder och vildtyp TAG och PL överflöd. (A) GC-MS spår visas för SPE separation av TAG och PL standarder. Notera den fullständiga avsaknaden av 13:00 fettsyra i PL spår och motsvarande frånvaro av 17:00 fettsyra i TAG spår, vilket indikerar fullständig separation av TAG (tritridecanoin) från PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero -3-fosfo-(1'-rac-glycerol)). (B) En representativ hela spektrumet av TAG och PL från ett urval av N2 vildtyp djur utfodras vektorstyrning RNAi (HT115 bakterier med L4440 tom vektor RNAi). En mikroliter av provet injicerades i en Agilent 6890/5973N GCMS enligt protokollet, och individuella toppar identifierades av Retention tid och deras respektive masspektra. Förkortningar: cyklo, cyklopropan fettsyra, ISO:. Iso-metyl grenade fettsyra, GLA, gamma linolensyra, ALA, alfa linolensyra, DGLA, dihomo-gamma-linolensyra, EPA, eikosapentaensyra Klicka här för att se större bild .
Discussion
Den presenterade protokoll möjliggör snabb, storskalig screening av lipidnivåer i C. elegans, som lätt kan anpassas till hög kapacitet skärmar. Till skillnad från tidigare metoder, som innebär en lång fixering steg paraformaldehyd följt av flera frysnings-upptiningscykler 8,10, kräver vår protokoll en enkel 3-min fixering i isopropanol. Vi har funnit att genom färgning C. elegans i 40% isopropanol, blir de fritt permeabel för Nile Red, utan användning av ytterligare frysning-upptining eller fixering steg. Också, som Nilen röd selektivt fluorescerar i hydrofoba fack i det gröna spektrat 18,19,31, ingen avfärgning behövs. Totalt kan djuren tas från RNAi plattor till färgade och redo att bilden djur i drygt 2,5 timmar. Denna metod kan utföras relativt billigt och med hög reproducerbarhet. Metoden beror inte på förmågan av C. elegans till upptag eller koncentratfärgen och därför inte har samma begränsningar som utfodring metoder med viktiga färgämnen. Given reproducerbarhet och precision av mätningar, är metoden lämplig för screening av ett stort antal gener inactivations från RNAi. Om kvantifiering av lipidnivåer önskas baserat på fixativ Nilen röd färgning, rekommenderar vi användning av 4-6 biologisk replikerar med lämpliga kontroller och statistisk testning tillämpas.
Det är troligt att många gener inactivations leder till små djur (på grund av RNAi-kloner som orsakar försenade eller gripits utveckling) skulle komma ut ur en skärm för fett tillsynsmyndigheter, oavsett eventuella koppling till fettomsättningen. Medan bildanalysprogram vi utnyttjade står för maskar av olika storlek genom att normalisera fluorescensintensiteten till masken område, kan enskilda forskare vill också överväga att jämföra de feta fläckar nivåerna av små djur till vildtyp djur i samma utvecklingsstadium. Ismå eller utvecklingsmässigt gripits djur med uppenbar låg fettmassa, föreslår vi att ingen enskild modalitet är tillräcklig för att påvisa förändrad lipidmetabolism. Flera uppföljning experiment, inklusive SPE-GCMS, skulle krävas för att fastställa lipid-reglerande funktion av dessa gener. För kända metabolisk regulator fasn-1, SPE-GCMS-analys jämfört med utvecklingsmässigt matchade N2 L2 kontrolldjur var nödvändigt att bekräfta den skenbara låg fetthalt fenotyp fann jämfört med vuxna kontrolldjur. Medan Nile red fett färgning visade lägre fettnivåer i förhållande till kontroll vuxen RNAi, jämfört med steg-matchade L2 kontroll RNAi djur fanns ingen tydlig skillnad ses. Följaktligen, användning av en andra metod, var dvs biokemiska kvantifiering av TAG / PL-förhållandet som krävs för att fastställa att fasn-1 är en sann regulator av fettmassa, såsom fasn-1 RNAi är biokemiskt särskiljbara från steg-matchade kontroll L2 RNAi djur.
20 eller konventionell storlek Teflon-tryckt 8 till 12 och mikroskopobjektglas . Den enda begränsningen är att när den gröna fluorescens av lipiddroppar färgade med Nile Red photobleaches snabbt systematiska, enhetliga exponeringsförhållanden måste användas för att säkerställa jämförbarhet mellan bilderna. Vi finner att en helt automatiserad mikroskop med enhetliga villkor bildupptagning fungerar bäst för detta ändamål.
En av de stora styrkorna detta protokoll är att efter bilderna samlas de kan sparas för framtida ny analys. Samma bilder kan användas för att bestämma kroppens storlek utöver fetthalt. Dessutom, eftersom beräkningsmetoder program blir mer avancerade, finns det utsikter för enstaka mask analys genererar statistiskt signifikanta resultatfrån en enda brunn. Således vår metod som utnyttjar hög genomströmning mikroskopi har vissa fördelar jämfört med publicerade skärm metoder som använder en Copas Biosort att kvantifiera fluorescerande signaler 32,33. Men metoderna är definitivt gratis.
Exakt, biokemiska bestämning av fetthalten genom SPE och GC / MS bekräftar Nilen rödfärgning av de stora fettdepåer i C. elegans. Även om den absoluta kvantifiering uppnås från fixativ Nilen röd färgning och biokemiska lipid beslutsamhet ofta inte stämmer perfekt, båda metoderna producera mycket reproducerbara, statistiskt signifikanta resultat som överensstämmer kvalitativt. Dessutom kan denna metod skräddarsys för att uppfylla de särskilda behoven hos enskilda forskare som kan kräva ytterligare analys av de separata klasser av glykosfingolipider, fosfolipider eller triglycerider som finns i olika prover. Det bör noteras att andra grupper har använt annan teknik THAn SPE att separera lipidklasser före GC / MS 22. Tunnskiktskromatografi (TLC) och högtrycksvätskekromatografi (HPLC) har fördelar jämfört med SPE i att de skulle bättre kunna separata distinkta neutrala lipider (t.ex. TAG, diglycerider, fria fettsyror och kolesterol estrar) från polära lipider (fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin) och glykol-sfingolipider. Vi väljer SPE eftersom det kräver ett minimum av utgångsmaterial (2,500-5,000 maskar), betonas de stora långsiktiga energi-butiker, taggar, som utgör merparten av den neutrala lipidfraktionen 4, och är snabb och kräver ingen speciell utrustning eller plattor. Det bör understrykas att baseras på vanliga blandningar skiljer SPE helt taggar från PL, och är mycket reproducerbar och pålitlig (se figur 5A). Medan kvantifiering och analys av fettsyrametylestrar kräver en GC / MS, är denna utrustning allmänt tillgänglig, och om inte lokalt, prover kangenereras enligt ovan och lagrades vid -80 ° C under kväve tills analys av en medarbetare eller kommersiell GC / MS-tjänsten är anordnad.
I GCMS utgång innehåller högupplösta data på varje fettsyra i varje lipid arter. Detta medger bestämning av detaljerade skillnader jämfört mellan prover. Som ett exempel, kan undersökaren bestämma huruvida nivåerna av vissa fettsyror förändrades i överflöd mer signifikant än andra i daf-2, lpd-3 eller fasn-1 RNAi mot vektorkontroll. Detta oerhört kraftfullt verktyg kan därför ge detaljerad information om vilka lipid arter förändras i överflöd med någon experimentell manipulation.
För vår analys har vi oftast normalisera TAG massa till PL massa. Medan protein eller DNA kan också användas för att normalisera lipid massa efter fastställande av en alikvot av sonikerad mask pellets, finner vi att dessa metoder är föremål för introducerad mänskliga fel under alla pipetteringssteg och prov återhämtning från varje extraktion. Det är av denna anledning som vi valde att istället använda PL massa som vår normalisering faktor. Onaturliga standarder införs i början av protokollet (tritridecanoin för TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1'-rac-glycerol) för PL) sker genom alla steg i fast fas extraktion och FAME beredning och garantera kvantitativ och representativ återvinning av både TAG och PL fraktioner. Samma garanti kan inte göras om utredarna använder protein eller DNA för att normalisera TAG massa. Vi tror PL vara den mest robusta spårvidd genom att jämföra TAG nivåer över prover, eftersom det har tidigare visats att PL endast obetydligt ändras genom samma stimulus åstadkommer stora massa förändringar i TAG nivåer, t ex förlängd svält eller ökad motion 34 - 36. PL tros spela en strukturell roll, säkerställa membranfluiditet och cellulär integregrity och signalering roller snarare än som energilagring 37-39. I våra händer, TAG / PL-förhållande närmast motsvarar vad som erhålls genom fixativ-baserade lipid färgning med Nile Red, och håller med den som finns i andra grupper 21. En alternativ strategi används av Watts laboratoriet, där andelen lipid TAG beräknas kontra totala lipider 9,22,29.
Användningen av främmande typer av TAG och PL standarden garanterar att inga infödda fettsyror kommer att ingå i normaliseringen beräkningen. Valet av kedjans längd helt baserad på behovet av dessa standarder för att inte störa masspektra av infödda fettsyror. Vi har funnit att fettsyror av 13:00 och 17:00 tjänar bäst för detta ändamål. Det är möjligt, med tanke på de olika kemiska egenskaperna hos kortare fettsyror, som våra onaturliga fettsyror standarder inte skulle vara representativ för återvinning av alla kedjelängd fettsyror eller kedjor med different mättnad index. Därför är det möjligt att under SPE eller GCMS vi kan se skillnader i effektivitet rening eller detektion mellan lipider med olika kedjelängd. Baserat på detta och olika jonisering av olika fettsyror i GCMS, är det inte möjligt att göra en absolut uttalande om överflödet av varje given fettsyra. Därför jämför vi endast mellan prov inom ett enda experiment bestånd av en viss fettsyra. Om man ville absolut kvantifiera en fettsyra, ett sätt detta skulle kunna uppnås skulle vara att köra ett prov framställt enligt ovan spetsas med en känd mängd av en stabilt isotopmärkt 13 C-versionen av det eller liknande fettsyra, så att det kan vara särskiljas baserat på massa av moderjonen i MSD, till exempel. Med tanke på att vi bara jämför relativa mängderna av lipid klasser eller en viss fettsyra, vår 13:00 TAG och 17:00 PL standarder tjänar detta syfte lämpligt, till minst kostnad,garantera lämplig och representativ återvinning av varje lipid klass.
Fram till denna punkt har det funnits en brist på enighet om tolkningen av vissa resultat som erhållits genom olika metoder, och i vilken de rådande metoderna ska vara. Sammantaget bör det noteras att ingen metod i isolering är idealiskt lämpad för att studera fettmetabolismen i C. elegans. Men genom att använda flera screening och villkor validering kan man uppnå förtroende för data som erhållits för lipid regulatoriska gener. Därför vill vi för vår protokoll för att tjäna som ett riktmärke för framtida arbete inom området C. elegans fett forskning.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka Michael Kacergis för tekniskt bistånd och Lianfeng Wu för diskussioner och läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av en karriärutveckling utmärkelse från NIH / NIDDK (K08DK087941 till AAS), en NIH / NIDDK utbildningsstipendium (5T32DK007028 till ECP), den Ellison Medical Foundation Nya Scholar i åldrande Award (till AAS) och Charles H . Hood Foundation Child Health Research Award (till AAS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
- Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
- Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
- Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
- Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
- Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
- Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
- Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genetics. 180, 857-871 (2008).
- Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
- Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
- McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
- Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
- Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
- Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Hope, I. L. C. elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York. 304 (1999).
- Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).
- Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
- Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
- Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
- Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
- Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
- Christie, W. W. Advances in Lipid Methodology - Two. , Oily Press. 69-111 (1993).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
- Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
- Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
- Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
- Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
- Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).
