Summary
השתלה של תאים סרטניים לתוך האיבר ממוצא יכולה לשמש מודל פרה שימושי כדי להעריך את הטיפולים חדשניים. ניתן לגדל תאי קרצינומה של שלפוחית השתן MB49 בתוך שלפוחית השתן בעקבות החדרת שלפוחית. פרוטוקול זה מדגים צנתור של שלפוחית השתן בעכבר לצורך השתלת גידול ואספקת adenoviral.
Abstract
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השני בשכיחותו בדרכי השתן ואברי המין וגישות טיפוליות חדשניות שיכול להפחית את ההישנות והתקדמות נדרשות. Microenvironment הגידול יכול להשפיע באופן משמעותי את התפתחות גידול ותגובה לטיפול. לכן לעתים קרובות רצוי לגדל תאים סרטניים באיבר שממנו הם מקורו. פרוטוקול זה מתאר מודל orthotopic של סרטן שלפוחית השתן, שבו תאי סרטן שלפוחית השתן עכבריים MB49 הם החדירו לתוך שלפוחית השתן באמצעות צנתור. השתלת תאים סרטניים מוצלחת במודל זה דורשת שיבוש של שכבת glycosaminoglycan מגן, שיכול להתבצע על ידי אמצעים פיזיים או כימיים. בפרוטוקול שלנו מטפל בשלפוחית השתן עם טריפסין לפני החדרת תא. גם צנתור של שלפוחית השתן יכול לשמש כדי לספק תרופות פעם הגידולים מבוססים. פרוטוקול זה מתאר את המסירה של מבנה adenoviral שמבטא את גן כתב לוציפראז. בעוד oפרוטוקול ur כבר מותאם למחקרים לטווח קצר ומתמקד במסירת הגן, יש לו את המתודולוגיה של צנתור שלפוחית השתן עכבר יישומים רחבים.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא הסרטן השני בשכיחותו בדרכי השתן ואברי מין עם כמעט 75,000 מקרים חדשים ו -15,000 מקרי מוות צפוי ב2012 1. שיעור גבוה של הישנות דורש מעקב לאורך כל חייהם, מה שהופך את סרטן שלפוחית השתן אחד מסוגי הסרטן היקרים ביותר לטיפול. סרטן שלפוחית השתן שפלש לשכבת השריר עלול לשלוח גרורות לכבד, ריאות או עצם באמצעות מערכת הלימפה. טיפול multimodal של תוצאות גידולים מתקדמים בהישרדות רק 20-40% אחרי 5 שנים. לכן, אסטרטגיות טיפול יעילות שנועדו להקטין את ההישנות והתקדמות של הסרטן השטחי של שלפוחית השתן, כמו גם לשפר את התוצאות טיפוליות בחולים עם מחלה מתקדמת יש צורך דחוף.
פיתוח הרפוי רומן מחייב מודלים פרה כדי להעריך את היעילות הבאה הערכה ראשונית במבחנה. Microenvironment הגידול משמעותי יכול להשפיע על התפתחות סרטן והיענות, אשר מדגישה את הצורך בpreclinicדגמי אל שבגידולים להתעורר או ניתן להקים באיבר המוצא. גישה אחת היא הפיתוח של מודלים מהונדסים שבו גידולים להתעורר באופן ספונטני או יכולים להיגרם באופן איבר ספציפי. לאחרונה פרוטוקול מצוין של מודל בסרטן שלפוחית השתן מהונדס כבר פורסם 2. החסרון של מודלים מהונדסים הוא שגידולים נוטים להתפתח באיטיות ועם פחות אחיד מרצוי. בנוסף, העלות של שמירה על מושבת רבייה צריכה להילקח בחשבון. אלטרנטיבה למודלים מהונדסים היא השתלת orthotopic של תאים סרטניים, אשר יש את היתרון של מסגרות זמן קצר להקמת גידול בעכברים זמינים מסחרי. אמנם ניתן לגדל כמה שורות תאי סרטן שלפוחית השתן אנושיות orthotopically (אנחנו השתמשנו בהצלחה UM-UC-3), זה עשוי להיות רצוי להקים גידולים בעכברים עם מערכת חיסון. שתי שורות תאי סרטן שלפוחית השתן Murine, אשר גדלות orthotopically הן MBT-2 וMB49 3. מאז MBT-2 תאים מזוהמים במשכפליםהקלד רטרווירוס C 4, בחרנו MB49 תאים ללימודים שלנו. חשוב לציין כי MB49 תאים היו מבודדים מעכבר זכר והשתלות orthotopic הן מסיבות אנטומיות שבוצעו בעכברים ממין נקבה. זו יש את היתרון של זיהוי קל של התאים המושתלים על ידי סמנים של כרומוזום Y, אבל חוסר ההתאמה בין המינים יכול להיות חסרון ללימודים חיסוניים.
אפיתל שלפוחית השתן הוא בשורה של שכבת glycosaminoglycan (GAG), המתפקדת כמחסום לזיהום על ידי מיקרואורגניזמים. מכשול זה יכול גם להפריע להשתלה של תאי גידול ומספר שיטות פותחו כדי להתגבר על קושי זה (טבלת 1). Electrocautery כבר נעשה שימוש נרחב כאמצעי פיזי כדי לשבש את שכבת GAG 5-13 ולאחרונה electrocautery הוכחת בפרוטוקול שפורסמה ב14 יופיטר. עם זאת, יש יחידת electrocautery לא תהיה זמינה, אמצעים כימיים כדי להרוס את Gגם שכבת AG כגון כסף חנקה או פולי-L-ליזין ניתן להשתמש בם 15-24. גידולים מוקמים ביעילות על ידי חשיפה קצרה של שלפוחית השתן לנפח קטן של כסף חנקתי (5-10 μl, 0.15-1.0 M, ~ 10 שניות) או קשר ארוך יותר עם פולי-L-ליזין (של 0.1 מ"ג / מיליליטר 100 μl עבור 20 דקות) (טבלה 1). כאן אנו מתארים שיטה שמשתמשת בטריפסין כדי להקל על השתלה של MB49 תאים.
בניסיון לשפר את הגישות טיפוליות לטיפול בסרטן שלפוחית השתן, טיפול גנטי צבר תשומת לב משמעותית. מנקודת המבט קלינית, סרטן שלפוחית השתן הוא יעד אידיאלי לריפוי גנטי בשל נגישות קלה של האיבר והיכולת מקומי לספק את המטען. וקטורים ויראליים שנחקרו לריפוי גנטי של סרטן שלפוחית השתן כוללים וירוס הרפס סימפלקס oncolytic 25, רטרווירוס 26, וירוס canarypox 27, וירוס vaccinia, AAV, וadenoviruזה 28. בחלקו השני של הפרוטוקול שלנו, אנו מתארים שיטה למסירת ויראלי כי הוא כמעט זהה להחדרה של התאים הסרטניים. עניין במעבדה שלנו הוא הפיתוח של גישות חדשות למסירת גן, אשר אנו מעריכים באמצעות פליטת אור באמצעות וקטור adenoviral שמבטא transgene לוציפראז. עם זאת, המתודולוגיה של צנתור שלפוחית השתן יכולה לשמש למשלוח של סוכנים שונים, ולכן יש תחולה רחבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים כבר נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. הפרוטוקול אושר תחת הקטגוריה D-USDA לכאב.
1. השתלת תאים
- יומיים לפני ביצוע ההליך, צלחת 1 x 10 6 MB49 תאים לתוך T-25 צלוחיות. השתמש DMEM גלוקוז הגבוה בתוספת 10% FBS (ואנטיביוטיקה, אם רוצה). בקבוק אחד מספיק לכל קבוצה של עד חמישה עכברים שיהיו מורדמת ומושתלות במקביל.
- ביום של ההליך, להכין טריפסין להחדרה על ידי דילול 0.25% טריפסין הכיתה סטרילי רקמת התרבות ל0.125% עם מדיום סטרילי בסיס DMEM (1:2 דילול). 1.2 מיליליטר מספיק עבור 10 עכברים. הנח בwaterbath 37 ° C כדי לאזן.
- Prewarm כרית חימום ולמקם אותו מתחת לnosecones של מערכת ההרדמה שיהיה בשימוש, כדי לספק isoflurane. הנח כרית סופגת נקייה על כרית החימום.
- הנח עכברים לתוך תא האינדוקציה של מערכת ההרדמה ולגרום הרדמה עם isoflurane 3%. כאשר העכברים איבדו את הכרתו, אשר מאומתת על ידי אובדן של הבוהן קמצוץ רפלקס, להעביר אותם לnosecones. ודא שכל בעלי חיים הוא במצב שכיבה וממוקמים כראוי על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף.
- להפחית את ריכוז isoflurane עד 2% כדי לשמור על הרדמה.
- החל משחת עיניים לשני העיניים כדי למנוע התייבשות.
- שלב אופציונאלי: הסרת שיער בבטן. שיער בבטן התחתונה יש להסיר את אם in vivo bioluminescent הדמיה תבוצע.
- למרוח שכבה נדיבה של קרם מקריח, כגון Veet, ל1 הנמוך ביותר בריבוע של פרווה על הבטן, נזהר שלא ליצור קשר עם אברי המין החיצוני. לחכות 3 דקות.
- הסרת שיער על ידי לשפשף את האזור עם ספוג יבש, ולאחר מכן להשתמש בספוג לח כדי לנקות את העור. חזור פעם אחת, במידת הצורך.
- לצנתר בשלפוחית השתן
- לשמן צנתר חדש, סטרילי 24 G ילדים ורידים עם ג'ל סיכה nonirritating כגון KY. להסיר ולסלק את המחט. אם דליפה של נוזל סביב הקטטר היא בעיה נפוצה, כלומר. היא מתרחשת בתדירות גבוהה יותר מאשר באחד מעשרה עכברים, צנתרים גדולים שעם (20 G) יכולים לשמש. זה עשוי להיות שיקול חשוב בעכברים מבוגרים מ -8 שבועות.
- מחזיק את הרכזת של קטטר, השתמש באגודל ואצבע מורה של היד הנגדית שלך כדי להפיץ את הרגליים האחוריות של העכבר ולחשוף את meatus השופכה. הכנס בעדינות את הקטטר לתוך השופכה בזווית של ° 45, שינוי הזווית למקביל אחד עם הספסל כדי להכניס אותו באופן מלא.
- לאחר כניסה מלאה, להרים את הקטטר בעדינות, להשאיר אותו במקביל לספסל, וחזותי לאשר שהיא ממוקמת בשופכה ולא הנרתיק, אשר מתחתיה. אם למקם אותו כראוי, קטטר יהיה מסוגל להיות בserted באופן מלא מאז הנרתיק הוא קצר יותר מהשופכה.
- להפחית את ריכוז isoflurane עד 1%.
- צרף טיפ לpipettor P200 ולהסיר את שתן משלפוחית השתן על ידי יישום יניקה עד הסוף החיצוני של הקטטר. הסר את כל שתן שנותר מהרכזת של הקטטר. בטל שתן ולהשאיר קטטר במקום.
- זהירות פיפטה 80 μl 0.125% פתרון טריפסין לרכזת של קטטר, הימנעות בועות אוויר. צרף מזרק המלא באוויר 1 מיליליטר לרכזת קטטר ולדכא באיטיות את הבוכנה 0.1-0.2 מיליליטר, כדי לספק את טריפסין לתוך שלפוחית השתן.
- השאר את המזרק והרכבת הקטטר במקום במשך 15 דקות. חזור על שלבים 1.8-1.11 עבור כל אחד מהעכברים מורדמים הנותרים (עד 4). המשך לשלב הבא בתקופת ההמתנה. רמז: בתחילה זה עשוי להיות מועיל למישהו אחר להכין את התאים (שלב 1.12).
- הכן את תאי MB49 להשתלה. תאים היו מצופים ב1 x 10 6 לT-25 בקבוק 48 שעות לפני ההשתלה (שלב 1.1).
- הסר את המדיה ולהוסיף 500 μl של טריפסין 0.25% לבקבוק. כאשר תאים לנתק להוסיף 5 מיליליטר של DMEM להשלים resuspend תאים. הסרת aliquot 50 μl לספור, ו צנטריפוגות השאר על 1,000 סל"ד למשך 5 דקות. במהלך שלב צנטריפוגה ימשיך צעדי 1.12.2 ו1.12.3.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. לחשב את התאים / מיליליטר. ואז לחשב את הנפח הדרוש כדי להביא את התא גלולה ל4 x 10 6 מיליליטר תאים / (2 x 10 5 תאים לכל 50 μl).
- יוצקים את supernatant מתאי centrifuged וresuspend את הכדור במדיום DMEM בסיס שימוש בנפח הנדרש ללהשעות תאים ל4 x 10 6 מיליליטר תאים / (כפי שמחושב בשלב 1.12.2). לשמור על תאים בטמפרטורת חדר.
- כאשר מגיעה לנקודת זמן 15 דקות לטיפול טריפסין של שלפוחיות, לנתק את המזרק המלא באוויר מקטטר עוזב את הקטטר במקום. טריפסין בילה יהיה נורמליly יזרום חזרה החוצה באמצעות הצנתר. הסר את כל טריפסין שנותר משלפוחית השתן על ידי שאיבה עם pipettor P200 כמו בשלב 1.9 לעיל וזורקים.
- מייד פיפטה 50 μl של השעיה תא MB49 לרכזת של הקטטר. צרף את המזרק המלא באוויר 1 מיליליטר לרכזת של קטטר ולספק את התאים לשלפוחית השתן על ידי מדכא באיטיות את הבוכנה 0.1-0.2 מיליליטר. חזור על שלב זה עד ארבע פעמים נוספות כדי להשתיל את כל חמשת העכברים. לבטל את כל תאים שאינם בשימוש.
- השארת ההרכבה קטטר-המזרק במקום, לאפשר לתאים לשכון בשלפוחית השתן ל50 דקות.
- בעדינות למשוך את ההרכבה קטטר-מזרק מהשופכה. הפעל את ריכוז isoflurane לאפס ולעבור כל עכבר סנטימטר או שניים מnosecone להתאושש על כרית החימום.
- כאשר עכבר חזר רפלקס ליישרו, להחזיר אותו לכלוב שלה.
2. משלוח שלפוחית של adenovirus (8 ימים לאחר ההשתלה של תאים) זהירות: חלק זה של הפרוטוקול משתמש adenovirus, שהוא גורם מזהם וצריך להיות מטופלים תחת הנחיות קפדניות BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).
כל הפעולה המתבצעת באמצעות חומרים מזהמים שאושרה על ידי ועדת בטיחות ביולוגית המוסדית של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה.
- שמונה ימים לאחר השתלה בעכברים עם תאי MB49, לבדוק להמטוריה. לאסוף את חיות פרט על פיסת נייר סופג לבנה ולחץ בעדינות על הבטן כדי למחוק טיפות של שתן על גבי הנייר. שתן שהוא ורוד לאדום מציין המטוריה והוא סימן לכך שגידולים הקימו. שיעור מיצוי גידול הוא 80% לפחות ועם טכניקה מצוינת יכול להיות גבוהה ככל 100%.
- להפשיר מניית adenoviral על קרח ולדלל עד 10 9 PFU/50 μl (2 x 10 10 PFU / מיליליטר) בסטרילי, בטמפרטורת חדר PBS.
- הרדימי עכברים כפי שמתואר ב1.3-1.6 שלבים שלעיל.
- לצנתר עכברים כמתואר בשלבי 1.8 ולהסיר שתן כמו בשלב 1.9
- לאחר השתן מוסר, פיפטה מייד 50 μl של השעיה וירוס לרכזת של הקטטר. צרף את המזרק המלא באוויר 1 מיליליטר לרכזת של קטטר ולספק את הווירוס לשלפוחית השתן על ידי מדכא באיטיות את הבוכנה 0.1-0.2 מיליליטר.
- השארת ההרכבה קטטר-המזרק במקום, לאפשר לווירוס לשכון בשלפוחית ל40 דקות.
- בעדינות למשוך את ההרכבה קטטר-מזרק מהשופכה, וזורקים ל10% פתרון אקונומיקה כדי להשבית כל וירוס שנותר.
- הפעל את ריכוז isoflurane לאפס ולעבור כל עכבר סנטימטר או שניים מnosecone להתאושש על כרית החימום.
- כאשר עכבר חזר רפלקס ליישרו, להחזיר אותו לכלוב שלה.
- מארק כלובים כדי לציין עכברים שכבר החדירו עם adenovirus. וירוס יהיה לשפוך לתוך כלי מיטה הכלוב במשך כמה ימים וכל הכלובים והמצעים חייבים להיותטיפל וחיטוי כראוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטוריה הוא ציין כמעט בכל עכברים תוך 8 ימים לאחר ההשתלה של 200,000 MB49 תאים. כפי שניתן לראות באיור 1, משקל שלפוחית השתן יותר מאשר מכפיל מ34.7 ± מ"ג 3.3 (טווח 31-37 מ"ג, n = 4) בnontumor (טווח 77-120 מ"ג, n = 10) נושאות עכברים ל87.5 ± 19.2 מ"ג בעכברים ש כבר מושתל עם MB49 תאים. במונחים של משלוח הגן, מצאנו כי הדמיה עכברים 24 שעות לאחר החדרה נגיפית תשואות אות חזקה יותר לאחר 48 שעה (איור 2). משלוח adenoviral הוא משתנה מאוד בין בעלי חיים, אשר צריך להילקח בחשבון בעת תכנון גודל קבוצה למטרות סטטיסטיות (איורים 2 ו -3). אם מערכת הדמיה חיה קטנה היא לא זמינה, גישה חלופית למדידת ביטוי של transgene לוציפראז היא להסיר וhomogenize שלפוחית השתן לניתוח במבחנה. השוואה בין in vivo ניתוח באמצעות syste החיה הקטן IVIS200מ 'ובניתוח מבחנה באמצעות הערכה יציבה והמבריקה, מצביע על מתאם מצוין בין ערכות נתונים (איור 3).
איור 1. ניתוח של גידול בניטל. משקל של nontumor (n = 4) ונושאות גידול (n = 10) שלפוחיות עכבר 9 ימים לאחר החדרה של 200,000 MB49 תאים. מובהקות סטטיסטיים נקבעו על ידי מבחן t של הסטודנט באמצעות תוכנת GraphPad. * P = 0.0002. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. ניתוח vivo של ביטוי גנים. 9 PFU AdCMV.Luc (+). כדי להמחיש לוציפראז, עכברים הוזרקו intraperitoneally עם 200 וציפרין מיקרוגרם / עכבר. ביטוי של transgene לוציפראז נמדד in vivo באמצעות מערכת ההדמיה חיה הקטנה IVIS200. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. השוואה של אותות פליטת אור מתקבלים על ידי in vivo הדמיה חיה קטנה וassay במבחנה. עשרים וארבע שעות לאחר הלידה של חיץ אחסון וירוס (עיגולים פתוחים) או 1 x 10 9 PFU AdCMV.Luc (מעגלים סגורים), עכברים היו צילם באמצעות IVIS200 ואז להקריב אתed. שלפוחיות הוסרו והומוגני לניתוח במבחנה של אות bioluminescent באמצעות הערכה יציבה הזוהרת. אות לוציפראז מתקבלת על ידי כל שיטה באה לידי ביטוי ביחידות שרירותיות (AU). המקדם של נחישות (R 2) חושב בעם ניתוח נתונים תוספת של Microsoft Excel. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| עלבון לשכבת GAG | תאים מושתלים | זמן שמירה | גילוי גידול ופיתוח | הפניה |
| Electrocautery | .01-1 X 10 5 MB49 | המטוריה: 1,000 תאים: 0/0; 10,000 תאים: 4/6; 100,000 תאים: 6/6 גידולים: 1,000 תאים: 0/6; 10,000 תאים או יותר: 6/6, 6/6 (100%) | 5 | |
| Electrocautery | 5 x 10 4 MB49 לוק | שיעור מקרים של סרטן: 90% (כמו בהתייחסות 11) | 6 | |
| Electrocautery | 1 x 10 5 MB49 | ~ שעה 3 | שיעור מקרים של סרטן: 90% ב50 ימים | 7 |
| Electrocautery | 1 x 10 5 MB49-PSA | PSA: זוהה מוקדם ככל 4 ימים לאחר ההשתלה | 8 | |
| Electrocautery | 1 x 10 5 MB49 | שיעור מקרים של סרטן: 90% | 9 | |
| Electrocautery | 5 x 10 4 MB49 | 2 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 83.3% (10/12) ביום 21 | 10 |
| Electrocautery | 2 x 10 4 MB49 | 2 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 100 ידי היום 28% | 11 |
| Electrocautery | 1-5 x 10 4 MB49 | 3 שעות | המטוריה: 100 יום 16%; שכיחות גידול: 100% | 12 |
| Electrocautery | 1 x 10 5 MB49 | 3 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 97.3% (73/75) | 13 |
| PLL (100ul 0.01% 20 דקות) | 1 x 10 5 MB49-PSA | 2 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 100% | 15 |
| PLL (0.1 מ"ג / מיליליטר) | 1 x 10 5 MB49-PSA | 2 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 100% | 16 |
| PLL (100 μl 0.1 מ"ג / מיליליטר 20 דקות) | 1 x 10 5 MB49 | 1 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 94% (15/16) | 17 |
| PLL (0.1 מ"ג / מיליליטר) | 1 x 10 6 MB49 | המטוריה ביום 7: 50%, 100 ביום 14% | 18 | |
| PLL (100 μl 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר 20 דקות) או 22% אתנול | 1 x 10 5 מגה49 | 1 שעות | שיעור מקרים של סרטן: שלפוחית השתן לא עבר שינוי: 0%, PLL: 80-100%; 40-80% אתנול | 19 |
| כסף חנקה (5 μl 0.2 ז) | 1 x 10 6 MB49 | 1 שעות | שיעור מקרים של סרטן: 100% | 20 |
| כסף חנקה (10 μl 0.15 M 10 שניות) | 5 x 10 5 MB49 | שיעור מקרים של סרטן: 92% (46/50) | 21 | |
| כסף חנקה (8 μl 1 M 10 שניות) | 5 x 10 5 MB49 | 2 שעות | המטוריה: 100 ביום 7%; 100% המטוריה ימים; שכיחות גידול: 96.7% (29/30 עכברים) ביום 15 | 22 |
| כסף חנקה 5 μl 0.2 M | 0.5-2 x 10 6 MB49-PSA | 1 שעות | PSA זוהה | 23 |
| HCl (100 שניות 0.1 M 15 μl) | 1 x 10 6 MB49 | 1 שעות | 24 |
טבלת 1. גילוי גידול ופיתוח לאחר השתלת orthotopic של תאי MB49. עלבונות פיסיקליים וכימיים שונים שימשו לשיבוש של שכבת GAG, כדי להקל על צמיחת שלפוחית של MB49 תאים. תנאים ותוצאות ממחקרים קודמים באמצעות מודל orthotopic MB49 ניסיוניים מסוכמים. כניסה, את המידע שבסוגריים בעמודה הראשונה כולל נפח, ריכוז, וזמן מגע של סוכן המשמש לשיבוש כימי של שכבת GAG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתודולוגיה העיקרית שתוארה בפרוטוקול זה היא צנתור של שלפוחיות עכבר, שבה יש יישומים רחבים להחדרה של תאים, או כל סוכן שנועד למשלוח מקומי לאפיתל שלפוחית השתן. הפרוטוקול הספציפי שתואר לעיל כבר מותאם למחקרים לטווח קצר (~ 10 ימים). להשתיל את המספר מדויק של תאים הוא קריטי, שכן מספר תא גבוה יותר יגרום ליותר צמיחה מהירה של גידול ואולי אובדן של בעלי חיים עקב נטל גידול גדול. באמצעות 200,000 MB49 תאים להחדרה עשויה לדרוש הרדמת חסד עד 25% מבעלי החיים על ידי היום 14 בשל נטל גידול מוגזם. מניסיוננו, עכברים לא השפיעו לרעה על ידי עומס גידול בתוך 12 ימים. בנוסף לקריטריונים סטנדרטיים כגון עייפות, הזנחה עצמית, ו / או אובדן של נטל גידול מוגזם תיאבון במודל זה מתבטא בחוסר היכולת להשתין.
שיקול חשוב עבור פרוטוקול זה הוא לוגיסטיקה. ראשית, תאי MB49 לגדול rapidlתאי מיליון y וציפוי יומיים לפני ההשתלה יניבו תרבויות אופטימליות בשלב יומן ביום החדרה. אם מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי עולה על מספרם של בעלי החיים שיכולים להיות מושתל ביום אחד, תרבויות MB49 יצטרכו להגדיר בהתאם (בימים מרובים) כדי למנוע צמיחת יתר של תרבויות. שנית, עד שהטכניקה כבר שלמות, משתמשים צריכים לעבוד עם קבוצה קטנה של בעלי חיים. משתמשים מנוסים יהיו מסוגלים להשתיל 6 קבוצות של 5 עכברים כל אחד ביום אחד בלי עוזר (1.5 שעות / קבוצה הכולל פעמים להתעכב). עם זאת, בתחילה זה עוזר לי עוזר להכין ולספור את התאים להחדרה. לבסוף, מיקומו של הציוד הוא חשוב. באופן אידיאלי את ארון הבטיחות הביולוגי וציוד הרדמה נמצאים באותו החדר.
מגבלה פוטנציאלית היא שיש לו את ציוד ההרדמה 5 nosecones, אשר נמצא בשימוש בזמן להתעכב. אם מספר גדול של עכברים מושתלים באופן שיגרתי, seמערכות כאלה veral יוכל לשמש במקביל. בתאוריה, יכולה להיות בשימוש בשיטות אחרות של הרדמה. עם זאת, יתרון של הרדמה משאיפת isoflurane הוא שהזמן להתעכב יכול להיות נשלט.
ברגע שהטכניקה של צנתור היא שולטת, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תנאי ניסוי. ניתן להעריך קווים חדשים שלפוחית השתן סרטן תא או תאים שמקורם בגידולים בשלפוחית השתן עיקריים לפוטנציאל שלהם לגדול orthotopically. יתר על כן, ניתן להשתיל מספרים שונים של תאים על מנת לקבוע את סכום הסף הנדרש ללקחת גידול. יכולים גם להיות שהוקמו שיעורי צמיחת גידול. וריאציות אלה עשויות להיות שימושיות במיוחד, אם נעשות השוואות בין תאים מהונדסים גנטי כדי לקבוע את ההשפעה של הגן של עניין בהקמת גידול או קצב צמיחה. לניטור של הידבקות, שיעור צמיחה, או לקחת את הגידול, תאים עשויים להיות transfected עם גן כתב כגון לוציפראז 6. עם זאת, חשובה consideמנה היא את ההשפעה של חוסר חמצן ונימק באות פליטת אור 29. גם צנתור יכול לשמש כדי לספק סוכן טיפולי. כרגע אנחנו משתמשים במודל orthotopic להעריך אסטרטגיות מסירת הגן בהגדרת in vivo. מודל זה יהיה שימושי כדי לייעל את המשלוח של תרופות וכדי לקבוע את ההשפעה שלהם על נסיגת גידול והישרדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 CA143505 לכריסטינה Voelkel-ג'ונסון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent |
Company | Catalog number |
Comments |
| 6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories | Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
| Trypsin* |
MediaTech | MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
| DMEM* |
MediaTech | MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
| FBS |
Hyclone | SH30071.03 |
Heat-inactivated |
| T25 flasks* |
Corning Costar | Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
| MB49 cells |
N/A | N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
| Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm | Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
| Depilatory cream: Veet |
local pharmacy | ||
| Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy | ||
| Catheters* |
Exel International | Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
| Isoflurane |
Terrell | NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
| 1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson | BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
| D-Luciferin |
Gold Biotechnologies | L-123-1 |
|
| Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs | 1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
| Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
|
*available through multiple vendors |
|||
EQUIPMENT |
|||
| Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation | Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
| Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
| FLUOstar Optima |
BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
|
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2 (12), 1008-1014 (2009).
- Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46 (11), 5507-5510 (1986).
- De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163 (6), 1999-2001 (2000).
- Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182 (2), 749-755 (2009).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101 (1), 120-124 (2008).
- Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174 (3), 1115-1118 (2005).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6977-6984 (2004).
- Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9 (12), 4522-4528 (2003).
- Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7 (4), 159-166 (2002).
- Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167 (1), 357-363 (2002).
- Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59 (12), 2834-2837 (1999).
- Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161 (5), 1702-1706 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
- Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101 (3), 751-758 (2009).
- Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31 (1), 34-42 (2008).
- Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
- Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39 (4), 384-393 (2005).
- Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187 (6), 2228-2235 (2012).
- Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66 (12), 2121-2124 (2011).
- Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34 (2), 220-226 (2008).
- Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50 (7), 1111-1118 (2011).
- Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66 (5), 1116-1121 (2005).
- Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
- Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165 (2), 667-671 (2001).
- Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170 (3), 979-984 (2003).
- Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106 (11), 1799-1804 (2010).
