Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies

doi: 10.3791/50181 Published: December 1, 2013

Summary

Implantatie van kankercellen in het orgaan van oorsprong kan dienen als een nuttige preklinisch model om nieuwe therapieën te evalueren. MB49 blaascarcinoom cellen kunnen worden gekweekt in de blaas na intravesicale instillatie. Dit protocol toont katheterisatie van de blaas muis behoeve van tumor implantatie en adenovirale levering.

Abstract

Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal en nieuwe therapeutische benaderingen die kunnen verminderen herhaling en progressie nodig zijn. De tumormicromilieu kan significante invloed op tumorontwikkeling reactie. Het is derhalve vaak wenselijk om tumorcellen groeien in het orgaan waaruit zij afkomstig. Dit protocol beschrijft een orthotopic model van blaaskanker, waarin MB49 muizen blaascarcinoom cellen worden bijgebracht in de blaas via katheterisatie. Succesvolle tumorcel implantatie bij dit model moet verstoring van de glycosaminoglycaan beschermende laag, die kan worden bereikt door fysische of chemische middelen. In ons protocol de blaas wordt behandeld met trypsine vóór cel instillatie. Catheterisatie van de blaas kan ook gebruikt worden om geneesmiddelen te leveren zodra de tumoren vastgesteld. Dit protocol beschrijft de afgifte van een adenovirale construct dat een luciferase reportergen tot expressie. Terwijl our protocol is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies en richt zich op gentherapie, de methodologie van muis blaaskatheterisatie heeft brede toepassingen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Blaaskanker is de tweede meest voorkomende kanker van het urogenitale kanaal met bijna 75.000 nieuwe gevallen en 15.000 sterfgevallen verwacht in 2012 1. Hoge tarieven van herhaling vereisen levenslange follow-up, die blaaskanker een van de duurste vormen van kanker te behandelen maakt. Blaaskanker dat de spierlaag is binnengedrongen kan uitzaaien naar de lever, de longen of het bot via het lymfestelsel. Multimodale behandeling van gevorderde tumoren resulteert in slechts 20-40% overleving na 5 jaar. Daarom zijn effectieve behandeling strategieën die gericht zijn op het verminderen van de herhaling en de progressie van oppervlakkige blaaskanker evenals het verbeteren van de therapeutische resultaten bij patiënten met gevorderde ziekte dringend nodig.

Ontwikkeling van nieuwe therapieën nodig preklinische modellen om de werkzaamheid na de eerste in vitro evaluatie evalueren. De tumormicromilieu kan aanzienlijk invloed op de ontwikkeling en het reactievermogen van kanker, die de noodzaak voor preclinic hoogtepuntenal modellen waarin tumoren ontstaan ​​of kan in het orgaan van oorsprong worden vastgesteld. Een benadering is de ontwikkeling van transgene modellen waarin tumoren spontaan ontstaan ​​of kunnen worden geïnduceerd in een orgaan-specifieke wijze. Een uitstekende protocol van een transgeen blaaskanker model is onlangs gepubliceerd 2. Het nadeel van transgene modellen is dat tumoren vaak langzaam en met minder uniformiteit dan gewenst ontwikkelen. Bovendien onderhoudskosten voor een kolonie te worden beschouwd. Een alternatief voor transgene modellen orthotope implantatie van tumorcellen, die het voordeel van korte termijnen voor tumor vestiging in commercieel verkrijgbare muizen heeft. Terwijl sommige menselijke blaaskanker cellijnen orthotopically kan worden gekweekt (wij hebben met succes gebruikt UM-UC-3), kan het wenselijk zijn om tumoren te vestigen in immunocompetente muizen zijn. Twee muizen blaaskanker cellijnen die orthotopically groeien zijn MBT-2 en MB49 3. Omdat MBT-2 cellen worden besmet met het replicerentype C retrovirus 4, hebben we gekozen MB49 cellen voor onze studies. Het is belangrijk op te merken dat MB49 cellen werden geïsoleerd uit een mannelijke muis en orthotope implantaties zijn anatomische redenen uitgevoerd bij vrouwelijke muizen. Dit heeft het voordeel van gemakkelijke identificatie van de geïmplanteerde cellen met markers van het Y-chromosoom, maar het geslacht mismatch kan een nadeel voor immunologische studies.

De blaas epitheel wordt omzoomd door een glycosaminoglycaan (GAG) laag, die fungeert als een barrière voor infectie door micro-organismen. Deze barrière kan ook interfereren met de implantatie van tumorcellen en verscheidene methoden ontwikkeld om dit probleem (tabel 1) te overwinnen. Elektrocauterisatie is uitgebreid gebruikt als fysieke middelen voor de GAG-laag 5-13 en een protocol demonstreren elektrocauterisatie is onlangs gepubliceerd in Jupiter 14 verstoren. Echter moet een elektrocauterisatie apparaat niet beschikbaar, chemische middelen aan de G vernietigenAG laag, zoals zilvernitraat of poly-L-lysine kan ook 15-24. Tumoren effectief vastgesteld door een korte blootstelling van de blaas een kleine hoeveelheid zilvernitraat (5-10 pl, 0,15-1,0 M, ~ 10 seconden) of langer contact met poly-L-lysine (100 pl 0,1 mg / ml gedurende 20 min) (tabel 1). Hier beschrijven we een werkwijze die trypsine gebruikt geïmplanteerd MB49 cellen vergemakkelijken.

In een poging om therapeutische toepassingen voor blaaskanker verbeteren heeft gentherapie veel aandacht vergaard. Vanuit een klinisch standpunt, blaaskanker is een ideaal doel voor gentherapie vanwege gemakkelijke toegankelijkheid van het orgaan en zich lokaal leveren van de lading. Virale vectoren die zijn onderzocht voor blaaskanker gentherapie omvatten een oncolytische herpes simplex virus 25, retrovirus 26, kanariepokkenvirus 27, vaccinia virus, AAV, en adenovirus 28. In het tweede deel van ons protocol beschrijven we een werkwijze voor virale aflevering die vrijwel identiek is aan instillatie van de tumorcellen. Van belang in ons lab is de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om genaflevering, die wij beoordelen via bioluminescentie met een adenovirale vector die een luciferase transgen uitdrukt. Echter, de methode van blaaskatheterisatie worden gebruikt voor levering van verschillende agentia en daarom heeft brede toepasbaarheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedures waarbij dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik bij de Medische Universiteit van South Carolina. Het protocol werd goedgekeurd onder USDA categorie D voor pijn.

1. Celimplantatie

  1. Twee dagen voor het uitvoeren van de procedure, plaat 1 x 10 6 MB49 cellen in T-25 kolven. Met hoog-glucose DMEM aangevuld met 10% FBS (en antibiotica, indien gewenst). Een fles is voldoende voor elke groep van vijf muizen die worden verdoofd en geïmplanteerd in parallel.
  2. Op de dag van de procedure, voor te bereiden trypsine voor instillatie door verdunning steriele 0,25% weefselkweek trypsine tot 0,125% met steriel DMEM base medium (1:02 verdunning). 1,2 ml is voldoende voor 10 muizen. Plaats in een 37 ° C waterbad in evenwicht te komen.
  3. Voorverwarmen een verwarmingselement en leg hem onder de nosecones van de anesthesie systeem dat zal worden gebruikt om i te leverensoflurane. Plaats een schone absorberende pad over de verwarming pad.
  4. Plaats muizen in de inductie kamer van de anesthesie-systeem en veroorzaken anesthesie met 3% isofluraan. Bij muizen bewustzijn, dat wordt gecontroleerd door het verlies van de teen-snuifje reflex hebben verloren, overbrengen naar de nosecones. Zorg ervoor dat elk dier is in een liggende positie en goed geplaatst op de verwarming pad om de lichaamstemperatuur te handhaven.
  5. Verminder de isofluraan concentratie van 2% tot anesthesie te handhaven.
  6. Solliciteer oogzalf in beide ogen om uitdroging te voorkomen.
  7. Optionele stap: Verwijder abdominale haar. Haar op de onderbuik moet worden verwijderd als bioluminescentie beeldvorming zullen worden uitgevoerd.
    1. Breng een royale laag van ontharingscrème, zoals Veet, tot het laagste 1 op plein van bont op de buik, zorg ervoor dat u contact opnemen met de uitwendige geslachtsorganen. 3 min. wachten.
    2. Haar te verwijderen door wrijven het gebied met een droge spons, en dan met een vochtige spons om de huid te reinigen. Eenmaal herhalen, indien nodig.
  8. Katheteriseren van de blaas
    1. Smeer een nieuwe, steriele 24 G pediatrische veneuze katheter met een niet-irriterende smerende gel zoals KY. Verwijder de naald en gooi deze weg. Indien lekken van vloeistof rond de katheter is een veel voorkomend probleem, namelijk. Het komt vaker voor dan in een van de tien muizen, grotere binnendiameter katheters (20 G) worden gebruikt. Dit kan een belangrijke overweging zijn bij muizen ouder dan 8 weken.
    2. Houd de naaf van de katheter, gebruikt u de duim en wijsvinger van je andere hand aan de achterpoten van de muis te verspreiden en het urinekanaal bloot. Duw de katheter in de plasbuis bij een hoek van 45 °, het veranderen van de hoek om een ​​parallel met de bank om het volledig in te brengen.
    3. Na volledige inbrenging, til de katheter voorzichtig hem parallel aan de bank en visueel bevestigen dat deze zich in de urethra en niet de vagina, hetgeen eronder. Indien juist geplaatst, zal de katheter kan in zijnvolledig ingestoken aangezien de vagina korter is dan de urethra.
    4. Verminder de isofluraan concentratie tot 1%.
  9. Bevestig Tip een P200 pipet en verwijder urine uit de blaas door te zuigen aan het externe uiteinde van de katheter. Verwijder alle resterende urine van de naaf van de katheter. Gooi urine en catheter laten zitten.
  10. Pipet voorzichtig 80 ul 0,125% trypsine-oplossing in de naaf van de katheter, het vermijden van luchtbellen. Bevestig een 1 ml spuit met lucht gevulde om de katheter hub en langzaam de zuiger 0,1-0,2 ml aan de trypsine te leveren in de blaas.
  11. Laat de spuit en Kathetersamenstelling plaats gedurende 15 minuten. Herhaal stap 1,8-1,11 voor de resterende verdoofde muizen (tot 4). Ga door naar de volgende stap tijdens de wachttijd. TIP: In eerste instantie kan het nuttig zijn om iemand anders de voorbereiding van de cellen (stap 1.12).
  12. Bereid MB49 cellen voor implantatie. Cellen werden uitgeplaat bij 1 x 10 6 per T-25 kolf 48 uur vóór implantatie (stap 1.1).
    1. Verwijder het medium en voeg 500 ul van 0,25% trypsine aan de kolf. Wanneer cellen los voeg 5 ml compleet DMEM om cellen te resuspenderen. Verwijder een 50 pi aliquot te tellen en centrifugeer de rest bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. Tijdens het centrifugeren stap blijven stappen 1.12.2 en 1.12.3.
    2. Tel de cellen met een hemocytometer. Bereken de cellen / ml. Bereken vervolgens het volume nodig celpellet 4 x 10 6 cellen / ml (2 x 10 5 cellen per 50 pi) brengen.
    3. Giet supernatant van gecentrifugeerd cellen en resuspendeer de pellet in DMEM base medium met behulp van het volume dat nodig is om cellen te schorten tot 4 x 10 6 cellen / ml (zoals berekend in stap 1.12.2). Laat cellen bij kamertemperatuur.
  13. Toen de 15 min tijdstip voor trypsine behandeling van blazen is bereikt, maak de met lucht gevulde spuit uit de katheter het verlaten van de katheter op zijn plaats. Besteed trypsine zal normaally terugstromen via de katheter. Verwijder alle resterende trypsine vanuit de blaas door zuiging met de P200 pipet zoals in stap 1.9 hierboven en gooi.
  14. Onmiddellijk pipet 50 pi MB49 celsuspensie in de naaf van de katheter. Bevestig de 1 ml spuit met lucht gevulde de naaf van de katheter en leveren de cellen naar de blaas door langzaam indrukken van de plunjer 0,1-0,2 ml. Herhaal deze stap tot vier keer extra om alle vijf muizen geïmplanteerd. Gooi alle ongebruikte cellen.
  15. Het verlaten van de katheter-spuitset in de plaats, zodat de cellen te wonen in de blaas voor 50 min.
  16. Trekken zachtjes de katheter-spuitset uit de plasbuis. Draai de isofluraan concentratie op nul en beweeg elke muis een centimeter of twee verwijderd van de neuskegel te herstellen op de verwarming pad.
  17. Als een muis haar oprichtende reflex heeft herwonnen, terug in de kooi.

2. Intravesicale Levering van adenovirus (8 dagen na de implantatie van cellen) LET OP: Dit deel van het protocol gebruikt adenovirus, dat is een besmettelijke agent en mag onder strikte richtlijnen BSL2 worden afgehandeld (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Alle procedures uitgevoerd met infectieuze agentia werden goedgekeurd door de Institutional bioveiligheid Comite van de Medische Universiteit van Zuid-Carolina.

  1. Acht dagen na het implanteren van muizen met MB49 cellen, controleer hematurie. Pick-up individuele dieren op een wit stuk absorberend papier en druk voorzichtig op de buik om druppels urine vlek op het papier. Urine die is roze tot rood geeft hematurie en is een teken dat tumoren hebben vastgesteld. Tumor nemen bedraagt ​​ten minste 80% en met een uitstekende techniek kan oplopen tot 100%.
  2. Ontdooi adenovirale voorraad op ijs en vul aan tot 10 9 PFU/50 pi (2 x 10 10 PFU / ml) in een steriele, kamertemperatuur PBS.
  3. Verdoven muizen zoals beschreven in de stappen 1,3-1,6 boven.
  4. Katheteriseren muizen zoals beschreven in stap 1.8 en verwijder urine als in stap 1.9
  5. Nadat urine wordt verwijderd, onmiddellijk pipet 50 ul virussuspensie in de naaf van de katheter. Bevestig de 1 ml spuit met lucht gevulde de naaf van de katheter en leveren het virus aan de blaas door langzaam indrukken van de plunjer 0,1-0,2 ml.
  6. Het verlaten van de katheter-spuitset in de plaats, zodat het virus te wonen in de blaas voor 40 minuten.
  7. Trekken zachtjes de katheter-spuitset van de urethra, en gooi die in 10% bleekwater oplossing om de resterende virus te inactiveren.
  8. Draai de isofluraan concentratie op nul en beweeg elke muis een centimeter of twee verwijderd van de neuskegel te herstellen op de verwarming pad.
  9. Als een muis haar oprichtende reflex heeft herwonnen, terug in de kooi.
  10. Mark kooien om die muizen te geven zijn ingeprent met adenovirus. Virus zal worden afgestoten in de kooi beddengoed voor meerdere dagen en alle kooien en beddengoed moetenbehandeld en op de juiste wijze gedesinfecteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hematurie waargenomen in vrijwel alle muizen binnen 8 dagen na implantatie van 200.000 MB49 cellen. Zoals getoond in figuur 1, blaas gewicht meer dan verdubbeld van 34,7 ± 3,3 mg (bereik 31-37 mg, n = 4) in nontumor muizen met 87,5 ± 19,2 mg (range 77-120 mg, n = 10) bij muizen die zijn geïmplanteerd MB49 cellen. In termen van genlevering, vonden we dat het afbeelden van muizen 24 uur na virale instillatie levert een sterker signaal dan na 48 uur (figuur 2). Adenovirale levering is zeer variabel tussen dieren, waarmee rekening moet worden gehouden bij de planning groepsgrootte voor statistische doeleinden (figuur 2 en 3). Als een klein dier beeldvormingssysteem is, mag een alternatieve benadering om expressie van het luciferase transgen meten is verwijderd en homogeniseer de blaas in vitro analyse. Vergelijking tussen in vivo analyse met behulp van de IVIS200 klein dier system en in vitro analyse met behulp van Steady-Glo kit, geven uitstekende correlatie tussen datasets (figuur 3).

Figuur 1
Figuur 1. Analyse van tumorlast. Gewicht nontumor (n = 4) en tumordragende (n = 10) muis blazen 9 dagen na instillatie van 200.000 MB49 cellen. Statistische significantie werd bepaald door de Student's t-test met het Graphpad software. * P = 0,0002. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. In vivo analyse van genexpressie. 9 PFU AdCMV.Luc (+). Om luciferase visualiseren, werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 200 ug luciferine / muis. Expressie van het luciferase transgen werd gemeten in vivo met behulp van de IVIS200 beeldvormingsexperimenten systeem. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figuur 3. Vergelijking van bioluminescentie signalen verkregen door in vivo beeldvorming van proefdieren en een in vitro assay. Vierentwintig uur na levering virus opslagbuffer (open cirkels) of 1 x 10 9 PFU AdCMV.Luc (dichte cirkels), muizen afgebeeld met behulp van de IVIS200 en vervolgens sacrificed.. Blazen werden verwijderd en gehomogeniseerd in vitro analyse van de bioluminescentie signaal met behulp van de Steady-Glo kit. Luciferase signaal verkregen door elke methode wordt uitgedrukt in arbitraire eenheden (AU). De determinatiecoëfficiënt (R2) werd berekend met de Data Analysis-invoegtoepassing van Microsoft Excel. Klik hier voor grotere afbeelding .

Belediging voor GAG laag Cellen geïmplanteerd Retentietijd Tumoropsporing en Ontwikkeling verwijzing
Elektrocauterisatie 0.01-1 x 10 5 MB49 Hematurie: 1.000 cellen: 0/0, 10.000 cellen: 4/6, 100,000 cellen: 6/6 Tumoren: 1.000 cellen: 0/6, 10.000 of meer cellen: 6/6, 6/6 (100%) 5
Electrocautery 5 x 10 4 MB49-Luc Tumorincidentie: 90% (zoals in referentie 11) 6
Elektrocauterisatie 1 x 10 5 MB49 ~ 3 uur Tumorincidentie: 90% bij 50 dagen 7
Elektrocauterisatie 1 x 10 5 MB49-PSA PSA: al 4 dagen na implantatie gedetecteerd 8
Elektrocauterisatie 1 x 10 5 MB49 Tumorincidentie: 90% 9
Elektrocauterisatie 5 x 10 4 MB49 2 hr Tumorincidentie: 83.3% (10/12) op dag 21 10
Elektrocauterisatie 2 x 10 4 MB49 2 hr Tumorincidentie: 100% bij dag 28 11
Elektrocauterisatie 1-5 x 10 4 MB49 3 hr Hematurie: 100% overdag 16; tumorincidentie: 100% 12
Elektrocauterisatie 1 x 10 5 MB49 3 hr Tumorincidentie: 97.3% (73/75) 13
PLL (100 ul 0.01% 20 min) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Tumorincidentie: 100% 15
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Tumorincidentie: 100% 16
PLL (100 pl 0,1 mg / ml 20 min) 1 x 10 5 MB49 1 uur Tumorincidentie: 94% (15/16) 17
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 6 MB49 Hematurie op dag 7: 50%, 100% op dag 14 18
PLL (100 ui 0,1 ug / ml 20 min) of 22% ethanol 1 x 10 5 MB49 1 uur Tumorincidentie: Ongewijzigde blaas: 0%, PLL: 80-100%; Ethanol 40-80% 19
Zilvernitraat (5 pl 0,2 M) 1 x 10 6 MB49 1 uur Tumorincidentie: 100% 20
Zilvernitraat (10 ul 0,15 M 10 sec) 5 x 10 5 MB49 Tumorincidentie: 92% (46/50) 21
Zilvernitraat (8 ul 1 M 10 sec) 5 x 10 5 MB49 2 hr Hematurie: 100% op dag 7; dagen hematurie 100%; tumorincidentie: 96,7% (29/30 muizen) op dag 15 22
Zilvernitraat 5 pi 0,2 M 0,5-2 x 10 6 MB49-PSA 1 uur PSA gedetecteerd 23
HCl (100 ul 0,1 M 15 sec) 1 x 10 6 MB49 1 uur 24

Tabel 1. Tumordetectie en ontwikkeling na orthotope implantatie van cellen MB49. Verschillende fysische en chemische beledigingen zijn gebruikt voor verstoring van de GAG laag op intravesicale groei van MB49 cellen vergemakkelijken. Experimentele omstandigheden en de resultaten van eerdere studies met behulp van de MB49 orthotopic model samengevat. Indien beschikbaar, de gegevens tussen haakjes in de eerste kolom zijn volume, concentratie en contacttijd van middel voor chemische verstoring van de GAG-laag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De in dit protocol beschreven primaire methode is catheterisatie van de muis blazen, die brede toepassingen voor het inbrengen van cellen of een agent die bestemd zijn voor de lokale levering aan de blaas epitheel heeft. De specifiek protocol hierboven beschreven is geoptimaliseerd voor de korte-termijn studies (~ 10 dagen). Implantatie van de juiste aantal cellen is cruciaal, aangezien een groter aantal cellen resulteert in een snellere tumorgroei en mogelijk verlies van dieren door grote tumorlast. Met 200.000 MB49 cellen voor instillatie vereisen euthanasie tot 25% van de dieren op dag 14 door overmatige tumorlast. In onze ervaring, zijn muizen niet nadelig worden beïnvloed door tumorload binnen 12 dagen. Naast de standaard criteria zoals lethargie, slechte verzorging en / of verlies van eetlust overmatig tumorlast in dit model wordt aangetoond door het onvermogen te urineren.

Een belangrijke overweging voor dit protocol is de logistiek. Eerste, MB49 cellen groeien rapidly en plating een miljoen cellen twee dagen vóór implantatie zal optimaal culturen in log-fase opleveren op de dag van instillatie. Indien het aantal benodigde dieren voor een experiment groter dan het aantal dieren dat kan worden geïmplanteerd in een dag, MB49 culturen worden ingesteld overeenkomstig (op meerdere dagen) om overgroei van culturen voorkomen. Ten tweede, totdat de techniek is geperfectioneerd, gebruikers moeten werken met een kleine groep dieren. Ervaren gebruikers kunnen 6 groepen van elk 5 muizen geïmplanteerd in een dag zonder assistent (1,5 uur / groep omvattende verblijftijden). Maar in eerste instantie is het nuttig om een ​​assistent te bereiden en tel de cellen voor instillatie. Tenslotte locatie van materieel belang. Idealiter zou de bioveiligheid kast en anesthesieapparatuur bevinden zich in dezelfde ruimte.

Een mogelijke beperking is dat de anesthesie apparatuur is 5 nosecones, die in gebruik tijdens verblijftijd. Indien grote aantallen muizen routinematig worden geïmplanteerd, seVeral dergelijke systemen kunnen worden gebruikt in parallel. In theorie zouden andere werkwijzen voor anaesthesie worden gebruikt. Echter, een voordeel van isofluraan inhalatie-anesthesie is dat verblijftijd kan worden geregeld.

Als de techniek van katheterisatie, kan dat protocol worden toegepast op een aantal experimentele condities. Nieuwe blaaskanker cellijnen of cellen afkomstig van de primaire blaastumoren kan worden geëvalueerd op hun potentieel om orthotopically groeien. Verder is het mogelijk om verschillende aantallen cellen te implanteren om de drempel bedrag vereist tumor aannemen. Tumorgroei tarieven kunnen worden vastgesteld. Deze variaties kunnen bijzonder nuttig zijn als vergelijkingen betreffen genetisch gemodificeerde cellen om het effect van het gen van belang op tumorgroei inrichting of de groeisnelheid bepalen. Voor de bewaking van hechting, groei of tumor nemen, kunnen cellen worden getransfecteerd met een reportergen zoals luciferase 6. Echter, een belangrijke considerantsoen is de impact van hypoxie en necrose op de bioluminescentie signaal 29. Catheterisatie kan ook worden gebruikt om een ​​therapeutisch middel af. We zijn momenteel met behulp van de orthotopic model genlevering strategieën te evalueren in een in vivo setting. Dit model zal nuttig zijn om de levering van geneesmiddelen te optimaliseren en hun invloed op de tumor regressie en overleving bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH R21 CA143505 om Christina Voelkel-Johnson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Name of reagent

Company

Catalog number

Comments

6-8 week old female mice

Jackson Laboratories

Strain Name: C57BL/6J

Stock Number: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Obtained through Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Obtained through Fisher

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 flasks*

Corning Costar

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Obtained through Fisher

MB49 cells

N/A

N/A

Obtained from Dr. Boehle (see reference11)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Obtained through Fisher

Depilatory cream: Veet

local pharmacy

Lubricant:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Obtained through Fisher

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

Obtained though hospital pharmacy

1 ml slip tip TB syringes

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use

Infectious agent that requires BSL2 containment

Steady-Glo Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Anesthesia system

E-Z Systems, Euthanex Corporation

Anesthesia system: EZ7000

5-port mouse rebreathing device: EZ109

Obtained through Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62, (1), 10-29 (2012).
  2. Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2, (12), 1008-1014 (2009).
  3. Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46, (11), 5507-5510 (1986).
  4. De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163, (6), 1999-2001 (2000).
  5. Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182, (2), 749-755 (2009).
  6. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, (1), 120-124 (2008).
  7. Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174, (3), 1115-1118 (2005).
  8. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10, (20), 6977-6984 (2004).
  9. Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9, (12), 4522-4528 (2003).
  10. Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7, (4), 159-166 (2002).
  11. Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167, (1), 357-363 (2002).
  12. Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, (12), 2834-2837 (1999).
  13. Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161, (5), 1702-1706 (1999).
  14. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
  15. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
  16. Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101, (3), 751-758 (2009).
  17. Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31, (1), 34-42 (2008).
  18. Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11, (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
  19. Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39, (4), 384-393 (2005).
  20. Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187, (6), 2228-2235 (2012).
  21. Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66, (12), 2121-2124 (2011).
  22. Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34, (2), 220-226 (2008).
  23. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  24. Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50, (7), 1111-1118 (2011).
  25. Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66, (5), 1116-1121 (2005).
  26. Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13, (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
  27. Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165, (2), 667-671 (2001).
  28. Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170, (3), 979-984 (2003).
  29. Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, (11), 1799-1804 (2010).
Een orthotope Blaaskanker Model voor Gene Delivery Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).More

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter