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Medicine

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

doi: 10.3791/50181 Published: December 1, 2013

Summary

Impianto di cellule tumorali nell'organo di origine può servire come un modello preclinico utile per valutare nuove terapie. Cellule di carcinoma della vescica MB49 possono essere coltivate all'interno della vescica seguente instillazione intravescicale. Questo protocollo dimostra cateterizzazione della vescica topo a scopo di impianto tumorale e consegna adenovirale.

Abstract

Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale e nuovi approcci terapeutici che possono ridurre la recidiva e la progressione sono necessari. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo tumorale e risposta alla terapia. È pertanto spesso desiderabile crescere le cellule tumorali nell'organo da cui sono derivati. Questo protocollo descrive un modello ortotopico di cancro della vescica, in cui murine cellule di carcinoma della vescica MB49 sono instillato nella vescica tramite cateterizzazione. Impianto di cellule tumorali successo in questo modello richiede interruzioni dello strato protettivo glicosaminoglicani, che può essere effettuata con mezzi fisici o chimici. Nel nostro protocollo vescica viene trattata con tripsina prima dell'instillazione cella. Cateterizzazione della vescica può anche essere usati per fornire terapie una volta che i tumori sono stabiliti. Questo protocollo descrive la consegna di un costrutto adenovirale che esprime un gene reporter luciferasi. Mentre oprotocollo ur è stato ottimizzato per studi a breve termine e si concentra sulla consegna del gene, la metodologia di topo cateterismo vescicale ha vaste applicazioni.

Introduction

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Il cancro della vescica è il secondo tumore più comune del tratto urogenitale con circa 75.000 nuovi casi e 15.000 decessi attesi nel 2012 1. Alti tassi di recidiva richiedono follow-up permanente, che rende il cancro della vescica uno dei tumori più costoso da trattare. Cancro della vescica che ha invaso lo strato muscolare può metastatizzare fegato, polmone o osso attraverso il sistema linfatico. La terapia multimodale dei tumori avanzati risultati solo nel 20-40% di sopravvivenza dopo 5 anni. Pertanto, sono urgentemente necessarie strategie di trattamento efficaci volti a ridurre la recidiva e la progressione del tumore superficiale della vescica, nonché a migliorare il risultato terapeutico nei pazienti con malattia avanzata.

Sviluppo di nuove terapie richiede modelli preclinici per valutare l'efficacia seguente valutazione iniziale in vitro. Il microambiente tumorale può influenzare significativamente lo sviluppo del cancro e la risposta, che evidenzia la necessità di preclinicoAL modelli in cui i tumori si presentano o possono essere stabiliti nell'organo di origine. Un approccio è lo sviluppo di modelli transgenici in cui i tumori sorgono spontaneamente o possono essere indotte in maniera organo-specifica. Un protocollo ottimo di un modello di cancro della vescica transgenico è stato recentemente pubblicato 2. Lo svantaggio di modelli transgenici è che i tumori tendono a svilupparsi lentamente e con meno uniformità di quanto desiderato. Inoltre, il costo di mantenimento di una colonia di riproduzione deve essere considerato. Un'alternativa ai modelli transgenici è impianto ortotopico di cellule tumorali, che ha il vantaggio di tempi brevi per lo stabilimento del tumore nei topi disponibili in commercio. Mentre alcune linee cellulari di cancro della vescica umane possono essere coltivate ortotopicamente (abbiamo utilizzato con successo UM-UC-3), può essere auspicabile stabilire tumori in topi immunocompetenti. Due linee di cellule di cancro alla vescica murini, che crescono ortotopicamente sono MBT-2 e MB49 3. Poiché MBT-2 celle sono contaminati da replicaretipo C retrovirus 4, abbiamo scelto MB49 celle per i nostri studi. È importante notare che MB49 cellule sono state isolate da un topo maschio e implantologia ortotopiche sono per ragioni anatomiche eseguite nei topi femmina. Questo ha il vantaggio di una facile identificazione delle cellule impiantate mediante marcatori del cromosoma Y, ma il disadattamento genere può essere uno svantaggio per studi immunologici.

L'epitelio vescicale è fiancheggiato da un glicosaminoglicani (GAG) strato, che funziona come una barriera per l'infezione da microrganismi. Questa barriera può anche interferire con impianto di cellule tumorali e diversi metodi sono stati sviluppati per superare questa difficoltà (Tabella 1). Elettrocauterizzazione è stato ampiamente utilizzato come un mezzo fisico di perturbare lo strato di GAG 5-13 e dimostrando elettrobisturi protocollo è stato recentemente pubblicato in JoVE 14. Tuttavia, se una unità elettrocauterizzazione non essere disponibile, mezzi chimici per distruggere il GAG strato come il nitrato di argento o poli-L-lisina può essere utilizzato anche 15-24. I tumori sono stabiliti efficacemente da una breve esposizione della vescica di un piccolo volume di nitrato d'argento (5-10 microlitri, 0,15-1,0 M, ~ 10 sec) o contatto prolungato con poli-L-lisina (100 pl di 0,1 mg / ml per 20 min) (Tabella 1). Qui si descrive un metodo che utilizza tripsina per facilitare l'impianto di MB49 cellule.

Nel tentativo di migliorare gli approcci terapeutici per il cancro della vescica, la terapia genica ha raccolto notevole attenzione. Da un punto di vista clinico, cancro della vescica è un bersaglio ideale per la terapia genica a causa di facile accessibilità dell'organo e la capacità di fornire localmente il carico utile. Vettori virali che sono stati esplorati per la terapia genica del cancro della vescica includono una oncolytic virus herpes simplex 25, 26 retrovirus, virus del canarino 27, virus vaccinico, AAV, e adenovirus 28. Nella seconda parte del nostro protocollo, si descrive un metodo per la consegna virale che è praticamente identico a instillazione delle cellule tumorali. Di interesse nel nostro laboratorio è lo sviluppo di nuovi approcci alla consegna del gene, che valutiamo tramite bioluminescenza utilizzando un vettore adenovirale che esprime un transgene luciferasi. Tuttavia, la metodologia di cateterismo vescicale può essere utilizzato per la consegna di vari agenti e quindi ha vasta applicabilità.

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Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati esaminati e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la Medical University of South Carolina. Il protocollo è stato approvato in base USDA categoria D per il dolore.

1. Impianto cellulare

  1. Due giorni prima di eseguire la procedura, piatto 1 x 10 6 MB49 cellule in T-25 palloni. Utilizzare alta DMEM glucosio supplementato con 10% FBS (e antibiotici, se lo si desidera). Una beuta è sufficiente per ciascun gruppo di fino a cinque topi che verrà anestetizzato e impiantato in parallelo.
  2. Il giorno della procedura, preparare tripsina per instillazione diluendo sterile 0,25% tessuto coltura grado tripsina allo 0,125% con terreno base DMEM sterile (diluizione 1:2). 1,2 ml è sufficiente per 10 topi. Mettere in bagnomaria a 37 ° C per equilibrare.
  3. Preriscaldare una piastra elettrica e posizionarlo sotto le nosecones del sistema di anestesia che verranno utilizzati per fornire isoflurane. Posizionare un tampone assorbente pulito sopra il pad di riscaldamento.
  4. Topi posto nella camera di induzione del sistema di anestesia e indurre anestesia con isoflurano 3%. Quando i topi hanno perso la coscienza, che è verificata la perdita del riflesso toe-pinch, trasferirli ai nosecones. Assicurarsi che ogni animale è in posizione supina e correttamente posizionato sulla piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea.
  5. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia.
  6. Applicare una pomata oftalmica per entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione.
  7. Passaggio facoltativo: Eliminare i peli addominali. Parrucchieri sull'addome inferiore deve essere rimossa se ​​verrà effettuata in vivo bioluminescente imaging.
    1. Applicare uno strato abbondante di crema depilatoria, come Veet, al più basso 1 in piazza della pelliccia sull'addome, facendo attenzione a non contattare i genitali esterni. Attendere 3 min.
    2. Rimuovere i capelli strofinando la zona con una spugna asciutta, e quindi utilizzare una spugna umida per pulire la pelle. Ripetere una volta, se necessario.
  8. Cateterizzare la vescica
    1. Lubrificare un nuovo, sterile 24 G catetere venoso pediatrica con un gel lubrificante non irritante come KY. Rimuovere e gettare l'ago. Se fuoriuscita di fluido intorno al catetere è un problema comune, vale a dire. si verifica più frequentemente che in una delle dieci topi, cateteri diametro maggiore (20 g) possono essere utilizzati. Questo può essere una considerazione importante in topi di età superiore a 8 settimane.
    2. Tenendo il fulcro del catetere, utilizzare il pollice e l'indice della mano opposta a diffondere le zampe posteriori del mouse ed esporre il meato uretrale. Inserire delicatamente il catetere nell'uretra con un angolo di 45 °, modificando l'angolo di una parallela con il banco per inserirlo completamente.
    3. Dopo inserimento completo, sollevare il catetere delicatamente, mantenendolo parallelo al banco, e confermare visivamente che viene inserito nell'uretra e non la vagina, che è al di sotto di esso. Se posizionato correttamente, il catetere potrà essereserisce pienamente poiché la vagina è più corta della uretra.
    4. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 1%.
  9. Attaccare una punta di una pipetta P200 e rimuovere urina dalla vescica applicando aspirazione all'estremità esterna del catetere. Rimuovere eventuali residui di urina dal mozzo del catetere. Eliminare l'urina e lasciare catetere.
  10. Pipetta con cautela 80 ml soluzione di tripsina 0,125% nel mozzo del catetere, evitando bolle d'aria. Attaccare una siringa piena d'aria 1 ml di raccordo del catetere e lentamente spingere il pistone 0,1-0,2 ml per consegnare la tripsina nella vescica.
  11. Lasciare la siringa e gruppo catetere in posizione per 15 min. Ripetere i passaggi 1,8-1,11 per qualsiasi rimanenti topi anestetizzati (fino a 4). Procedere con il passaggio successivo durante il periodo di attesa. SUGGERIMENTO: Inizialmente può essere utile avere qualcuno a preparare le cellule (passo 1.12).
  12. Preparare le cellule MB49 per l'impianto. Le cellule sono state piastrate a 1 x 10 6 per T-25 pallone 48 ore prima dell'impianto (punto 1.1).
    1. Rimuovere i supporti e aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina al pallone. Quando le cellule si staccano aggiungere 5 ml di DMEM completo di riattivare le cellule. Rimuovere una aliquota di 50 microlitri di contare, e centrifugare il resto a 1.000 rpm per 5 min. Durante la fase di centrifugazione continuare a passi 1.12.2 e 1.12.3.
    2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare le cellule / ml. Quindi calcolare il volume necessario per portare il pellet cellulare a 4 x 10 6 cellule / ml (2 x 10 5 cellule per 50 microlitri).
    3. Versare il surnatante dalle cellule centrifugate e risospendere il pellet in terreno di base DMEM con il volume richiesto di sospendere le cellule a 4 x 10 6 cellule / ml (come calcolato al punto 1.12.2). Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
  13. Quando viene raggiunto il punto di tempo di 15 min per trattamento con tripsina di vesciche, staccare la siringa piena d'aria dal catetere lasciando il catetere in posizione. Tripsina speso sarà normalely rifluire attraverso il catetere. Rimuovere eventuali tripsina rimanente dalla vescica mediante aspirazione con la pipetta P200 come al punto 1.9 e scartare.
  14. Pipettare immediatamente 50 ml di sospensione cellulare MB49 nel mozzo del catetere. Attaccare la siringa piena d'aria 1 ml al mozzo del catetere e fornire le cellule alla vescica lentamente lo stantuffo 0,1-0,2 ml. Ripetere questa operazione fino a quattro volte supplementari per impiantare tutti e cinque i topi. Eliminare le celle inutilizzate.
  15. Lasciando il gruppo catetere-siringa in loco, permettono alle cellule di abitare nella vescica per 50 min.
  16. Prelevare delicatamente il gruppo catetere-siringa dall'uretra. Girare la concentrazione di isoflurano a zero e spostare ogni mouse di un centimetro o due di distanza dal musetto di recuperare sul pad di riscaldamento.
  17. Quando un topo ha riacquistato il suo riflesso di raddrizzamento, tornare alla sua gabbia.

2. Consegna intravescicale di Adenovirus (8 giorni dopo l'impianto di cellule) ATTENZIONE: Questa parte del protocollo utilizza adenovirus, che è un agente infettivo e deve essere maneggiato secondo le linee guida BSL2 severe (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Tutte le procedure eseguite con agenti infettivi sono stati approvati dal Comitato di Biosicurezza istituzionale della Medical University of South Carolina.

  1. Otto giorni dopo l'impianto di topi con cellule di MB49, verificare la presenza di ematuria. Pick up singoli animali su un pezzo di carta assorbente e premere delicatamente sul ventre per cancellare gocce di urina sulla carta. Urina che è rosa al rosso indica ematuria ed è un segno che i tumori hanno stabilito. Tasso di tumore è almeno 80% e con eccellente tecnica può essere fino al 100%.
  2. Scongelare adenoviral azione sul ghiaccio e diluire a 10 9 PFU/50 microlitri (2 x 10 10 PFU / ml) in sterile, a temperatura ambiente PBS.
  3. Anestetizzare topi come descritto ai punti 1.3-1.6 sopra.
  4. Cateterizzarla topi come descritto ai punti 1.8 e rimuovere urina come al punto 1.9
  5. Dopo urina viene rimosso, pipettare immediatamente 50 ml di sospensione di virus nel mozzo del catetere. Attaccare la siringa piena d'aria 1 ml al mozzo del catetere e consegnare il virus alla vescica lentamente lo stantuffo 0,1-0,2 ml.
  6. Lasciando il gruppo catetere-siringa in loco, permettono al virus di abitare nella vescica per 40 min.
  7. Prelevare delicatamente il gruppo catetere-siringa dall'uretra, e gettare nella soluzione di candeggina al 10% per inattivare i virus rimanente.
  8. Girare la concentrazione di isoflurano a zero e spostare ogni mouse di un centimetro o due di distanza dal musetto di recuperare sul pad di riscaldamento.
  9. Quando un topo ha riacquistato il suo riflesso di raddrizzamento, tornare alla sua gabbia.
  10. Segna gabbie per indicare che i topi sono stati instillato con adenovirus. Virus sarà versato nel letto dei gabbia per diversi giorni e tutte le gabbie e biancheria da letto deve esseremanipolati e disinfettati adeguatamente.

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Representative Results

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Ematuria è osservato in quasi tutti i topi entro 8 giorni dopo l'impianto di 200.000 MB49 cellule. Come mostrato in Figura 1, peso vescica è più del doppio di 34,7 ± 3,3 mg (range 31-37 mg, n = 4) in topi non tumorali cuscinetto a 87,5 ± 19,2 mg (range 77-120 mg, n = 10) in topi che sono stati impiantati con MB49 cellule. In termini di consegna del gene, abbiamo trovato che l'imaging topi 24 ore dopo l'instillazione virale produce un segnale più forte dopo 48 ore (Figura 2). Consegna adenovirale è molto variabile tra gli animali, che dovrebbero essere presi in considerazione durante la pianificazione di partecipanti a fini statistici (Figure 2 e 3). Se un piccolo sistema di imaging animale non è disponibile, un approccio alternativo per misurare l'espressione del transgene luciferasi è rimuovere e omogeneizzare vescica per analisi in vitro. Confronto tra nell'analisi vivo utilizzando il IVIS200 piccolo syste animalim ed in analisi in vitro utilizzando il kit steady-Glo, indicano eccellente correlazione tra insiemi di dati (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Analisi del carico tumorale. Peso di non tumorali (n = 4) e portatore di tumore (n = 10) vesciche topo 9 giorni dopo l'instillazione di 200.000 MB49 cellule. La significatività statistica è stata determinata mediante il test t di Student utilizzando il software Graphpad. * P = 0,0002. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. In vivo analisi dell'espressione genica. 9 PFU AdCMV.Luc (+). Per visualizzare luciferasi, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 200 mg luciferina / mouse. Espressione del transgene luciferasi è stata misurata in vivo usando il piccolo sistema di imaging animali IVIS200. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. Confronto tra segnali bioluminescenza ottenuti per l'imaging in vivo piccoli animali e un saggio in vitro. Ventiquattro ore dopo la consegna del tampone di conservazione virus (cerchi aperti) o 1 x 10 9 PFU AdCMV.Luc (cerchi chiusi), i topi sono stati ripreso utilizzando il IVIS200 e poi sacrificareed. Vesciche sono stati rimossi e omogeneizzati per l'analisi in vitro del segnale bioluminescente utilizzando il kit steady-Glo. Segnale luciferasi ottenuta mediante ogni metodo è espressa in unità arbitrarie (AU). Il coefficiente di determinazione (R 2) è stata calcolata con l'analisi dei dati add-in di Microsoft Excel. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Insulto a strato GAG Cellule impiantate Tempo di ritenzione L'individuazione e lo sviluppo del tumore riferimento
Elettrocauterizzazione 0,01-1 x 10 5 MB49 Ematuria: 1.000 cellule: 0/0; 10.000 celle: 4/6; 100.000 celle: 6/6 Tumori: cellule 1.000: 0/6, 10000 o più celle: 6/6, 6/6 (100%) 5
ElectrocautEry 5 x 10 4 MB49-Luc Tumore incidenza: 90% (come nel riferimento 11) 6
Elettrocauterizzazione 1 x 10 5 MB49 ~ 3 ore Tumore incidenza: 90% a 50 giorni 7
Elettrocauterizzazione 1 x 10 5 MB49-PSA PSA: rilevata fin da 4 giorni dopo l'impianto 8
Elettrocauterizzazione 1 x 10 5 MB49 Incidenza di tumori: 90% 9
Elettrocauterizzazione 5 x 10 4 MB49 2 hr Incidenza di tumori: 83,3% (10/12) il giorno 21 10
Elettrocauterizzazione 2 x 10 4 MB49 2 hr Incidenza di tumori: 100% di giorno 28 11
Elettrocauterizzazione 1-5 x 10 4 MB49 3 ore Ematuria: 100% di giorno 16; incidenza del tumore: 100% 12
Elettrocauterizzazione 1 x 10 5 MB49 3 ore Tumore incidenza: 97,3% (73/75) 13
PLL (100ul 0,01% 20 min) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Incidenza di tumori: 100% 15
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Incidenza di tumori: 100% 16
PLL (100 microlitri 0,1 mg / ml 20 min) 1 x 10 5 MB49 1 ora Tumore incidenza: 94% (15/16) 17
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 6 MB49 Ematuria al giorno 7: 50%, 100% al giorno 14 18
PLL (100 microlitri 0,1 mcg / ml 20 min) o 22% etanolo 1 x 10 5 MB49 1 ora Tumore incidenza: vescica non modificato: 0%, PLL: 80-100%; etanolo 40-80% 19
Nitrato d'argento (5 microlitri 0,2 M) 1 x 10 6 MB49 1 ora Incidenza di tumori: 100% 20
Nitrato d'argento (10 microlitri 0,15 M 10 sec) 5 x 10 5 MB49 Tumore incidenza: 92% (46/50) 21
Nitrato d'argento (8 pl 1 M 10 sec) 5 x 10 5 MB49 2 hr Ematuria: 100% al giorno 7; giorni ematuria al 100%; incidenza del tumore: 96.7% (29/30 topi) al giorno 15 22
Nitrato d'argento 5 microlitri 0,2 M 0,5-2 x 10 6 MB49-PSA 1 ora PSA rilevato 23
HCl (100 microlitri 0,1 M 15 sec) 1 x 10 6 MB49 1 ora 24

Tabella 1. Rilevazione del tumore e sviluppo dopo l'impianto ortotopico di cellule MB49. Diversi insulti fisici e chimici sono stati utilizzati per l'interruzione dello strato GAG per facilitare la crescita intravescicale MB49 cellule. Condizioni sperimentali ei risultati di studi precedenti che utilizzano il modello ortotopico MB49 sono riassunti. Quando disponibili, le informazioni tra parentesi nella prima colonna comprende il volume, la concentrazione e tempo di contatto di agente utilizzato per l'interruzione chimica dello strato GAG.

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Discussion

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La metodologia primario descritto in questo protocollo è cateterizzazione di vesciche topo, che ha applicazioni di massima per instillazione di cellule o di qualsiasi agente destinati per il recapito locale all'epitelio vescicale. Il protocollo specifica di cui sopra è stato ottimizzato per studi a breve termine (~ 10 giorni). Impiantare il numero esatto delle cellule è fondamentale, dal momento che un elevato numero di cellule si tradurrà in più rapida crescita del tumore e possibile perdita di animali a causa della grande massa tumorale. Utilizzo di 200.000 MB49 cellule per instillazione può richiedere eutanasia fino al 25% degli animali di giorno 14 a causa di un eccessivo carico tumorale. Nella nostra esperienza, i topi non siano lesi da carico tumorale entro 12 giorni. In aggiunta ai criteri standard come letargia, povero governare, e / o perdita di appetito eccessivo carico tumorale in questo modello è testimoniata dalla incapacità di urinare.

Una considerazione importante per questo protocollo è la logistica. In primo luogo, le cellule crescono MB49 rapidly e placcatura milione cellule due giorni prima l'impianto produrrà culture ottimali in fase di registrazione il giorno di instillazione. Se il numero di animali necessari per un esperimento supera il numero di animali che possono essere impiantati in un giorno, culture MB49 dovranno essere impostato di conseguenza (su più giorni) per prevenire la crescita eccessiva di culture. In secondo luogo, fino a quando la tecnica è stata perfezionata, gli utenti dovrebbero lavorare con un piccolo gruppo di animali. Gli utenti esperti saranno in grado di impiantare 6 gruppi di 5 topi ciascuno in un giorno senza un assistente (1,5 ore / gruppo, compresi tempi di sosta). Tuttavia, inizialmente è utile avere un assistente preparare e contare le cellule per l'instillazione. Infine, la posizione delle attrezzature è importante. Idealmente l'armadio biosicurezza e apparecchiature per l'anestesia si trovano nella stessa stanza.

Un potenziale limitazione è che l'apparecchiatura anestesia ha 5 nosecones, che sono in uso durante il tempo di sosta. Se un gran numero di topi sono regolarmente impiantati, seVeral questi sistemi potrebbero essere usati in parallelo. In teoria, potrebbero essere utilizzati altri metodi di anestesia. Tuttavia, un vantaggio di anestesia per inalazione isoflurano è che il tempo di permanenza può essere controllato.

Una volta che la tecnica di cateterizzazione è padroneggiata, questo protocollo può essere applicato a una serie di condizioni sperimentali. Nuove linee di cellule di cancro alla vescica o cellule derivate da tumori della vescica primari possono essere valutati per il loro potenziale di crescita ortotopicamente. Inoltre, è possibile impiantare un diverso numero di celle per determinare la quantità soglia richiesta per tumore take. Possono anche essere stabiliti tassi di crescita del tumore. Queste variazioni possono essere particolarmente utili, se i confronti sono realizzati tra le cellule geneticamente modificate per determinare l'effetto del gene di interesse in stabilimento tumore o tasso di crescita. Per il monitoraggio di aderenza, il tasso di crescita, o tumore take, le cellule possono essere transfettate con un gene reporter come luciferasi 6. Tuttavia, un importante considerazione è l'impatto di ipossia e necrosi sul segnale bioluminescenza 29. Cateterizzazione può anche essere usati per fornire un agente terapeutico. Attualmente stiamo utilizzando il modello ortotopico di valutare le strategie di trasferimento genico in un ambiente in vivo. Questo modello sarà utile per ottimizzare l'erogazione di terapie e di determinare il loro impatto sulla regressione del tumore e la sopravvivenza.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 CA143505 a Christina Voelkel-Johnson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Name of reagent

Company

Catalog number

Comments

6-8 week old female mice

Jackson Laboratories

Strain Name: C57BL/6J

Stock Number: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Obtained through Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Obtained through Fisher

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 flasks*

Corning Costar

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Obtained through Fisher

MB49 cells

N/A

N/A

Obtained from Dr. Boehle (see reference11)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Obtained through Fisher

Depilatory cream: Veet

local pharmacy

Lubricant:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Obtained through Fisher

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

Obtained though hospital pharmacy

1 ml slip tip TB syringes

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use

Infectious agent that requires BSL2 containment

Steady-Glo Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Anesthesia system

E-Z Systems, Euthanex Corporation

Anesthesia system: EZ7000

5-port mouse rebreathing device: EZ109

Obtained through Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna
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Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).More

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).

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