Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ортотопическая Рак мочевого пузыря Модель для генной исследований Доставка

doi: 10.3791/50181 Published: December 1, 2013

Summary

Имплантация раковых клеток в органе происхождения могут служить в качестве полезного доклинической модели для оценки новых методов лечения. MB49 карциномы мочевого пузыря клетки могут быть выращены в мочевом пузыре следующие внутрипузырного введения. Этот протокол демонстрирует катетеризации мочевого пузыря мыши с целью имплантации опухоли и аденовирусной доставки.

Abstract

Рак мочевого пузыря является второй наиболее распространенной формой рака из урогенитального тракта и новых терапевтических подходов, которые могут снизить рецидив и прогрессирование необходимы. Микросреда опухоль может значительно влиять на развитие опухоли и ответ терапии. Поэтому часто бывает желательно выращивать опухолевые клетки в органе, из которого они произошли. Этот протокол описывает Ортотопическая Модель рака мочевого пузыря, в котором MB49 мышиные клетки карциномы мочевого пузыря закапывают в мочевой пузырь через катетеризации. Успешной имплантации опухолевых клеток в этой модели требуется разрушение защитного слоя гликозаминогликанов, который может быть достигнуто физическими или химическими средствами. В нашем протоколе мочевой пузырь обрабатывали трипсином до клеток закапывания. Катетеризации мочевого пузыря может также использоваться для доставки терапевтических средств после того, как опухоли установлено. Этот протокол описывает доставку аденовирусной конструкции, которая выражает люциферазы ген-репортер. В то время как оПротокол ур была оптимизирована для краткосрочных исследований и фокусируется на доставки генов, методология мыши катетеризации мочевого пузыря имеет широкое применение.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рак мочевого пузыря является второй наиболее распространенной формой рака из урогенитального тракта с почти 75 000 новых случаев заболевания и 15 000 случаев смерти, ожидаемых в 2012 г. 1. Высокие темпы повторения требуют пожизненной последующей деятельности, что делает рак один из самых дорогостоящих видов рака для лечения мочевого пузыря. Рак мочевого пузыря, который захвачена мышечный слой может метастазировать в печень, легкие или кости через лимфатическую систему. Мультимодальные терапия опухолей на поздних стадиях приводит только 20-40% выживания после 5 лет. Таким образом, эффективные стратегии лечения, направленные на снижение рецидивов и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря, а также улучшения терапевтического эффекта у пациентов с прогрессирующим заболеванием срочно необходимы.

Разработка новых терапии требуется доклинических моделей для оценки эффективности после первоначальной оценки в пробирке. Микросреда опухоль может значительно влиять на развитие рака и отзывчивость, в котором подчеркивается необходимость preclinicаль модели, в которых опухоли возникают или могут быть установлены в органе происхождения. Один из подходов является разработка трансгенных моделей, в которых опухоли возникают спонтанно или могут быть вызваны в форме конкретных органов. Отличным протокол из трансгенной модели рака мочевого пузыря был недавно опубликован 2. Недостатком трансгенных моделей является то, что опухоли, как правило, развиваются медленно и с меньшим однородности, чем хотелось бы. Кроме того, расходы на содержание гнездовой колонии должен быть рассмотрен. Альтернативой трансгенных моделей ортотопическая имплантации опухолевых клеток, который имеет преимущество коротких сроков для установления опухоли в коммерчески доступных мышей. Хотя некоторые линии рака мочевого пузыря клеток человека могут быть выращены ортотопически (мы успешно использовали UM-UC-3), может быть желательно установить опухолей у иммунокомпетентных мышах. Два мышиные рак мочевого пузыря клеточные линии, которые растут ортотопически являются MBT-2 и MB49 3. С MBT-2 клетки загрязнены тиражированиеТип C ретровирус 4, мы выбрали MB49 клетки для наших исследований. Важно отметить, что MB49 клетки выделяли из самца мыши и ортотопической имплантации предназначены для анатомических причин, выполненных в самок мышей. Это имеет то преимущество, легкой идентификации имплантированных клеток по маркеров Y-хромосомы, но гендерный несоответствие может быть недостатком для иммунологических исследований.

Эпителий мочевого пузыря выстлана гликозаминогликаны (ГАГ слоя), который функционирует как барьер для инфекции микроорганизмов. Этот барьер может также помешать имплантации опухолевых клеток и нескольких методов были разработаны, чтобы преодолеть эту трудность (табл. 1). Электрокоагуляции широко используется как физическими средствами сорвать кляп слой 5-13 и протокол демонстрируя электрокоагуляция был недавно опубликован в Юпитер 14. Тем не менее, следует электрокоагуляция устройство не доступны, химические средства для уничтожения GAG слой, такой как нитрат серебра или поли-L-лизина можно также использовать 15-24. Опухоли установлены эффективно с помощью кратковременной мочевого пузыря до небольшого объема нитрата серебра (5-10 мкл, 0.15-1.0 M, ~ 10 сек) или более контакт с поли-L-лизина (100 мкл 0,1 мг / мл в течение 20 мин) (табл. 1). Здесь мы опишем метод, который использует трипсин для облегчения имплантации MB49 клеток.

В попытке улучшить терапевтические подходы для рака мочевого пузыря, генная терапия привлекло значительное внимание. С клинической точки зрения, рак мочевого пузыря является идеальным объектом для генной терапии вследствие легкой доступности органа и способность к локально доставки полезной нагрузки. Вирусные векторы, которые были изучены для генной терапии рака мочевого пузыря включают онколитический вирус простого герпеса 25, 26 ретровирус, вирус оспы канареек 27, вирус коровьей оспы, AAV, и adenoviruS 28. Во второй части нашего протокола, мы опишем метод для вирусной доставки, которая практически не отличается от закапывания опухолевых клеток. Интересны в нашей лаборатории является разработка новых подходов к доставки генов, которые мы оцениваем с помощью биолюминесценции с помощью аденовирусного вектора, который выражает люциферазы трансген. Тем не менее, методика катетеризации мочевого пузыря может быть использован для доставки различных агентов и, следовательно, имеет широкое применение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры с участием животных были рассмотрены и утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Медицинском университете Южной Каролины в. Протокол был утвержден в соответствии с USDA категории D для боли.

1. Сотовый Имплантация

  1. За два дня до выполнения процедуры, пластина 1 х 10 6 MB49 клеток в Т-25 колб. Используйте высокое DMEM глюкозы с добавлением 10% FBS и антибиотиков (при желании). Один флакон является достаточным для каждой группы до пяти мышей, которые будут анестезировали и имплантированного параллельно.
  2. В день процедуры подготовки трипсин для инстилляции путем разбавления стерильной 0,25% культуре ткани класса трипсин до 0,125% стерильной среде DMEM базовой (1:02 разбавление). 1,2 мл достаточно для 10 мышей. Поместите на водяную баню 37 ° C, чтобы уравновесить.
  3. Prewarm грелку и расположите его на условиях nosecones системы анестезии, которые будут использоваться для доставки Isoflurane. Место чистое абсорбирующей прокладки на грелку.
  4. Наведите мышей в индукции камеры системы анестезии и анестезии с 3% изофлуран. Когда мышей потеряли сознание, которое проверяется потери схождение пинч рефлекса, передавать их на nosecones. Убедитесь, что каждое животное в лежачем положении и надлежащим образом размещены на грелку для поддержания температуры тела.
  5. Снизить концентрацию ИФ до 2% для поддержания анестезии.
  6. Применение глазной мази для обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание.
  7. Необязательный шаг: Удалить брюшной волосы. Шерсть на нижней части живота должны быть удалены, если будет выполнено в естественных условиях биолюминесцентного изображения.
    1. Примените щедрое слой депиляции кремом, например, Veet, до самого низкого 1 в площади мех на животе, заботясь, чтобы не связываться с наружных половых органов. Подождите 3 мин.
    2. Удалить волосы, потерев области с сухой губкой, а затем использовать влажную губку для очищения кожи. Повторите один раз, если это необходимо.
  8. Катетер в мочевой пузырь
    1. Смажьте новое, стерильную 24 г педиатрической венозный катетер с нераздражающим смазочной геля, таких как штат Кентукки. Снимите и выбросьте иглу. Если утечка жидкости вокруг катетера является общей проблемой, то есть. это происходит чаще, чем в одной из десяти мышей, крупный канал катетеры (20 г) могут быть использованы. Это может быть важным фактором в мышах в возрасте старше 8 недель.
    2. Проведение ступицу катетера, используйте большой и указательный пальцы вашей противоположной стороны, чтобы распространить задние ноги мыши и разоблачить мочеиспускательного канала. Аккуратно вставьте катетер в уретру под углом 45 °, изменяя угол к одному параллельно с скамейке, чтобы вставить его в полной мере.
    3. После полного ввода, поднимите катетер осторожно, держа его параллельно скамье, и визуально подтвердить, что он будет помещен в мочеиспускательный канал и не во влагалище, что ниже него. Если правильно, то катетер смогут находиться вполностью вставлен во влагалище, так как меньше, чем уретры.
    4. Снизить концентрацию ИФ до 1%.
  9. Присоединить наконечник к P200 пипетки и удалить мочи из мочевого пузыря, применяя всасывающий к внешнему концу катетера. Удалите оставшуюся мочу от ступицы катетера. Откажитесь мочу и оставить катетер на месте.
  10. Тщательно пипетки 80 мкл 0,125% раствора трипсина в ступицу катетера, избегая пузырьков воздуха. Присоединить воздуха заполненный шприц 1 мл на втулке катетера и медленно нажимать на поршень 0,1-0,2 мл доставить трипсин в мочевой пузырь.
  11. Оставьте шприца и катетера на месте в течение 15 мин. Повторите этапы 1.8-1.11 для любого из оставшихся анестезированных мышей (до 4). Перейдите к следующему шагу в период ожидания. СОВЕТ: Первоначально это может быть полезно, чтобы кто-то еще подготовить клетки (шаг 1,12).
  12. Подготовка MB49 клетки для имплантации. Клетки высевали на 1 х 10 6 за Т-25 колбу при 48-часовом перед имплантацией (шаг 1.1).
    1. Удалить медиа и добавьте 500 мкл 0,25% трипсина в колбу. Когда клетки отделяются добавить 5 мл полной DMEM, чтобы Ресуспендируют клеток. Удаление 50 мкл аликвоты считать, центрифуге и остаток на 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин. Во время стадии центрифугирования продолжать шаги 1.12.2 и 1.12.3.
    2. Граф клеток с помощью гемоцитометра. Рассчитайте клеток / мл. Затем рассчитать объем, необходимый для приведения в осадок клеток 4 × 10 6 клеток / мл (2 х 10 5 клеток на 50 мкл).
    3. Слейте супернатант из центрифугировали клеток и ресуспендируют осадок в DMEM базовой среды с использованием объема, необходимого приостановить клетки до 4 х 10 6 клеток / мл (как, вычисленных на этапе 1.12.2). Сохранить клетки при комнатной температуре.
  13. Когда время точка 15 мин для лечения трипсина пузырей достигнуто, отсоединить воздуха заполненный шприц из катетера на выходе из катетера на месте. Нахождения трипсина будет нормальнолы течь обратно через катетер. Удалить все оставшиеся трипсин из мочевого пузыря путем всасывания с P200 пипетки, как в пункте 1.9 выше, и выбросьте.
  14. Сразу 50 мкл клеточной суспензии MB49 во втулку катетера. Прикрепите воздушный заполненные шприц 1 мл к концентратору катетера и доставить клетки мочевого пузыря, медленно нажимая на поршень 0,1-0,2 мл. Повторите этот шаг до четырех дополнительных времена имплантировать все пять мышей. Отменить любые неиспользованные клетки.
  15. Оставив катетер-шприца на месте, позволяют клеткам жить в мочевом пузыре в течение 50 мин.
  16. Аккуратно снять катетер-шприца из уретры. Поверните концентрации ИФ нулю и двигаться каждой мыши на дюйм или два от головная чтобы восстановить на грелку.
  17. Когда мышь восстановила свою рефлекса, вернуть его в клетку.

2. Внутрипузырная Доставка аденовируса (8 дней после имплантации клеток) ВНИМАНИЕ: Это часть протокола использует аденовирус, который является инфекционный агент и должны быть обработаны в соответствии со строгими руководящими принципами BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Все процедуры, проводимые с инфекционными агентами были утверждены Комитетом по биобезопасности Institutional Медицинского Университета Южной Каролины на.

  1. Через восемь дней после имплантации мышей с MB49 клеток, проверьте гематурия. Возьмите отдельных животных на белом листе впитывающей бумаги и слегка нажмите на животе, чтобы уничтожить капель мочи на бумагу. Моча, что является розового до красного указывает гематурия и является признаком того, что опухоли установили. Скорость намотки опухоли составляет не менее 80% и с превосходной техники может достигать 100%.
  2. Разморозить аденовирусный запас на льду и разводят до 10 9 PFU/50 мкл (2 х 10 10 PFU / мл) в стерильном PBS при комнатной температуре.
  3. Обезболить мышей, как описано в шагах 1,3-1,6 выше.
  4. Катетер мышей, как описано в шагах 1.8 и удалить мочу, как в пункте 1.9
  5. После моча удаляется, немедленно 50 мкл вирусной суспензии в центр катетера. Прикрепите воздушный заполненные шприц 1 мл к концентратору катетера и доставить вирус в мочевой пузырь медленно нажимая на поршень 0,1-0,2 мл.
  6. Оставив катетер-шприца на месте, позволяют вирусу жить в мочевом пузыре в течение 40 мин.
  7. Аккуратно снять катетер-шприца из уретры, и выбросьте в 10% раствор хлорной извести для инактивации оставшуюся вирус.
  8. Поверните концентрации ИФ нулю и двигаться каждой мыши на дюйм или два от головная чтобы восстановить на грелку.
  9. Когда мышь восстановила свою рефлекса, вернуть его в клетку.
  10. Все клетки, чтобы указать, что мыши были привили с аденовируса. Вирус прольется в клетку постельных принадлежностей в течение нескольких дней, и все клетки и постельные принадлежности должны бытьобрабатываются и дезинфицируются надлежащим образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гематурия наблюдается почти во всех мышей в течение 8 дней после имплантации 200000 MB49 клеток. Как показано на рисунке 1, вес мочевого пузыря более чем в два раза с 34,7 ± 3,3 мг (диапазон 31-37 мг, п = 4) в неопухолевой подшипник мышей до 87,5 ± 19,2 мг (диапазон 77-120 мг, п = 10) у мышей, которые были имплантированы с MB49 клеток. С точки зрения доставки генов, мы обнаружили, что визуализации мышам через 24 часа после вирусной закапывания дает сильный сигнал, чем через 48 часов (рис. 2). Аденовирусный доставка сильно варьирует между животными, которые должны быть приняты во внимание при планировании размер группы для статистических целей (рис. 2 и 3). Если небольшое система визуализации животное не доступен, альтернативный подход измерить экспрессию люциферазы трансгена, чтобы удалить и гомогенизируют в мочевой пузырь для анализа ин витро. Сравнение в естественных условиях анализа с использованием IVIS200 небольшая животноводческая систем и в пробирке анализа с использованием набора Установившиеся Glo, указывают отличную корреляцию между наборами данных (рис. 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ опухоли бремя. Масса неопухолевой (п = 4) и несущей опухоль (N = 10) пузыри мыши через 9 дней после закапывания 200000 MB49 клеток. Статистическая значимость определялась Т-тест Стьюдента с помощью программного обеспечения Graphpad. * Р = 0,0002. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2
Рисунок 2. В естественных анализ экспрессии генов. 9 PFU AdCMV.Luc (+). Для визуализации люциферазы, мышам вводили внутрибрюшинно 200 мкг / мышь люциферин. Экспрессия люциферазы трансгена измеряли в естественных условиях с помощью небольшой системы визуализации животных IVIS200. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
Рисунок 3. Сравнение биолюминесценции сигналов, полученных в естественных условиях небольшого животного визуализации и анализа в пробирке. Двадцать четыре часа после родов буфера вирус хранения (открытые кружки) или 1 х 10 9 PFU AdCMV.Luc (черные кружки), мыши были отображаемого с помощью IVIS200 а затем sacrificиздание Пузыри были удалены, и гомогенизируют в течение анализа ин витро биолюминесцентного сигнала с использованием набора Steady-Glo. Люциферазы сигнал, полученный путем каждого метода выражается в произвольных единицах (AU). Коэффициент детерминации (R 2) была рассчитана в с Анализ данных надстройки из Microsoft Excel. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Оскорбление ГАГ слоя Клетки, имплантированные Время выхода Выявление и развитие опухоли ссылка
Электрокоагуляции 0,01-1 х 10 5 MB49 Гематурия: 1000 клеток: 0/0; 10000 клеток: 4/6; 100000 клеток: 6/6 Опухоли: 1.000 клеток: 0/6; 10000 или более ячеек: 6/6, 6/6 (100%) 5
ElectrocautEry 5 х 10 4 MB49-Люк Частота опухолей: 90% (как в ссылке 11) 6
Электрокоагуляции 1 × 10 5 MB49 ~ 3 часа Заболеваемость опухоли: 90% при 50 дней 7
Электрокоагуляции 1 × 10 5 MB49-PSA PSA: обнаружены еще в 4 дня после имплантации 8
Электрокоагуляции 1 × 10 5 MB49 Заболеваемость опухоли: 90% 9
Электрокоагуляции 5 х 10 4 MB49 2 часа Заболеваемость опухоли: 83,3% (10/12) на 21-й день 10
Электрокоагуляции 2 х 10 4 MB49 2 часа Заболеваемость опухоли: 100% на 28 день 11
Электрокоагуляции 1-5 х 10 4 MB49 3 часа Гематурия: 100% на 16 день; заболеваемость опухоли: 100% 12
Электрокоагуляции 1 × 10 5 MB49 3 часа Заболеваемость опухоли: 97,3% (73/75) 13
PLL (100 мкл 0.01% 20 мин) 1 × 10 5 MB49-PSA 2 часа Заболеваемость опухоли: 100% 15
PLL (0,1 мг / мл) 1 × 10 5 MB49-PSA 2 часа Заболеваемость опухоли: 100% 16
PLL (100 мкл 0,1 мг / мл 20 мин) 1 × 10 5 MB49 1 час Заболеваемость опухоли: 94% (15/16) 17
PLL (0,1 мг / мл) 1 х 10 6 MB49 Гематурия на 7 день: 50%, 100% на 14 день 18
PLL (100 мкл 0,1 мкг / мл 20 мин) или 22% этанол 1 х 10 5 МБ49 1 час Заболеваемость опухоли: Без изменений мочевого пузыря: 0%, PLL: 80-100%; Этанол 40-80% 19
Нитрат серебра (5 мкл 0,2 М) 1 х 10 6 MB49 1 час Заболеваемость опухоли: 100% 20
Нитрат серебра (10 мкл 0,15 М 10 сек) 5 х 10 5 MB49 Заболеваемость опухоли: 92% (46/50) 21
Нитрат серебра (8 мкл 1 М 10 сек) 5 х 10 5 MB49 2 часа Гематурия: 100% на 7-й день; дней гематурия 100%; заболеваемость опухоли: 96,7% (29/30 мышей) на 15 день 22
Нитрат серебра 5 мкл 0,2 М 0,5-2 × 10 6 MB49-PSA 1 час PSA обнаружены 23
HCl (100 мкл 0,1 М 15 сек) 1 х 10 6 MB49 1 час 24

Таблица 1. Обнаружение опухоли и развитие следующих ортотопического имплантации MB49 клеток. Различные физические и химические оскорбления были использованы для срыва кляп слоя для облегчения внутрипузырную рост MB49 клеток. Экспериментальные условия и результаты предыдущих исследований, использующих ортотопическую модель MB49 суммируются. При наличии информации в скобках в первом столбце включает объем, концентрацию и время контакта агента для использования в химической нарушению GAG слоя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Основная методика, описанная в этом протоколе является катетеризация пузырей мыши, который имеет широкое применение для закапывания клеток или любого агента, предназначенного для локальной доставки в эпителии мочевого пузыря. Конкретный протокол указано выше была оптимизирована для краткосрочных исследований (~ 10 дней). Имплантация точное количество клеток имеет решающее значение, так как большее количество клеток приведет к более быстрому росту опухоли и, возможно, потери животных из-за большого бремени опухоли. Использование MB49 200000 клеток для инстилляции может потребовать эвтаназии на 25% животных на 14 день из-за чрезмерного опухолевой нагрузки. По нашему опыту, мыши не пострадали от опухолевой нагрузки в течение 12 дней. В дополнение к стандартным критериям, как вялость, плохой уход, и / или потеря аппетита чрезмерного бремени опухоли в этой модели свидетельствует неспособность к мочеиспусканию.

Важным фактором для этого протокола является логистика. Во-первых, MB49 клетки растут rapidlу и Покрытие один миллион клеток за два дня до имплантации даст оптимальные культур в логарифмической фазе в день закапывания. Если количество животных, необходимых для эксперимента превышает количество животных, которые могут быть имплантированы в один день, MB49 культуры должны быть установлены соответствующим образом (на несколько дней), чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост культур. Во-вторых, пока техника не была усовершенствована, пользователи должны работать с небольшой группой животных. Опытные пользователи смогут имплантировать 6 групп по 5 мышей каждый в один день без помощника (1,5 ч / группы в том числе временами удержания). Тем не менее, изначально это полезно иметь помощника подготовить и подсчитать клетки для закапывания. Наконец, расположение оборудования имеет важное значение. В идеале кабинет биобезопасности и анестезия оборудование находятся в одной комнате.

Потенциальным ограничением является то, что анестезия оборудование имеет 5 nosecones, которые используются в режиме задержки времени. Если регулярно имплантировали большое количество мышей, себеVeral такие системы могут быть использованы параллельно. В теории, можно было бы использовать другие методы анестезии. Тем не менее, преимущество изофлурана ингаляционной анестезии является то, что время выдержки можно контролировать.

После того, как методика катетеризации освоено, этот протокол может быть применен к ряду экспериментальных условиях. Новые линии пузыря клеток рака или клетки, полученные из опухолей первичных мочевого пузыря могут быть оценены на предмет их способности расти ортотопически. Кроме того, можно имплантировать различные количества клеток, чтобы определить пороговую сумму, необходимую для взятия опухоли. Темпы роста опухоли также может быть установлено. Эти изменения могут быть особенно полезны, если сопоставлений между генетически модифицированных клеток, чтобы определить воздействие интересующего гена о создании опухоли или скорости роста. Для мониторинга адгезии, скорости роста, или взять опухоли, клетки могут быть трансфицировали репортерным геном люциферазы, таких как 6. Тем не менее, важным РассмотритеРацион является влияние гипоксии и некроза на биолюминесценции сигнала 29. Катетеризации также может быть использован для доставки терапевтического агента. Мы в настоящее время используют ортотопической модели для оценки стратегий доставки генов в обстановке в естественных условиях. Эта модель будет полезна для оптимизации доставки терапевтических средств и определить их влияние на регрессию опухоли и выживания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH R21 CA143505 Кристине Voelkel-Джонсон.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Name of reagent

Company

Catalog number

Comments

6-8 week old female mice

Jackson Laboratories

Strain Name: C57BL/6J

Stock Number: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Obtained through Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Obtained through Fisher

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 flasks*

Corning Costar

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Obtained through Fisher

MB49 cells

N/A

N/A

Obtained from Dr. Boehle (see reference11)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Obtained through Fisher

Depilatory cream: Veet

local pharmacy

Lubricant:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Obtained through Fisher

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

Obtained though hospital pharmacy

1 ml slip tip TB syringes

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use

Infectious agent that requires BSL2 containment

Steady-Glo Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Anesthesia system

E-Z Systems, Euthanex Corporation

Anesthesia system: EZ7000

5-port mouse rebreathing device: EZ109

Obtained through Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62, (1), 10-29 (2012).
  2. Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2, (12), 1008-1014 (2009).
  3. Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46, (11), 5507-5510 (1986).
  4. De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163, (6), 1999-2001 (2000).
  5. Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182, (2), 749-755 (2009).
  6. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, (1), 120-124 (2008).
  7. Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174, (3), 1115-1118 (2005).
  8. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10, (20), 6977-6984 (2004).
  9. Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9, (12), 4522-4528 (2003).
  10. Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7, (4), 159-166 (2002).
  11. Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167, (1), 357-363 (2002).
  12. Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, (12), 2834-2837 (1999).
  13. Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161, (5), 1702-1706 (1999).
  14. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
  15. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
  16. Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101, (3), 751-758 (2009).
  17. Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31, (1), 34-42 (2008).
  18. Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11, (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
  19. Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39, (4), 384-393 (2005).
  20. Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187, (6), 2228-2235 (2012).
  21. Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66, (12), 2121-2124 (2011).
  22. Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34, (2), 220-226 (2008).
  23. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  24. Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50, (7), 1111-1118 (2011).
  25. Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66, (5), 1116-1121 (2005).
  26. Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13, (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
  27. Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165, (2), 667-671 (2001).
  28. Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170, (3), 979-984 (2003).
  29. Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, (11), 1799-1804 (2010).
Ортотопическая Рак мочевого пузыря Модель для генной исследований Доставка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).More

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter