Summary
optogenetic技术已使人们有可能研究特定的神经元的行为的贡献。我们描述了一个激活单躯体感觉神经元表达channelrhodopsin变种（厨师）二极管泵浦固态（DPSS）激光器和记录引起的行为与一个高速摄像机的斑马鱼幼虫的方法。
Abstract
幼虫斑马鱼正在成为一个模型，用于描述简单的神经回路的发育和功能的。由于体外受精，快速发展，半透明，斑马鱼特别适合optogenetic方法来研究神经回路的功能。在这种方法中，光敏感的离子通道是在特定的神经元中表达，使实验者来激活或抑制它们的意愿，从而评估其贡献的特定行为。应用这些方法斑马鱼幼虫的概念很简单，但需要优化的技术细节。在这里，我们展示了一个程序，表达一个channelrhodopsin的变种在仔鱼斑马鱼的体感神经元，光活化的单个细胞，并记录产生的行为。引入了一些修改先前建立的方法，这种方法可以用来引发的行为反应，从单一的神经元激活到受精后至少4天（DPF）。具体来说，我们创建了一个转基因，用躯体感觉神经元增强，CREST3，推动标签channelrhodopsin变种，厨师tdTomato的表达。注射这种转基因成1 - 细胞期胚胎中的结果，在镶嵌在躯体感觉神经元中的表达，可以用激光共聚焦显微镜成像。照明确定在这些动物中的细胞从473 nm的DPSS激光器的光，引导通过光纤电缆，引出行为，可以用高速摄像机记录，并进行定量分析。这种技术可以适于研究行为引起通过激活任何斑马鱼神经元。与遗传或药物扰动的这种方法相结合，将是一个有力的方式来研究电路的形成和功能。
Introduction
促进或抑制神经细胞的兴奋与定义的波长的光的optogenetic方法的发展使我们能够研究不同人群的神经元的神经回路，控制行为，1，19，21的功能。这种技术通常被用于激活的神经元组，但它也可以被用来激活单个神经元的。斑马鱼幼虫，这些方法特别适合的，因为他们是半透明的，他们的神经系统迅速发展，并建立转基因动物是快速和常规。然而，重大的技术障碍必须克服，可靠地实现单神经元激活。
要优化程序optogenetic激活的单斑马鱼神经元，我们专注于躯体感觉神经元。斑马鱼幼虫检测各种体感刺激，使用两个群体神经元三叉神经元，支配头，及Rohon胡子（RB）的神经元，它支配身体的其他部位。每三叉和RB神经元投射的周轴突分支广泛在皮肤上，以检测的刺激和连接到下游的神经回路的中心轴突。动物早在21小时后受精（HPF）的响应触摸，表明已形成了相干的体感电路5星，18。幼体发育过程中至少有三叉神经和RB神经元突触上的Mauthner细胞激活经典的逃生反应，但越来越多的证据表明，有多种类型的体感神经元与不同的连接模式，可能引起变化的逃逸行为，4， 10，12，14，15，16，17。我们开发这种方法的动机是行为功能的不同类别的躯体感觉神经元的特征，但这种方法原则上可以用于研究的功能，几乎所有的神经元或神经元的LAR人口值斑马鱼。
道格拉斯等人以前描述了一种方法用于激活Channelrhodopsin-2表达的蓝色光的躯体感觉神经元，引出逃逸行为3。他们使用的方法ISL1基因的增强子元件驱动CHR 2-EYFP躯体感觉神经元中的表达。这种转基因，然而，据报道，以显示相对微弱的荧光，需要共同注射的第二记者，UAS :: GFP，允许细胞表达CHR 2-EYFP的可视化。这种方法被用来引出24-48斑马鱼的行为反应之间，但可能不会得到响应过去的72 HPF。因此，虽然此方法适用于研究神经回路在非常早期的幼体阶段（24-48 HPF），它是不足为特征的神经回路和行为反应幼虫，中老年时更是明显不同的行为反应和神经回路是比较成熟的。
我们试图该技术在提高灵敏度的特点幼虫RB神经元亚群的功能。为了提高表达，我们使用了一个特定的体感增强剂（CREST3）20驱动表达的LexA-VP16和LexA操纵的序列（4xLexAop）11拉伸，扩增的荧光标记的光激活的信道的表达。此配置扩增表达的通道，省去了用于共表达的第二记者和允许我们直接确定每个神经元中的信道的相对丰度。使用的LexA蛋白/ LexAop序列有额外的优点，允许我们引入转基因成斑马鱼记者使用GAL4/UAS系统的线。转基因瞬时表达，这造成了不同程度的表达，但通常是足够强大的可视化的单个神经元的胞体和轴突预测数天。为了优化灵敏度性点燃，我们使用的光激活通道厨师，channelrhodopsin的变体组成的一个嵌合体：channelopsin-1（Chop1）和channelopsin-2（Chop2），交叉点在螺旋环EF 13。此信道被激活为CHR 2在相同的波长，但需要较低的光强度进行激活，使得它比其他常用的途径，包括CHR 2更敏感。的厨师融合蛋白红色荧光蛋白，tdTomato，使我们能够筛选蛋白的表达没有激活的通道。作为光源，我们使用了一个二极管泵浦固态（DPSS）激光耦合到一个光纤电缆提供一个精确的，高功率的蓝色光脉冲到一个特定区域的幼虫。这使我们能够专注激光的单个神经元，省去了寻找罕见的转基因动物，在一个单一的神经元表达的通道。使用这种方法，我们能够激活单RB神经元，记录行为反应s的一个高速视频摄像机，和图像的激活的神经元，在高分辨率的激光共聚焦显微镜。
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Protocol
提前准备好以下。
1。准备光纤电缆
- 创建光缆的存储单元，用于通过熔融玻璃巴斯德吸管的锥形颈部超过本生灯创建一个〜150°的角度。
- 使用线切割或刀片，小心地剪光缆的成两部分。每一件作品都应该有一个结束与一个FC / PC适配器和一个露底。存储一块作为储备电缆。
- 向下剥去光缆到包层，除去纤维外套和加强纤维（ 图1A），从5.0厘米的电缆的切割端。
- 到预先准备的巴斯德吸管插入光缆。请确保电缆可以很容易地移入和移出的吸头。
- 光缆突出的巴斯德吸管尖，小心地剪切和删除光纤包层玻璃纤维周围，2毫米的切口端面。
- 使用金刚石笔/玻璃切割机，缺口的玻璃纤维和破晓FF到底要创造一个干净的切割/表面的纤维（ 图1B）。
- 收回光缆巴斯德吸管存储。如果光纤末端被碎裂或断裂不均匀，重复步骤（1.6）。
- 巴斯德吸移管的位置光缆在使用显微操作器（ 图1C）。
程序2-8描述用于注射一般适用于许多斑马鱼实验成胚的转基因的方法。这种方法的变化，所描述的其他视频朱庇特6，7，8，9，22也同样有效。
2。拔出注射针头
- 使用针拔出器，拉一个逐渐变细尖成两个注射针头与高硼硅玻璃管材。拔轮器设置会有所不同。 （在我们使用一个萨特仪器针拔出器设置：P = 500，热= 720，拉出= 50，速度= 70，时间= 150）。每针拔出器是不同的，所以优化车夫设置时间pirically。对于更多的锥形针，增加热量和/或拉。对于不锥形针，增加时间和/或减少拉。
- 将针在一个安全的容器（ 即培养皿中冷轧带，粘合面出）。
3。倒入注塑模具
- 熔体0.5 G琼脂糖在30毫升的胚胎/蓝水，直到琼脂糖完全溶解。
- 倒入一个陪替氏培养皿的下半部。
- 将安装井（ 图2）琼脂糖，小心地限制泡沫的形成孔周围的矩形模具。
- 让琼脂巩固。
- 取出模具，并填写蓝水/胚胎培养皿。
- 竖直存放，充满洁净的水，在室温下当天使用或在4°C，以备将来使用。
4。质粒DNA混合的注射
- 质粒DNA稀释为1:10酚红在DDH 2 O的浓度为50纳克/微升为例如：
1.0毫升 质粒DNA（250毫微克/毫升） 0.5毫升 酚红 3.5毫升 DDH 2 O - DNA混合物可在室温下保持，如果立即使用或储存在4℃下，数天。
5。对繁殖
这应该做的前一天晚上你打算做注射。
- 填写系统的水和雌雄鱼繁殖罐。如果注射不能尽快灯打开的设施，独立的男，女鱼分频器。
6。准备注射剂（可以做到，而等待的胚胎）
- 打开高压注射器台。确保系统设置为脉冲。开始PULSE DURATION设置为1。
- 打开空气阀和调整高压注射器〜20磅。
- 用解剖的范围内以最高的放大率，打破尖的针，用钳子或扑克创建1〜2微米的开口（ 图3，电影1）。
- 填写针与DNA组合：1。配售的针，针尖侧，到DNA结构，并通过毛细管作用或2针填写。使用长距离尖到中移液1〜2μl的DNA混合直接进针。
- 将已装好的针在一个安全的地方，直到准备好注入。
7。收集胚胎
- 设施后，灯已开启，删除分频器（如适用）。收集过滤器/小筛子的胚胎，并将它们传送到培养皿中，用新鲜的蓝/胚胎水。
8。 1-2细胞阶段的胚胎注入
- 将收获的胚胎用塑料吸管的注塑模具。
- 用解剖显微镜，轻轻一推胚胎成井钳或钝扑克（ 图4，电影2）。
- 将装载针到一个以上的胚胎显微操作位置。
- 校准注射量以1级为单位调节的脉冲持续时间，直到达到所需的音量（NL）。这可以用千分尺幻灯片校准，中所描述的前一的JOVE视频8，22，但用于本实验的精度是没有必要的，因为范围广泛的进样体积将导致足够的表达。
- 注1 NL DNA混合直接进入细胞，然后为所有的胚胎。 DNA也可以注入到蛋黄，但是这往往是低效率的（ 图5，电影3）。
- 使用温和的流蓝/胚胎水从模具中取出注射的胚胎。
- 商店在28.5°C注射的胚胎在黑暗中。
- 定期删除未受精的，受损或死亡的胚胎。
- 治疗胚胎无线网络日PTU 18-24 HPF之间，防止色素沉着。
9。屏幕转基因表达
- 手动dechorionate 24-48斑马鱼胚胎中使用产钳。
- 用0.02％三卡因麻醉幼虫。
- 使用荧光显微镜，确定幼虫的RB或三叉神经元表达，并将其传输到一个新的菜，新鲜的的PTU蓝色/胚胎水。胚胎与稀疏在容易识别细胞中的表达是最理想的，但个别神经元的激活与光纤电缆，以便有针对性地进行了广泛的表达强度是可以接受的。
- 商店胚胎在28.5°C在黑暗中，直到所需的试验阶段。
10。安装幼虫行为实验
- 1.5％的低熔化琼脂糖在DDH 2 O和存储在42°C加热块，以防止其凝固。
- 使用玻璃巴斯德吸管，转移成桶的预先筛选的幼虫之一e为1.5％的低熔化琼脂糖尽可能少的水尽可能蓝/胚胎。
- 转移到一个小培养皿下降的琼脂糖幼虫。
- 在解剖显微镜下，位置幼虫背起来。
- 当琼脂糖已经凝固，切断了琼脂糖用薄刀片（11刀），留下一块楔形的琼脂围绕整个幼虫。
- 的蛋黄两侧的两条对角线切割照顾缺口的幼虫。
- 填写周围的区域琼脂糖与胚胎/蓝水。
- 拉琼脂糖远离躯干和尾幼虫（ 图6）。
11。准备高速摄像机和成像软件
- 高速摄像机安装到夹层范围。
- 将相机连接到电脑上。
- 打开电脑。
- 开启高速摄像机。
- 打开视频/图像处理软件（我们使用的AOS成像软件，将描述在这里使用的程序，但其他影像学检查软件同样是可以接受的）。
- 调整相机设置（ 即 1000帧每秒（fps）的50％触发缓冲区或其他特别设置）。
- 开始记录。
12。激活单个神经元，用473 nm激光
- 附加刺激，激光和光纤电缆。
- 打开刺激。
- 设置刺激的和最多5伏特，脉冲持续时间为5毫秒。
- 根据制造商的说明，打开激光。
- 使用在解剖显微镜与的厨师tdTomato表达（ 图6）的神经元的细胞体的附近的光纤电缆的前端定位。
- 蓝色的光脉冲传递到激活感觉神经元。
- 使用高速摄像机记录“行为设置为500或1000帧每秒。
- 重复实验所需，等待1分钟之间，以避免习惯性的激活。 （我们每个神经元）录得最低的三个反应。
- 对释放的幼虫，撬除了琼脂糖镊子，小心不要伤害动物。这种动物可以允许进一步发展和可重复的过程，在一个旧的阶段的特点开发的行为。高分辨率共焦成像的关联的行为与蜂窝结构，如下面描述的激活细胞的胚胎也可以重新安装。
- 新鲜的蓝色水/胚胎，幼虫转移到培养板。我们使用24孔板的来跟踪个人幼虫。
13。用激光共聚焦显微镜图像神经元（S）
- 0.02％三卡因的麻醉幼虫。
- 安装幼虫，背了起来，在1.2％的低熔化琼脂糖或在背部模具。
- 图片厨师tdTomato神经元与543 nm激光和适当的过滤器和目标。我们用20倍的目标。
- 从琼脂糖凝胶中取出幼虫，并返回到个人与蓝/胚胎水。
- 商店在28.5°C在黑暗中富rther分析。
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Representative Results
图1。光缆成立。（A）层的光纤电缆。 （B）的剥离的光纤电缆在巴斯德吸管。 （C）的光纤电缆在巴斯德吸管定位使用显微操作。
图2。注塑模具的模板。
图3。 （电影1）。打破针。
图4。 （电影2）。名次到注塑模具中的胚胎。
ther.within页的“永远”> 
图5。 （动画3）。注射1 NL为1 -细胞期胚胎的DNA混合。
图6。图的安装斑马鱼幼虫和有代表性的神经元在幼虫触摸响应。斑马鱼幼虫的部分被安装在1.5％的低熔化琼脂糖（由虚线周围的吻侧段内的幼虫）。一个三叉神经的神经元（头）和Rohon胡子神经元（主干）被描述为红色。 Mauthner细胞概述由虚线中的幼虫。光缆（白色）所示定位在RB神经元细胞体。
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图7。 （剧场版4）激活一个单一的RB神经元expressingChEF引发的行为反应。（A）静止帧描绘激活一个单一的RB神经元表达厨师tdTomato。单个神经元的激活由一个5毫秒的脉冲从一个473纳米的蓝色激光， 通过一根直径为200μm的光纤电缆。电压驱动的蓝色激光被设置在最大为5伏。由此产生的行为被记录了在1000帧每秒的高速摄像头。 （B）共聚焦显微镜图像RB神经元激活。箭头所示区域刺激的行为剧照。 （C）（B）中所示的RB神经元的放大图像。比例尺，100微米。 （ 电影5和6）同样的鱼，（ 电影5）三叉神经激活，（ 电影 ）RB神经元超过蛋黄延伸。p_upload/50184/50184fig7large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图8。延迟的可变条件下的行为。对于大多数实验中，我们启动了一个单一的神经元〜35斑马鱼幼虫表达厨师tdTomato 5毫秒脉冲从473纳米的蓝色激光驱动的5 V电源（ 图6）。为了更好地了解厨师的动态激活，我们改变参数，以确定其行为的影响。 （A）光刺激的持续时间（5毫秒与10毫秒）并没有影响量化的光脉冲从开始时的延迟。 （B）〜35 HPF，的电压反向影响延迟。较低的电压导致的移动的延迟的增加。对于我们的实验中，我们使用的最大电压（5 V）PErmissible为我们的激光装置，从最明亮的表达RB神经元，引起了可靠的刻板行为。
图9所示。 （剧场版7）。 60斑马鱼幼虫表达激活的厨师tdTomato的RB神经元。（A）静止帧激活RB神经元表达厨师tdTomato 10毫秒的脉冲从473纳米的蓝色激光通过一根直径为200μm的光纤电缆的描述。由此产生的行为被记录了在1000帧每秒的高速摄像头。 （B）共聚焦显微镜图像RB神经元的活性（S）。箭头所示区域刺激的行为剧照。比例尺，100微米。
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图10。 （电影8）。 4 DPF幼虫表达激活的厨师tdTomato的RB神经元。静止帧激活RB神经元表达厨师tdTomato 20毫秒脉冲从473纳米的蓝色激光通过一根直径为200μm的光纤电缆的描述。由此产生的行为被记录在一个高速摄像机每秒1000帧。
动画1。 点击这里观看电影 。
电影2。 点击这里观看电影 。
电影（3） 点击这里观看电影 。
电影4。TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg“的目标=”_blank“>点击这里观看电影。
电影5。 点击这里观看电影 。
电影6。 点击这里观看电影 。
电影7。 点击这里观看电影 。
电影8。 点击这里观看电影 。
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Discussion
我们描述了一种单RB神经元在活的斑马鱼optogenetic激活。我们的方法采用了短暂的转基因表达的荧光标记的channelrhodopsin的变种，厨师tdTomato 13，在特定的躯体感觉神经元。这种方法可以很容易地适应用于其他幼虫斑马鱼的细胞群。
使用这种方法，我们一贯引起的行为反应，从34-48斑马鱼幼虫表达大厨tdTomato的。使用5毫秒的蓝色光脉冲，在5 V，我们能够激活单RB的神经元（ 图7）。定位的光纤在不同的点上的动物，我们发现，它是必要的，目的是蓝色的光，直接在细胞体引起的行为反应。没有引起光脉冲的响应幼虫不表达厨师。另外，光脉冲沿中心轴突或外围轴突从不引起的响应，电子法师在年轻幼虫（数据未示出）。此属性是有利的，因为我们可以自信地激活多个神经元标记的动物的单神经元，即使中央附近的目标神经元的细胞体（ 动画4-6）的其他神经元的轴突通过。
要测试的可靠性评估运动学参数的方法，我们确定了40和48小时，被称为是高度定型的参数的逃避反应（光激活的行为反应的时间）之间的延迟时间。光刺激的持续时间，以确定是否影响神经元的激活，我们照亮目标神经元为5年或10毫秒（ 图8A）。由于在两种情况下的行为的延迟相同的计算时，从一开始的光脉冲，我们得出结论，光脉冲的持续时间的延迟行为没有影响。然而，我们也发现，降低电压增加日Ë延迟的行为（ 图8B）。然而，许多在5 V，反应（16鱼）为20±5毫秒，自然难逃反应报告的等待时间。因此，激活神经元与5 V接近最大激活。
为有效地激活单RB神经元的变化，在旧的幼虫引发的行为反应的参数。我们成功地引起动物的行为反应4 DPF旧如旧，显着比以前报道。然而，在5毫秒的光脉冲在5 V单RB神经元激活一贯的行为反应前48小时，激活的幼虫（> 60 HPF）并不一致。较长的脉冲（10-100毫秒）的光往往要激活神经元在年龄较大幼虫（ 图9和10，电影7和8，分别）。因此，激活参数可能需要优化/校准，根据实验阶段。
我们在这里描述的方法可用于许多潜在的应用。我们使用的是这个方法来定义的行为反应引起的神经元的不同亚型的，但它也可以被用来表征行为反应的发展，作为动物的成熟，的效果的药物或对行为的突变体，或在生理学结合或影像学检查，确定神经元激活下游电路的特点。相反，抑制的信道，如halorhodopsin，可以使用抑制特定的神经元的神经网络内。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢福米久保带人，托德蒂勒和HerwigBaier的的（UCSF /马克斯普朗克研究所）的行为实验和DPSS激光器成立的建议;的Heesoo金正日和Chiara CERRI MBL神经生物学课程协助厨师tdTomato实验的，PetronellaKettunen（哥德堡大学）最初的合作optogenetic实验BaljitKhakh，埃里克·哈德森，迈克·巴卡和约翰·米利根（UCLA）的技术咨询和钱永健（UCSD）的厨师tdTomato的建设。这项工作得到了NRSA奖（5F31NS064817）AMSP和赠款来自美国国家科学基金会（RIG：0819010）AS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
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