Summary
Optogenetic तकनीक विशिष्ट न्यूरॉन्स के व्यवहार के लिए योगदान का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है. हम एकल somatosensory एक लेजर डायोड पंप ठोस राज्य (DPSS) के साथ एक channelrhodopsin variant (बावर्ची) को व्यक्त करने और एक वीडियो कैमरा के साथ उच्च गति हासिल व्यवहार रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए लार्वा zebrafish में एक विधि का वर्णन है.
Abstract
लारवल zebrafish और सरल तंत्रिका सर्किट के विकास कार्य का वर्णन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभर रहे हैं. उनके बाह्य निषेचन, तेजी से विकास, और translucency कारण, zebrafish optogenetic दृष्टिकोण के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं तंत्रिका सर्किट समारोह की जांच की. इस दृष्टिकोण में, प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनल विशिष्ट न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं, को सक्रिय करने के लिए या करेंगे पर उन्हें रोकना और इस प्रकार विशिष्ट व्यवहार के लिए उनके योगदान का आकलन experimenter सक्षम. लार्वा zebrafish में इन तरीकों को लागू धारणात्मक आसान है, लेकिन तकनीकी जानकारी के अनुकूलन की आवश्यकता है. यहाँ हम लार्वा zebrafish somatosensory न्यूरॉन्स तस्वीर को सक्रिय एकल कोशिकाओं में एक channelrhodopsin संस्करण व्यक्त और जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन के लिए एक प्रक्रिया है. पहले से स्थापित तरीकों के लिए कुछ संशोधनों को शुरू करके, इस दृष्टिकोण के लिए एक सक्रिय न्यूरॉन्स से व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकम से कम 4 दिन बाद निषेचन (DPF). विशेष रूप से, हम एक somatosensory न्यूरॉन बढ़ाने, CREST3, का उपयोग करने के लिए टैग channelrhodopsin variant, महाराज tdTomato के अभिव्यक्ति ड्राइव transgene बनाया. Somatosensory न्यूरॉन्स में मोज़ेक अभिव्यक्ति है, जो confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है में एक कोशिका चरण भ्रूण परिणामों में इस transgene इंजेक्शन. रोशन इन जानवरों में एक 473 एनएम DPSS लेजर से प्रकाश के साथ कोशिकाओं, की पहचान एक फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से निर्देशित, व्यवहार है कि उच्च गति एक वीडियो कैमरे के साथ दर्ज किया जा सकता है और मात्रात्मक विश्लेषण किया elicits. इस तकनीक अध्ययन किसी भी zebrafish न्यूरॉन सक्रिय द्वारा हासिल व्यवहार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. आनुवंशिक या औषधीय perturbations के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन सर्किट गठन और समारोह की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका होगा.
Introduction
को बढ़ावा देने या प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के साथ परिभाषित बाधा neuronal excitability के लिए optogenetic तरीकों के विकास तंत्रिका सर्किट व्यवहार 1, 19, 21 को नियंत्रित करने में न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी के समारोह का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है. न्यूरॉन्स के समूहों को सक्रिय करने के लिए इस तकनीक को कई बार प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी व्यक्तिगत न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Zebrafish लार्वा विशेष रूप से इन तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं क्योंकि वे पारदर्शी हैं, उनके तंत्रिका तंत्र तेजी से विकसित करता है, और ट्रांसजेनिक जानवर बनाने के तेजी से और नियमित है. बहरहाल, महत्वपूर्ण तकनीकी बाधाओं के लिए मज़बूती से न्यूरॉन सक्रियण को प्राप्त करने के लिए दूर किया जाना चाहिए.
एकल zebrafish न्यूरॉन्स की optogenetic सक्रियण के लिए एक प्रक्रिया का अनुकूलन, हम somatosensory न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया. त्रिपृष्ठी न्यूरॉन्स, जो सिर अंदर आना और Rohon दाढ़ी (: Zebrafish लार्वा somatosensory न्यूरॉन्स की दो आबादी का उपयोग उत्तेजनाओं की एक किस्म का पता लगानेआरबी) न्यूरॉन्स, जो शरीर के बाकी अंदर आना. प्रत्येक त्रिपृष्ठी और आरबी न्यूरॉन एक परिधीय अक्षतंतु कि त्वचा में बड़े पैमाने पर शाखाओं उत्तेजनाओं का पता लगाने के लिए और एक केंद्रीय अक्षतंतु है कि नीचे की ओर तंत्रिका सर्किट को जोड़ता परियोजनाओं. पशु के रूप में जल्दी के 21 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के रूप में स्पर्श का जवाब है, यह दर्शाता है कि सुसंगत somatosensory सर्किट 5 का गठन किया है, 18. लार्वा के विकास के दौरान कम से कम कुछ त्रिपृष्ठी और आरबी Mauthner सेल पर न्यूरॉन्स synapse क्लासिक भागने प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए, लेकिन जमते सबूत से पता चलता है कि वहाँ कनेक्टिविटी के विभिन्न पैटर्न है कि 2 भागने व्यवहार, 4 पर बदलाव बटोर सकता है के साथ somatosensory न्यूरॉन्स के कई वर्गों हैं, 10, 12, 14, 15, 16, 17. इस पद्धति के विकास के लिए हमारी प्रेरणा somatosensory न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों के व्यवहार समारोह को चिह्नित किया गया था, लेकिन इस दृष्टिकोण सिद्धांत रूप में लगभग किसी भी या lar में न्यूरॉन्स की न्यूरॉन आबादी के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैवैल zebrafish.
डगलस एट अल. पहले सक्रिय करने के लिए एक विधि का वर्णन Channelrhodopsin-2-व्यक्त नीले प्रकाश के साथ somatosensory न्यूरॉन्स, eliciting भागने व्यवहार 3. उनके दृष्टिकोण isl1 जीन से इस्तेमाल करने के लिए एक बढ़ाने तत्व somatosensory न्यूरॉन्स में ChR2 EYFP की अभिव्यक्ति ड्राइव. इस transgene, तथापि, अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए, एक दूसरे पत्रकार के सह इंजेक्शन की आवश्यकता के लिए सूचित किया गया था, :: यूएएस GFP, ChR2 EYFP व्यक्त कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देने के लिए. इस दृष्टिकोण के लिए 24-48 HPF के बीच व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन 72 HPF पिछले एक प्रतिक्रिया बटोर कभी नहीं हो सकता. इस प्रकार, जबकि इस विधि बहुत जल्दी लार्वा चरणों (24-48 HPF) में तंत्रिका circuitry का अध्ययन करने के लिए काम करता है, यह बड़े लार्वा, जब अधिक विविध व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्पष्ट कर रहे हैं और तंत्रिका सर्किट अधिक परिपक्व हैं में तंत्रिका सर्किट और व्यवहार प्रतिक्रियाओं निस्र्पक के लिए अपर्याप्त है.
हम करने की मांगइस तकनीक की संवेदनशीलता में सुधार के क्रम में लार्वा आरबी न्यूरॉन्स की subpopulations के समारोह विशेषताएँ. करने के लिए अभिव्यक्ति में सुधार के लिए हम एक somatosensory विशिष्ट (CREST3) बढ़ाने 20 Lexa-VP16 की अभिव्यक्ति और Lexa ऑपरेटर (4xLexAop) दृश्यों 11 के एक खंड को ड्राइव करने के लिए एक fluorescently टैग प्रकाश सक्रिय चैनल की अभिव्यक्ति बढ़ाना. यह विन्यास चैनल की अभिव्यक्ति प्रवर्धित, एक दूसरे पत्रकार सह व्यक्त और हमें सीधे प्रत्येक न्यूरॉन में चैनल के रिश्तेदार बहुतायत निर्धारित की अनुमति के लिए नष्ट करने की जरूरत है. Lexa / LexAop अनुक्रम का उपयोग हमें zebrafish संवाददाता लाइनों कि Gal4/UAS प्रणाली का उपयोग करने में transgene शुरू करने के लिए अनुमति के अतिरिक्त लाभ था. Transgene की क्षणिक अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति के स्तर बदलती में हुई है, लेकिन आम तौर पर काफी मजबूत करने के लिए कई दिनों से अधिक दोनों सेल शरीर और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के axonal अनुमानों कल्पना था. Sensitiv का अनुकूलनप्रकाश अल्पसंख्यक हम चैनल महाराज, एक channelrhodopsin variant हेलिक्स पाश एफई 13 में एक विदेशी साइट के साथ एक (Chop1) channelopsin-1 और channelopsin 2 (Chop2) की कल्पना से मिलकर सक्रिय प्रकाश का इस्तेमाल किया. इस चैनल ChR2 के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य में सक्रिय है, लेकिन कम सक्रियण के लिए प्रकाश की तीव्रता की आवश्यकता है, इसे और अधिक ChR2 सहित अन्य चैनलों आमतौर पर इस्तेमाल किया है, की तुलना में अधिक संवेदनशील बनाने के. महाराज प्रोटीन लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, tdTomato से इनकार किया गया था, हमें प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए चैनल को सक्रिय करने के बिना स्क्रीन करने के लिए सक्षम है. एक प्रकाश स्रोत के रूप में, हम एक ठोस राज्य (DPSS) एक फाइबर ऑप्टिक केबल लार्वा के एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए एक सटीक, नीले प्रकाश की उच्च स्तरीय पल्स देने के लिए मिलकर लेजर डायोड पंप. यह हमारे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स पर लेजर प्रकाश ध्यान केंद्रित करने, दुर्लभ ट्रांसजेनिक एक न्यूरॉन में चैनल व्यक्त जानवरों को खोजने के लिए नष्ट करने की जरूरत है की अनुमति दी. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम करने के लिए एकल आरबी न्यूरॉन्स सक्रिय करते हैं, व्यवहार प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड करने में सक्षम थेएक उच्च गति वीडियो कैमरा, और छवि confocal माइक्रोस्कोपी के साथ उच्च संकल्प में सक्रिय न्यूरॉन्स के साथ है.
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Protocol
समय के आगे निम्नलिखित तैयार करो.
1. ऑप्टिक केबल तैयार
- एक लैम्प बर्नर पर एक गिलास पाश्चर विंदुक के पतला गर्दन पिघलने एक ~ 150 डिग्री कोण बनाने ऑप्टिक केबल के लिए एक भंडारण इकाई बनाएँ.
- एक तार कटर या एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, ध्यान से दो टुकड़ों में ऑप्टिक केबल काट. प्रत्येक टुकड़ा / एफसी पीसी अनुकूलक और एक उजागर अंत के साथ एक अंत होना चाहिए. स्टोर एक आरक्षित केबल के रूप में एक टुकड़ा.
- ऑप्टिक केबल पट्टी नीचे 5.0 केबल के कट अंत के सेमी से फाइबर जैकेट और मजबूत बनाने फाइबर (चित्रा 1 ए) को हटाने के द्वारा cladding.
- तैयार पाश्चर विंदुक में ऑप्टिक केबल डालें. यकीन है कि केबल आसानी विंदुक टिप के अंदर और बाहर स्थानांतरित कर सकते हैं.
- ऑप्टिक केबल पाश्चर विंदुक टिप से फैला हुआ है, ध्यान से कटौती और फाइबर ग्लास के आसपास से फाइबर cladding हटाने के साथ, ~ काट अंत से 2 मिमी.
- एक हीरे कटर / कलम कांच का उपयोग, निक और तोड़ फाइबर ग्लास ओएफएफ अंत करने के लिए एक साफ / फाइबर (चित्रा 1 बी) के अंत में कटौती की सतह बनाने के लिए.
- पाश्चर विंदुक में भंडारण के लिए ऑप्टिक केबल करवाया. अगर फाइबर ऑप्टिक की नोक chipped हो जाता है या टूट जाता है unevenly दोहराएँ कदम (1.6).
- स्थिति पाश्चर विंदुक में ऑप्टिक केबल एक micromanipulator (चित्रा 1C) का उपयोग कर.
प्रक्रियाएं 2-8 आम तौर पर कई zebrafish प्रयोगों के लिए लागू भ्रूणों में transgenes इंजेक्शन लगाने के लिए एक विधि का वर्णन है. इस पद्धति पर अन्य जौव वीडियो 6, 7, 8, 9 में वर्णित उन लोगों की तरह बदलाव, 22 समान रूप से प्रभावी हैं.
2. इंजेक्शन सुई खींचो
- एक सुई डांड़ी का प्रयोग, एक धीरे - धीरे पतला टिप के साथ दो इंजेक्शन सुइयों में borosilicate ग्लास टयूबिंग खींच. डांड़ी सेटिंग्स अलग अलग होंगे. (Sutter उपकरण सुई डांड़ी हम सेटिंग्स का उपयोग करें: पी = 500 हीट, = 720, = 50 वेग, खींचो = 70 और समय = 150). हर सुई डांड़ी अलग है, तो डांड़ी सेटिंग्स उन्हें का अनुकूलनpirically. अधिक पतला सुइयों के लिए, गर्मी और / बढ़ाने या खींचो. कम पतली सुई के लिए समय और / या कमी खींचो वृद्धि हुई है.
- एक सुरक्षित कंटेनर में स्टोर सुइयों (यानी लुढ़का टेप के साथ एक पेट्री डिश, चिपकने वाला पक्ष बाहर).
3. इंजेक्शन Molds डालो
- 30 मिलीलीटर भ्रूण / नीले पानी में 0.5 छ agarose पिगलो, जब तक agarose पूरी तरह भंग हो गया है.
- एक पेट्री डिश के नीचे आधा में डालो.
- Agarose में कुओं (2 चित्रा) बढ़ते, कुओं के आसपास बुलबुला गठन को सीमित करने के लिए सावधान किया जा रहा है साथ आयताकार मोल्ड रखें.
- Agarose कठियाना करने की अनुमति दें.
- मोल्ड निकालें और नीले / भ्रूण पानी के साथ पेट्री डिश को भरने.
- ईमानदार स्टोर, उसी दिन का उपयोग करने के लिए कमरे में अस्थायी या 4 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए साफ पानी से भरा है.
4. प्लास्मिड डीएनए मिक्स इंजेक्शन के लिए
- 50 एनजी / μl के DDH 2 ओ में 1:10 phenol लाल के साथ एक एकाग्रता प्लास्मिड डीएनए पतला के लिएउदाहरण:
1.0 मिलीलीटर प्लास्मिड डीएनए (250 एनजी / एमएल) 0.5 मिलीलीटर phenol लाल 3.5 मिलीग्राम DDH 2 हे - डीएनए मिश्रण कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है अगर तुरंत का उपयोग या कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
5. संभोग जोड़े सेट
इस शाम को किया जाना चाहिए इससे पहले कि आप को इंजेक्शन करने की योजना है.
- प्रणाली पानी और जगह पुरुष और महिला मछली के साथ प्रजनन टैंक के साथ भरें. यदि इंजेक्शन के रूप में जल्द ही नहीं किया प्रदर्शन के रूप में रोशनी सुविधा पर बारी, एक विभक्त के साथ पुरुष और महिला अलग अलग मछली कर सकते हैं.
6. इंजेक्शन के लिए तैयार (जबकि भ्रूण के लिए इंतजार किया जा सकता है)
- दबाव सुई लगानेवाला रिग पर मुड़ें. सुनिश्चित करें कि प्रणाली के लिए नाड़ी के लिए सेट कर दिया जाता है. स्पंद अवधि 1 करने के लिए सेट के साथ शुरू करो.
- एयर वाल्व पर मुड़ें और~ 20 साई सुई लगानेवाला दबाव को समायोजित.
- उच्चतम बढ़ाई विदारक गुंजाइश का उपयोग, संदंश या एक ~ 2 सुक्ष्ममापी खोलने (3 चित्रा, मूवी 1) बनाने के लिए एक पोकर के साथ सुई की नोक को तोड़ने.
- डीएनए मिश्रण के साथ सुई द्वारा भरें: 1. सुई, टिप पक्ष रखने, डीएनए मिश्रण में और दे सुई केशिका क्रिया या 2 से भरना. एक टिप लंबे समय तक पहुँचने का उपयोग करने के लिए डीएनए के 1-2 μl विंदुक में सीधे सुई मिश्रण.
- एक सुरक्षित जगह रखें में इंजेक्षन तैयार तक सुई भर दिया.
7. भ्रूण लीजिए
- सुविधा के बाद रोशनी पर बदल गया है, डिवाइडर (यदि लागू हो) को हटा दें. एक झरनी / छोटे चलनी के साथ भ्रूण ले लीजिए और उन्हें ताजा नीले / भ्रूण के पानी के साथ एक पेट्री डिश हस्तांतरण.
8. 1-2 सेल स्टेज पर भ्रूण इंजेक्षन
- इंजेक्शन एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर molds काटा भ्रूण स्थानांतरण.
- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, धीरे में भ्रूण धक्कासंदंश या एक कुंद पोकर के साथ कुओं (4 चित्रा, 2 मूवी).
- एक और भ्रूण में micromanipulator स्थिति में भरी हुई सुई रखें.
- जांचना से 1 कदम वेतन वृद्धि में स्पंद अवधि को समायोजित जब तक आप इच्छित मात्रा (~ 1 nl) हासिल इंजेक्शन की मात्रा. यह एक सुक्ष्ममापी स्लाइड के साथ calibrated किया जा सकता है, के रूप में पिछले एक जौव वीडियो 8, 22 में वर्णित है, लेकिन इस प्रयोग परिशुद्धता के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि इंजेक्शन संस्करणों की एक विस्तृत श्रृंखला के पर्याप्त अभिव्यक्ति में परिणाम देगा.
- ~ इंजेक्षन 1 nl डीएनए और सभी भ्रूण के लिए सेल दोहराने में सीधे मिश्रण. डीएनए भी जर्दी में इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन यह कम कुशल हो जाता है (5 चित्रा, मूवी 3).
- मोल्ड का उपयोग कर / नीले भ्रूण पानी की एक सौम्य धारा से इंजेक्शन भ्रूण निकालें.
- स्टोर 28.5 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में भ्रूण इंजेक्शन.
- Unfertilized, क्षतिग्रस्त या मृत भ्रूण को समय - समय पर निकालें.
- भ्रूण वाई का इलाज18-24 HPF के बीच वें PTU pigmentation को रोकने के.
9. Transgene अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन
- मैन्युअल रूप dechorionate 24-48 HPF भ्रूण संदंश का उपयोग कर.
- 0.02% का उपयोग tricaine लार्वा anesthetize.
- एक फ्लोरोसेंट विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, आरबी या trigeminal न्यूरॉन अभिव्यक्ति के साथ लार्वा की पहचान करने और एक नया पकवान ताजा PTU पानी नीले / भ्रूण के साथ इन हस्तांतरण. आसानी से पहचाना कोशिकाओं में विरल अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण इष्टतम हैं, लेकिन व्यक्तिगत न्यूरॉन्स एक फाइबर ऑप्टिक केबल के साथ सक्रियता के लिए लक्षित किया जाएगा तो अभिव्यक्ति घनत्व की एक विस्तृत श्रृंखला स्वीकार्य है.
- स्टोर भ्रूण 28.5 डिग्री सी अंधेरे में वांछित प्रयोगात्मक स्तर तक.
10. व्यवहार प्रयोगों के लिए लार्वा माउंट
- DDH 2 हे और 42 डिग्री सेल्सियस गर्मी solidifying से रोकने के ब्लॉक में दुकान में 1.5% कम पिघल agarose.
- एक टब में एक गिलास पाश्चर विंदुक, स्थानांतरण एक लार्वा पूर्व जांच के उपयोगजितना संभव हो कम पानी नीले / भ्रूण के साथ 1.5% कम पिघल agarose ए.
- एक छोटे पेट्री डिश पर agarose की एक बूंद में लार्वा स्थानांतरण.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, स्थिति लार्वा पृष्ठीय ऊपर.
- जब agarose जम गया है, एक पतली धार (# 11 स्केलपेल) के साथ दूर agarose कटौती, पूरे लार्वा के आसपास अगर एक कील छोड़ने.
- जर्दी में किसी भी पक्ष में दो विकर्ण कटौती, देखभाल निक लार्वा नहीं ले.
- Agarose भ्रूण / नीले पानी के साथ आसपास के क्षेत्र में भरें.
- Agarose ट्रंक और लार्वा की पूंछ (6 चित्रा) से दूर खींचो.
11. उच्च गति कैमरा और इमेजिंग सॉफ्टवेयर तैयार
- विदारक गुंजाइश पर उच्च गति कैमरा माउंट.
- कंप्यूटर के लिए कैमरा कनेक्ट.
- कंप्यूटर पर मुड़ें.
- उच्च गति कैमरा पर मुड़ें.
- खुला / वीडियो और इमेजिंग सॉफ्टवेयर (हम AOS इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और यह यहाँ का उपयोग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करेंगे, लेकिन अन्य इमेजिंगसॉफ्टवेयर समान रूप से स्वीकार्य है).
- कैमरा सेटिंग्स तदनुसार (यानी 1000 फ्रेम प्रति सेकंड (fps), 50% ट्रिगर बफर या अन्य पसंदीदा सेटिंग्स) को समायोजित करें.
- रिकॉर्डिंग शुरू.
12. एक एक 473 एनएम लेजर का उपयोग न्यूरॉन्स सक्रिय
- उत्तेजक औधधि लेजर, और ऑप्टिक केबल संलग्न.
- उत्तेजक औधधि पर मुड़ें.
- 5 वोल्ट की एक अधिकतम और 5 मिसे के स्पंद अवधि के लिए उत्तेजक औधधि सेट.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेजर पर मुड़ें.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए महाराज tdTomato अभिव्यक्ति (6 चित्रा) के साथ एक न्यूरॉन सेल शरीर के पास ऑप्टिक केबल की नोक की स्थिति है.
- नीले प्रकाश की नब्ज उद्धार संवेदी न्यूरॉन को सक्रिय करने के लिए.
- रिकॉर्ड व्यवहार का उपयोग कर एक उच्च गति कैमरा प्रति सेकंड 500 या 1,000 तख्ते पर निर्धारित किया है.
- प्रयोग के रूप में वांछित दोहराएँ, प्रत्येक habituation से बचने सक्रियण के बीच 1 मिनट इंतज़ार कर रही है. (हम प्रत्येक न्यूरॉन के लिए तीन प्रतिक्रियाओं का एक न्यूनतम रिकॉर्ड).
- सेरिहाई लार्वा, संदंश के साथ अलग agarose ताक - झाँक करना, देखभाल करने के लिए पशु घायल नहीं. इस जानवर को और विकसित करने के लिए अनुमति दी जा सकती है और प्रक्रिया के एक बड़े मंच पर दोहराया जा सकता है व्यवहार के विकास विशेषताएँ. भ्रूण भी उच्च संकल्प सक्रिय सेल confocal इमेजिंग सेलुलर संरचना के साथ व्यवहार सहसंबंधी, के रूप में नीचे वर्णित के लिए remounted जा सकता है.
- ताजा नीले / भ्रूण के पानी के साथ संस्कृति की थाली लार्वा स्थानांतरण. हम एक 24-अच्छी तरह से थाली का उपयोग व्यक्तिगत लार्वा का ट्रैक रखने के लिए.
13. छवि एक confocal खुर्दबीन के साथ न्यूरॉन (ओं)
- 0.02% tricaine साथ लार्वा anesthetize.
- माउंट लार्वा, 1.2% कम पिघल agarose में या एक पृष्ठीय मोल्ड में पृष्ठीय पक्ष.
- एक 543 एनएम लेजर और उपयुक्त फिल्टर और उद्देश्य के साथ छवि महाराज tdTomato न्यूरॉन्स. हम एक 20x उद्देश्य का उपयोग करें.
- Agarose से लार्वा निकालें और व्यक्ति के लिए नीले रंग / पानी भ्रूण के साथ अच्छी तरह से वापस.
- 28.5 पर स्टोर ° सी फू के लिए अंधेरे मेंrther विश्लेषण.
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Representative Results
चित्रा 1. ऑप्टिक केबल सेट (ए) एक फाइबर ऑप्टिक केबल की परतें. (बी) एक पाश्चर विंदुक में छीन फाइबर ऑप्टिक केबल. (सी) पाश्चर विंदुक में फाइबर ऑप्टिक केबल एक micromanipulator का उपयोग में तैनात है.
चित्रा 2. इंजेक्शन मोल्ड टेम्पलेट.
चित्रा 3. (1 मूवी). सुई तोड़कर.
चित्रा 4. (2 मूवी). इंजेक्शन मोल्ड में भ्रूण रखकर.
ther.within पृष्ठ> = "हमेशा" 
चित्रा 5. (3 मूवी). 1 कोशिका चरण भ्रूण में 1 nl डीएनए मिश्रण इंजेक्शन.
6 चित्रा. एक घुड़सवार zebrafish लार्वा और प्रतिनिधि लार्वा स्पर्श प्रतिक्रिया में शामिल न्यूरॉन्स का आरेख Zebrafish लार्वा आंशिक रूप से 1.5% कम पिघल agarose (धराशायी लाइनों लार्वा के व्याख्यान चबूतरे वाला भाग आसपास द्वारा प्रतिनिधित्व) में रखा गया है. एक त्रिपृष्ठी (सिर में) न्यूरॉन और एक न्यूरॉन Rohon दाढ़ी (ट्रंक में) लाल रंग में चित्रित कर रहे हैं. Mauthner कोशिकाओं लार्वा में धराशायी लाइनों द्वारा उल्लिखित हैं. ऑप्टिक केबल (सफेद) दिखाया गया है आरबी न्यूरॉन सेल शरीर पर तैनात है.
oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" 7 चित्रा "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg / ">
चित्रा 7. (4 मूवी) एक एकल आरबी न्यूरॉन expressingChEF के सक्रियकरण एक व्यवहार प्रतिक्रिया elicits. (ए) अभी भी फ्रेम एक एकल आरबी महाराज tdTomato व्यक्त न्यूरॉन के सक्रियण चित्रण. एकल न्यूरॉन्स एक 473 एनएम नीले लेजर से एक 5 मिसे नाड़ी द्वारा एक 200 सुक्ष्ममापी फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से सक्रिय थे. नीले लेजर ड्राइविंग वोल्टेज 5 वोल्ट की एक अधिकतम पर स्थापित किया गया था. परिणामस्वरूप व्यवहार 1000 फ्रेम प्रति सेकंड पर एक उच्च गति कैमरा द्वारा दर्ज की गई थी. (बी) Confocal माइक्रोस्कोपी सक्रिय आरबी न्यूरॉन छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था. तीर से पता चलता है कि क्षेत्र व्यवहार चित्र में प्रेरित. (सी) आरबी न्यूरॉन के Magnified छवि (बी) में संकेत दिया. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी. (5 मूवी और 6) एक ही मछली, (5 मूवी) trigeminal सक्रियण, जर्दी विस्तार पर (6 मूवी) आरबी न्यूरॉन.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 8. चर शर्तों के तहत व्यवहार के लेटेंसी ज्यादातर प्रयोगों के लिए हम ~ 35 HPF एक 5 मिसे नाड़ी के साथ एक 473 एनएम नीले एक 5 वी शक्ति के स्रोत (6 चित्रा) द्वारा संचालित लेजर से शेफ tdTomato व्यक्त लार्वा में एक न्यूरॉन सक्रिय. बेहतर महाराज सक्रियण की गतिशीलता को समझने के लिए, हम विभिन्न मापदंडों व्यवहार पर उनके प्रभाव को निर्धारित करने के लिए. (ए) प्रकाश उत्तेजना की अवधि (5 मिसे बनाम 10 मिसे) विलंबता को प्रभावित नहीं जब प्रकाश नाड़ी की शुरुआत से मात्रा निर्धारित था. (बी) ~ 35 HPF, वोल्टेज inversely विलंबता को प्रभावित करता है. कम voltages आंदोलन की विलंबता में एक वृद्धि के परिणामस्वरूप. अपने प्रयोगों के लिए, हम अधिकतम वोल्टेज पे (5 वी) का इस्तेमाल किया हैहमारे लेजर उपकरण है, जो सबसे चमकते व्यक्त आरबी न्यूरॉन्स से मज़बूती से टकसाली व्यवहार हासिल के लिए rmissible.
9 चित्रा. (7 मूवी). 60 HPF लार्वा में शेफ tdTomato के सक्रियकरण आरबी न्यूरॉन्स व्यक्त (ए) अभी भी RB एक 473 एनएम नीले लेजर से एक 10 मिसे नाड़ी द्वारा एक 200 सुक्ष्ममापी फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से महाराज tdTomato न्यूरॉन्स व्यक्त की सक्रियता चित्रण फ्रेम. परिणामस्वरूप व्यवहार 1000 फ्रेम प्रति सेकंड पर एक उच्च गति कैमरा द्वारा दर्ज की गई थी. (बी) Confocal माइक्रोस्कोपी सक्रिय आरबी न्यूरॉन (ओं) की छवि के लिए इस्तेमाल किया गया था. तीर से पता चलता है कि क्षेत्र व्यवहार चित्र में प्रेरित. स्केल बार, 100 सुक्ष्ममापी.
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10 चित्रा. (8 मूवी). सक्रियकरण शेफ tdTomato के 4 DPF लार्वा में आरबी न्यूरॉन्स व्यक्त अभी भी आरबी एक 473 एनएम नीले लेजर से एक 20 मिसे नाड़ी द्वारा एक 200 सुक्ष्ममापी फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से महाराज tdTomato न्यूरॉन्स व्यक्त की सक्रियता चित्रण फ्रेम. परिणामस्वरूप व्यवहार 1000 फ्रेम प्रति सेकंड पर एक उच्च गति कैमरा के साथ दर्ज की गई थी.
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Discussion
हम रहते zebrafish में एक आरबी न्यूरॉन्स की optogenetic सक्रियण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया है. हमारे विधि क्षणिक transgenesis विशिष्ट somatosensory न्यूरॉन्स में एक fluorescently टैग channelrhodopsin संस्करण 13 महाराज tdTomato व्यक्त कार्यरत हैं. इस दृष्टिकोण को आसानी से अन्य लार्वा zebrafish सेल आबादी में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस दृष्टिकोण का उपयोग हम लगातार 34-48 HPF महाराज tdTomato व्यक्त लार्वा से व्यवहार प्रतिक्रियाओं हासिल. 5 वी में नीले प्रकाश की एक 5 मिसे नाड़ी का उपयोग करना, हम एकल आरबी न्यूरॉन्स (7 चित्रा) को सक्रिय करने में सक्षम थे. पशु के साथ विभिन्न बिंदुओं पर ऑप्टिक फाइबर स्थिति से, हमने पाया है कि यह जरूरी हो गया था नीले प्रकाश सीधे एक सेल शरीर में एक व्यवहार प्रतिक्रिया बटोर उद्देश्य. प्रकाश दालों लार्वा कि महाराज व्यक्त नहीं किया से एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं था. इसके अलावा, केंद्रीय अक्षतंतु या परिधीय अक्षतंतु साथ प्रकाश दालों elicited, एक प्रतिक्रिया नहीं ईयुवा लार्वा (नहीं दिखाया डेटा) में उपक्रम. यह संपत्ति फायदेमंद था क्योंकि हम विश्वास जानवरों जिसमें कई न्यूरॉन्स थे लेबल में एकल न्यूरॉन्स सक्रिय कर सकता है, भले ही अन्य न्यूरॉन्स के केंद्रीय axons लक्षित न्यूरॉन सेल शरीर पास (4-6 मूवी) पारित कर दिया.
कीनेमेटीक्स मापदंडों का आकलन करने के लिए दृष्टिकोण की विश्वसनीयता का परीक्षण करने के लिए, हम 40 और 48 HPF, एक पैरामीटर है कि अत्यधिक टकसाली होने के लिए जाना जाता है के बीच भागने की प्रतिक्रिया (प्रकाश सक्रियण से व्यवहार प्रतिक्रिया समय) के विलंबता निर्धारित की. यह निर्धारित करने के लिए कि अगर प्रकाश प्रोत्साहन की अवधि न्यूरॉन सक्रियण को प्रभावित करती है, हम 5 या 10 मिसे (चित्रा 8A) के लिए लक्ष्य न्यूरॉन्स प्रबुद्ध. के बाद से ही दोनों स्थितियों में व्यवहार विलंबता जब प्रकाश नाड़ी की शुरुआत से गणना थे, हम निष्कर्ष निकाला है कि प्रकाश नाड़ी की अवधि व्यवहार के विलंबता प्रभावित नहीं किया था. हालांकि, हमें पता था कि कम वोल्टेज वें वृद्धि हुईएक व्यवहार के ई विलंबता (चित्रा 8B). 5 वी से कम है, लेकिन कई प्रतिक्रियाएं (16 मछली के बाहर 9) 20 थे ± 5 मिसे, प्राकृतिक बच प्रतिक्रिया के लिए रिपोर्ट विलंबता के समान. इस प्रकार, 5 वी के साथ न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए अधिक से अधिक सक्रियण दृष्टिकोण.
प्रभावी ढंग से एकल आरबी पुराने लार्वा में विविध न्यूरॉन्स सक्रिय करने से व्यवहार प्रतिक्रिया eliciting के लिए पैरामीटर. हम सफलतापूर्वक जानवरों से 4 DPF के रूप में पुराने के रूप में व्यवहार प्रतिक्रियाओं हासिल काफी बाद में पहले की तुलना में सूचना मिली थी. हालांकि, जबकि 5 वी में 5 मिसे प्रकाश नाड़ी के साथ एक आरबी न्यूरॉन्स की सक्रियता लगातार एक व्यवहार प्रतिक्रिया में हुई पहले 48 HPF पुराने लार्वा (> 60 HPF) की सक्रियता के रूप में संगत नहीं था. अब प्रकाश की दालों (10-100 मिसे) अक्सर पुराने लार्वा में न्यूरॉन्स (9 और 10 चित्रा, मूवी 7 और 8, क्रमशः) को सक्रिय करने के लिए आवश्यक थे. इसलिए, सक्रियण मानकों की आवश्यकता हो सकती है/ प्रायोगिक चरण के आधार पर अनुकूलित calibrated.
दृष्टिकोण हम यहाँ का वर्णन कई संभावित अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यवहार न्यूरॉन्स के विभिन्न subtypes द्वारा हासिल प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए हम इस विधि का उपयोग कर रहे हैं, लेकिन यह भी व्यवहार प्रतिक्रियाओं के विकास को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में जानवर परिपक्व, दवाओं या व्यवहार पर म्यूटेंट के प्रभाव या शरीर क्रिया विज्ञान के साथ संयोजन में या इमेजिंग, नीचे की ओर एक की पहचान न्यूरॉन द्वारा सक्रिय सर्किट विशेषताएँ. इसके विपरीत, halorhodopsin के रूप में इस तरह के निरोधात्मक चैनल, एक तंत्रिका नेटवर्क के भीतर विशिष्ट न्यूरॉन्स को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों को घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है.
Acknowledgments
हम व्यवहार प्रयोगों और DPSS लेजर सेट पर सलाह के लिए Fumi क्युबो, टॉड Thiele और HerwigBaier (UCSF / मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट) धन्यवाद, Heesoo किम और Chiara Cerri महाराज tdTomato प्रयोगों में सहायता के लिए MBL Neurobiology कोर्स (PetronellaKettunen गोटेबोर्ग विश्वविद्यालय ) optogenetic प्रयोगों पर प्रारंभिक सहयोग के लिए, BaljitKhakh, एरिक हडसन, माइक Baca और तकनीकी सलाह के लिए जॉन Milligan (UCLA) और महाराज tdTomato के लिए रोजर Tsien (UCSD) का निर्माण किया. के रूप में यह काम NSF से एक एनआरएसए (5F31NS064817) AMSP और एक अनुदान पुरस्कार (0,819,010 RIG) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
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| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
