Summary
Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。
Abstract
ゼブラフィッシュ幼生は単純な神経回路の発達と機能を記述するためのモデルとして浮上している。彼らの体外受精、急速な発展、および透明度のために、ゼブラフィッシュは、特に神経回路機能を調べるためにoptogeneticのアプローチに適しています。このアプローチでは、光感受性イオンチャネルを活性化または阻害するそれらの意志で、したがって、特定の行動への貢献を評価するための実験を可能にし、特定の神経細胞で発現されています。幼虫のゼブラフィッシュでこれらの方法を適用することは、概念的には単純ですが、技術的な詳細の最適化が必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ幼生体性感覚ニューロン、写真活性化単一細胞でchannelrhodopsin変異体を発現させ、その結果の行動を記録するための手順を示しています。以前に確立された方法にいくつかの変更を導入することによって、このアプローチは、最大活性化する単一ニューロンから行動応答を誘発するために使用することができる少なくとも4日後に受精（DPF）へ。具体的には、タグ付けされたchannelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomatoの発現を駆動するために体性感覚ニューロンエンハンサー、CREST3を使用して導入遺伝子を作成しました。共焦点顕微鏡で画像化することができる体性感覚ニューロンにおけるモザイク式、1細胞期胚の結果にこの導入遺伝子を注入する。照明は、光ファイバケーブルを介して導かれ、473 nmのDPSSレーザーからの光を用いて、これらの動物で細胞を同定し、高速度ビデオカメラで記録し、定量的に分析することができる行動を誘発する。この手法は、任意のゼブラフィッシュの神経細胞を活性化することによって誘発行動を研究するために適合させることができた。遺伝的または薬理学的摂動にこのアプローチを組み合わせることで、回路形成と機能を調べるための強力な手段となります。
Introduction
光の波長と定義されている神経細胞の興奮性を促進または阻害するためoptogenetic方法の開発は、それが可能な行動1、19、21を制御する神経回路のニューロンの異なる集団の機能を研究するために作られました。この技法はしばしばニューロンのグループをアクティブにするために使用されますが、それはまた、個々の神経細胞を活性化するために使用することができます。彼らは半透明であるため、ゼブラフィッシュの幼虫はこれらの方法に特に適している、彼らの神経系はすぐに開発し、トランスジェニック動物を作成することは、迅速かつルーチンです。しかし、重要な技術的ハードルは確実に単一ニューロンの活性化を実現するために克服しなければならない。
シングルゼブラニューロンのoptogenetic活性化のための手順を最適化するために、私たちは体性感覚ニューロンに焦点を当てた。頭を支配する三叉神経ニューロン、およびRohon·ビアード（：ゼブラフィッシュの幼虫は、2つのニューロンの集団を用いて体性感覚刺激の様々な検出RB）の本体の残りの部分を支配するニューロン。各三叉とRBニューロンは皮膚の広範囲に枝が刺激と下流の神経回路に接続する中央の軸索を検出するために末梢軸索を投射する。動物は、コヒーレント性感覚回路5、18を形成していることを示す、21時間後の受精（HPF）には早くもタッチに反応。幼虫の発育中に少なくともマウスナー細胞上にいくつかの三叉神経とRBニューロンのシナプスは、古典的なエスケープ応答を活性化しますが、エビデンスが蓄積され逃避行動2、4のバリエーションを引き出すことができる接続のさまざまなパターンを持つ体性感覚ニューロンの複数のクラスがあることを示唆する10、12、14、15、16、17。この方法を開発するための私たちの動機は、体性感覚ニューロンの異なるクラスの行動機能を特徴づけることであったが、この方法は、原理的にはLARのニューロンのほぼすべてのニューロンまたは人口の機能を研究するために使用することができるvalのゼブラフィッシュ。
ダグラスらは、以前に逃避行動を誘発する3、青色光チャネルロドプシン-2発現性感覚ニューロンを活性化するための方法を記載した。彼らのアプローチは、体性感覚ニューロンでChR2-EYFPの発現を駆動するためにISL1遺伝子からエンハンサー要素を使用していました。この導入遺伝子は、しかし、ChR2-EYFPを発現する細胞の可視化を可能にするために第二のレポーター、UAS :: GFPの同時注入を必要とする、比較的弱い蛍光を表示することが報告された。このアプローチは、24から48の間にHPF行動応答を誘発するために使用されましたが、72 HPF過去の応答を引き出すことができませんでした。この方法は非常に早い幼生期（24〜48 HPF）で神経回路を研究するために動作しつつ、それは、より多様な行動反応は明らかであり、神経回路は、より成熟している年上の幼虫の神経回路と行動反応を特徴づけるには不十分である。
我々はしようとした幼虫のRBのニューロンの亜集団の機能を特徴付けるために、この技術の感度を向上させる。発現を改善するために我々は蛍光標識された光によって活性化されたチャネルの発現を増幅するためのLexA-VP16とのLexAオペレーター配列のストレッチ（4xLexAop）11の発現を駆動するために体性感覚的エンハンサー（CREST3）20を使用していました 。この構成では、第二のレポーターを共発現し、私たちは直接、各ニューロンのチャンネルの相対量を判断できるようにすることの必要性を排除し、チャネルの発現を増幅した。のLexA / LexAopシーケンスを使用することで、Gal4/UASシステムを使用してゼブラフィッシュレポーターラインに導入遺伝子を導入することを可能にするという付加的な利点を持っていた。この導入遺伝子の一過性発現は、発現のレベルを変化させた結果が、通常は数日間にわたって細胞体および個々のニューロンの軸索突起の両方を視覚化することは十分に堅調に推移しました。感度を最適化するには明るみにITY我々はチャネルシェフ、ヘリックスループEF 13でクロスサイトのchannelopsin-1（Chop1）とchannelopsin-2（CHOP2）のキメラから成るchannelrhodopsin変異体を活性化する光を使用していました。このチャネルは、ChR2と同じ波長で活性化しますが、ChR2を含む他の一般的に使用されるチャネル、よりそれがより敏感になるため、活性化のためのより低い光強度を必要としている。シェフのタンパク質は、私たちがチャネルをアクティブにせずにタンパク質の発現をスクリーニングできるように、赤色蛍光タンパク質、tdTomatoに融合させた。光源として、我々はダイオードが幼虫の特定の領域に青色光の正確な、ハイパワーパルスを供給するように、光ファイバケーブルに結合固体（DPSS）レーザ励起に使用。これは、私たちは単一ニューロンにおけるチャネルを発現している稀なトランスジェニック動物を見つけるための必要性を排除し、個々のニューロンにレーザ光の焦点を合わせることができました。このアプローチを使用して、我々は、単一のRBのニューロンを活性化する行動反応を記録することができました高速度ビデオカメラ、および画像共焦点顕微鏡による高分解能で活性化されたニューロンの。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
前もって次の準備をします。
1。ファイバケーブルを準備
- 〜150°の角度を作成するにはブンゼンバーナーの上にガラスパスツールピペットのテーパー首を溶融することによって光ファイバケーブル用のストレージユニットを作成します。
- ワイヤカッターまたはカミソリの刃を使用して、慎重に二つにファイバーケーブルを切断してください。それぞれの作品は、FC / PCアダプタと1露出端に一端があるはずです。予備ケーブルとして1つの作品を保管してください。
- ケーブルの切断端の5.0 cmから繊維ジャケットと強化繊維（ 図1A）を除去して被覆管に光ファイバケーブルをストリップ。
- 準備されたパスツールピペットに光ファイバーケーブルを挿入します。ケーブルは簡単にピペットチップの内外に移動できることを確認します。
- 光ファイバケーブルは、パスツールピペットの先端から突出して、慎重に切断端から約2mm、ガラス繊維の周囲から光ファイバのクラッドをカットし、削除します。
- ダイヤモンドペン/ガラスカッター、ニックガラス繊維とブレークoを使用してffはエンドファイバ（ 図1B）の終わりにきれいにカット/サーフェスを作成する。
- ストレージにパスツールピペットに光ファイバケーブルを収納してください。光ファイバーの先端が不規則に欠けたり休憩される場合は、手順（1.6）を繰り返します。
- マイクロマニピュレータを用いたパスツールピペットの位置ファイバケーブル（ 図1C）。
手順2-8は、多くのゼブラフィッシュの実験に一般的に適用可能な胚に導入遺伝子を注入する方法を説明します。この方法のバリエーションには、他のJoveのビデオ6、7、8、9に記載のものと同様に、22は同等に有効である。
2。注射針を引っ張る
- ニードルプラーを使用して、徐々に先細チップで2注射針にホウケイ酸ガラスチューブを引き出します。プーラーの設定が異なります。 （サターインスツルメンツニードルプラーで私達は設定を使用して、P = 500、ヒート= 720、= 50、速度を引き出し= 70時間= 150）。すべての針プラーのでemがプーラーの設定を最適化し、異なっているpirically。もっとテーパー針については、熱および/またはプルを増やします。少ないテーパー針については、時間および/または減少プルを増やす。
- 安全な容器に入れ針（ すなわち圧延テープ付きペトリ皿、粘着面アウト）。
3。射出成形金型を注ぐ
- アガロースが完全に溶解するまで、30ミリリットルの胚/青い水に0.5グラムアガロースを溶かす。
- シャーレの下半分に注ぐ。
- 井戸の周りに気泡形成を制限するように注意して、アガロースに井戸（ 図2）を搭載したある場所長方形のモールド。
- アガロースを固化することができます。
- 金型を外し、青/胚水でシャーレを埋める。
- 直立して格納し、同じ日の使用のために室温で、または4℃で将来の使用のために、きれいな水で満たされた。
4。注射用プラスミドDNAのミックスを作る
- 蒸留H 2 O中で1:10フェノールレッドでた50 ng /μlの濃度にプラスミドDNAを希釈のために例：
1.0ミリリットル プラスミドDNA（250 ng / ml）を 0.5ミリリットル フェノールレッド 3.5ミリリットル ddH 2 Oを - 数日間のために直ちに使用するか、4℃で保存した場合、DNAの混合物を室温に保つことができる。
5。嵌合ペアを設定
あなたが注射を行うことを計画する前に、これは夕方に行う必要があります。
- システムの水で繁殖タンクを記入し、オスとメスの魚を一緒に配置します。ライトは分圧器を使用して、施設内の別のオスとメスの魚を上に回すと、注射はできるだけ早く行うことができない場合。
6。 （胚を待っている間に行うことができます）注射の準備をする
- 圧力インジェクタリグの電源をオンにします。システムはパルスに設定されていることを確認します。 1に設定し、パルス持続時間で始まります。
- 空気弁の電源をオンにして、〜20 psiにインジェクタに圧力を調整します。
- 最高倍率で解剖スコープを使用して、鉗子や〜2μmの開口部（ 図3、ムービー1）を作成するために火かき棒で針の先端を破る。
- によりDNAミックスで針を埋める：1。 DNAのミックスに、針、先端側を上に置くと針が毛細管現象または2で記入させる。 DNAの1から2μlのピペットに長距離チップを使用すると、針に直接混ぜる。
- 注入する準備が整うまでは、安全な場所に埋め針を置きます。
7。胚を収集
- 施設のライトがオンになった後、仕切り板（該当する場合）を削除します。ストレーナー/小さなふるいで胚を採取し、新鮮な青/胚水でシャーレに移す。
8。 1から2細胞期胚を注入
- プラスチック製のピペットを用いて射出成形金型に収穫胚を転送します。
- 解剖顕微鏡を使って、そっと中に胚をプッシュ鉗子または鈍いポーカーのウェル（ 図4、ムービー2）。
- 胚オーバーマイクロマニピュレータと位置にロードされた針を置きます。
- 希望の音量（〜1 NL）を達成するまで、1ステップ単位でパルス幅を調整することにより、注入量のキャリブレーションを行います。これは、前のJoveのビデオ8、22で説明したように、マイクロスライドでキャリブレーションが、注入量の広い範囲が適切な表現になりますので、この実験の精度のために、必要ではないということです。
- 〜1 nlのDNAはすべての胚の細胞とリピートに直接混ぜて注入する。 DNAはまた、卵黄に注入しますが、これは（ 図5、ムービー3）効率が悪くなる傾向にあることができます。
- 青/胚水の穏やかな流れを使用して金型から注入された胚を取り出します。
- ストアは、暗闇の中で28.5℃で胚を注入した。
- 定期的に未受精卵、損傷または死亡胚を取り出します。
- 胚wiを扱う色素沈着を防ぐために18から24の間にHPF番目PTU。
9。導入遺伝子発現のための画面
- 鉗子を使用して手動でdechorionate 24から48 HPFの胚。
- tricaine 0.02％を使用して幼虫を麻酔。
- 蛍光解剖顕微鏡を用いて、RBまたは三叉神経細胞の発現と幼虫を識別し、新鮮なPTUの青/胚水で新しい皿にこれらを転送します。容易に識別できる細胞内のスパース表現した胚は最適ですが、表現の密度の広い範囲が許容されるので、個々のニューロンは、光ファイバケーブルを使用してアクティベーションの対象となります。
- ストア胚28.5、暗所で℃の希望の実験段階まで。
10。行動実験のための幼虫をマウント
- 蒸留H 2 Oおよび固化からそれを防ぐために、42℃のヒートブロックでストアに1.5％低融点アガロースを加えます。
- 浴槽にガラスパスツールピペット、転送事前にスクリーニングした幼虫のいずれかを使用しできるだけ少ない青/胚水で1.5％低融点アガロースのe。
- 小さなシャーレ上にアガロースのドロップで幼虫を転送します。
- 解剖顕微鏡下では、位置の幼虫の背側のアップ。
- アガロースが固化したとき、全体の幼虫の周りに寒天のくさびを残して、薄いカミソリの刃（＃11メス）でアガロースを切り取った。
- 卵黄の両側に二つの対角線カットを作る;ニックネームに幼虫の世話をしないでください。
- 胚/青い水でアガロースを囲む領域を塗りつぶします。
- 幼虫の体幹と尾（ 図6）からアガロースを引き離す。
11。ハイスピードカメラとイメージングソフトウェアを準備
- スコープを解剖に高速度カメラをマウントします。
- カメラをパソコンに接続する。
- コンピュータの電源を入れます。
- 高速度カメラの電源をオンにします。
- オープンなビデオ/イメージングソフトウェア（我々は、AOSのイメージングソフトウェアを使用し、ここでそれを使用するための手順を説明しますが、他のイメージングソフトウェア）は等しく許容されます。
- それに応じてカメラの設定を調整します（1秒当たりすなわち千フレーム（fps）、50％トリガバッファやその他の設定を設定します）。
- 記録を開始します。
12。 473 nmのレーザーを使用した単一ニューロンを活性化する
- 刺激装置、レーザーと光ファイバケーブルを接続します。
- 刺激装置の電源をオンにします。
- 5ボルトの最大値と5ミリ秒のパルス幅に刺激を設定します。
- 製造元の指示に従って、レーザーをオンにします。
- CHEF-tdTomato発現（ 図6）とニューロンの細胞体の近くに光ファイバケーブルの先端を配置するために解剖顕微鏡を使用しています。
- 感覚ニューロンを活性化するために、青色光のパルスを実現します。
- 高速度カメラを使用してレコードの動作が秒当たり500または1,000フレームに設定。
- 馴化を避けるために、各アクティベーション間の1分待って、必要に応じて実験を繰り返す。 （我々は、各ニューロンのための3つの応答の最小値を記録）。
- へリリースの幼虫は、動物を傷つけないように注意しながら、鉗子でアガロースをこじ開ける。この動物は、さらに発展させることができると手順は、行動の発達を特徴づけるために古い段階で繰り返すことができます。胚はまた後述するように、細胞の構造と動作を相関させるための活性化細胞の高分解能共焦点イメージングのために再マウントすることができます。
- 新鮮な青/胚水で培養プレートに幼虫を移す。我々は個々の幼虫を追跡するために、24ウェルプレートを使用してください。
13。共焦点レーザ顕微鏡を用いた画像ニューロン（S）
- 0.02パーセントtricaineで幼虫を麻酔。
- 1.2パーセント低融点アガロースでまたは背型の台紙の幼虫、最大背側、。
- 画像シェフtdTomato 543 nmのレーザー、適切なフィルタとを目的としたニューロン。我々は20倍対物レンズを使用しています。
- アガロースから幼虫を取り出して、青/胚水でよく個々に戻ります。
- 28.5℃で保存fuが暗闇の中で、Crther分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1。ファイバケーブルは、設置した。光ファイバケーブルの（A）のレイヤー。パスツールピペット（B）中の剥奪光ファイバケーブル。 （C）をパスツールピペットでの光ファイバケーブルは、マイクロマニピュレーターを使用して配置。
図2。射出成形金型テンプレート。
図3。 （動画1）。針を断ち切る。
図4。 （動画2）。射出成形金型内に胚を置く。
ther.withinページ= "always"を> 
図5。 （動画3）。 1細胞期胚に1 nlのDNA混合物を注入する。
図6。マウントされたゼブラフィッシュの幼虫と幼虫タッチ応答に関与する代表的なニューロンの図。ゼブラフィッシュ幼生は部分的に1.5％低融点アガロース（幼虫の吻側部を囲む破線で表されている）に搭載された。三叉神経（頭部）とRohon-あごひげニューロンは（トランク内）は赤で描かれている。マウトナー細胞は幼虫の破線で概説されています。光ファイバケーブル（白）は、RBニューロン細胞体上に配置されて示されている。
oad/50184/50184fig7.jpgの "alt ="図7 "のfo：コンテンツの幅=" 5インチ "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
図7。 （動画4）。シングルRB expressingChEFニューロンの活性化は、行動反応を誘発する。（A）はまだフレームはCHEF-tdTomatoを発現する単一のRBニューロンの活性化を描いた。単一ニューロンが200μmの光ファイバケーブルを経由して 473 nmの青色レーザーから5ミリ秒のパルスによって活性化した。青色レーザーを駆動する電圧を5ボルトの最大に設定した。結果の動作を高速カメラで毎秒千フレームで記録されました。 （B）を共焦点顕微鏡は、イメージ活性化RBのニューロンに使用された。矢印は行動の静止画で刺激領域を示している。 （C）は、RBニューロンの拡大画像は、（B）に示されている。スケールバーは、100μmである。卵黄延長上（ ムービー5および6）同じ魚、（ 動画5）三叉神経の活性化、（ 動画6）、RBニューロン。p_upload/50184/50184fig7large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。
図8。変数条件の下での行動の待ち時間。ほとんどの実験のために、私たちは5 Vの電源（ 図6）によって駆動さ473 nmの青色レーザーから5ミリ秒のパルスでCHEF-tdTomatoを表現〜35 HPFの幼虫で単一ニューロンを活性化した。良いシェフの活性化のダイナミクスを理解するために、我々は行動に及ぼす影響を判断するためのパラメータを変化させた。光パルスの開始から定量するとき、（A）光刺激の持続時間（5ミリ秒に対して10ミリ秒）の遅延に影響を及ぼさなかった。 （B）が35〜HPFで、電圧は逆に待ち時間に影響を与えます。低い電圧では動きの待ち時間の増加をもたらした。我々の実験のために、私たちは最大電圧（5V）PEを使用最も明るく発現RBのニューロンから確実に型にはまった行動を誘発した私達のレーザー装置用rmissible。
図9。 （動画7）。 CHEF-tdTomato 60 HPFの幼虫のRBニューロンを表現の活性化 （）静止フレーム200μmの光ファイバケーブルを経由して 473 nmの青色レーザーから10ミリ秒のパルスによってCHEF-tdTomatoを発現しているRBのニューロンの活性化を描いた。結果の動作を高速カメラで毎秒千フレームで記録されました。 （B）を共焦点顕微鏡は、活性化されたRBのニューロン（群）のイメージに使用されていました。矢印は行動の静止画で刺激領域を示している。スケールバーは、100μmである。
O：SRC = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
図10。 （動画8）。 CHEF-tdTomatoの活性化は、4 DPFの幼虫のRBニューロンを表明した。200μmの光ファイバケーブルを経由して 473 nmの青色レーザーから20ミリ秒のパルスによってCHEF-tdTomatoを発現しているRBのニューロンの活性化を描いた静止フレーム。結果の動作を高速カメラで毎秒千フレームで記録されました。
映画は1。 ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー2。 ムービーを見るにはここをクリック 。
映画は3。 ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー4。TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "ターゲット=" _blank ">ムービーを見るにはここをクリックしてください。
ムービー5は ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー6。 ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー7 ムービーを見るにはここをクリック 。
ムービー8 ムービーを見るにはここをクリック 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、ゼブラフィッシュのライブで単一のRBニューロンのoptogenetic活性化するためのアプローチを説明してきました。我々の方法は、特定の体性感覚ニューロンに蛍光標識channelrhodopsinバリアント、CHEF-tdTomato 13を発現する一過性遺伝子導入を採用しています。このアプローチは、簡単に他の幼虫のゼブラフィッシュの細胞集団での使用に適合させることができた。
この手法を用いて、我々は一貫してシェフtdTomatoを表現する34から48のHPF幼虫から行動反応を誘発した。 5 Vで、青色光の5ミリ秒パルスを用いて、我々は、単一のRBニューロン（ 図7）を活性化することができました。動物に沿った様々な点で光ファイバを配置することによって、我々はそれが行動反応を誘発するために、細胞体に直接青色光を目指すことが必要であることがわかった。光パルスは、シェフを発現しなかった幼虫からの応答を誘発しなかった。また、中枢性軸索または末梢軸索に沿った光パルスは、e、応答を誘発したことがない若齢幼虫でVEN（データは示さず）。我々は自信を持って複数のニューロンが標識された動物では、単一のニューロンを活性化する可能性があるので、他のニューロンの中央の軸索が標的ニューロンの細胞体（ 動画4-6）の近くを通過した場合でも、このプロパティは、有利で あった。
運動学パラメータを評価するためのアプローチの信頼性をテストするために、我々は40と48の間にHPFエスケープ応答（光活性化から行動応答までの時間）、非常にステレオタイプであることが知られているパラメータの待ち時間を決定した。光刺激の持続時間はニューロン活性化に影響を与えるかどうかを判断するために、我々は5または10ミリ秒（ 図8A）の標的ニューロンを照らした。光パルスの開始から計算したときに、両方の条件での行動待ち時間が同じであったので、我々は光パルスの持続時間は動作の待ち時間に影響を及ぼさなかったと結論づけた。しかし、我々は、電圧を下げると、目を増加させることを知りました行動のeは待ち 時間（ 図8B）。 5 Vで、しかし、多くの応答は（16魚のうち9）20だっ±ナチュラルエスケープ応答に対して報告待ち時間に似て5ミリ秒、。したがって、5 Vでニューロンを活性化することは最大の活性化に近づく。
効果的に古い幼虫で変化単RBのニューロンを活性化するから、行動反応を誘発するためのパラメータ。我々は、正常に、実質的後で以前に報告されたのではなく、4 DPFと同じくらい古い動物から行動反応を誘発した。 48 HPF、年上の幼虫（> 60 HPF）の活性化として一貫していなかった前に、しかし、5 Vで、5ミリ秒の光パルスを持つ単一のRBのニューロンの活性化は、一貫して行動反応につながっている。長い光のパルス（10〜100ミリ秒）は、しばしば古い幼虫（それぞれ図9、図10、映画7および8）のニューロンを活性化するのに必要であった。したがって、活性化パラメータのことを行う必要があります実験段階に基づいて最適化/校正すること。
私たちがここで説明する手法は、多くの潜在的なアプリケーションを使用することができる。我々は、ニューロンの異なるサブタイプによって誘発された行動応答を定義するには、このメソッドを使用しているが、動物が成熟するにつれ、それはまた、行動反応の開発を特徴づけるために使用することができる、薬や行動上の変異の効果や、生理機能との組み合わせでまたは識別ニューロンによって活性後段の回路を特徴付けるためのイメージング、。逆に、ハロロドプシンなどの抑制のチャンネルは、ニューラルネットワーク内の特定の神経細胞を阻害するために使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、レーザーが設定挙動実験とDPSSについてのアドバイスをふみ久保トッドティエルとHerwigBaier校（UCSF /マックス·プランク研究所）に感謝、シェフtdTomato実験を補助するためのMBL神経生物学コースからHeesooキムとキアラCerri; PetronellaKettunen（ヨーテボリ大学）初期optogenetic実験のコラボレーションのために、BaljitKhakh、エリック·ハドソン、マイクバカと技術的なアドバイスのためにジョン·ミリガン校（UCLA）、そしてシェフtdTomato用ロジャーツィン校（UCSD）の構築。 ASへ：この作品はAMSPとNSFからの助成金にNRSA（5F31NS064817）賞（0819010 RIG）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
