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Neuroscience

运行轮活动在啮齿类动物的昼夜节律的记录和分析

doi: 10.3791/50186 Published: January 24, 2013

Summary

昼夜节律在自愿轮运行活动在哺乳动物中的紧密耦合的分子在大脑中的主时钟振荡。因此,这些生活节奏的行为可以被用来研究这个生物钟的功能,遗传,药物和环境因素的影响。

Abstract

当啮齿动物可以免费使用在自己的笼子里一个跑轮,这轮自愿使用将取决于1-5天的时间。夜间啮齿动物,包括老鼠,仓鼠,老鼠,是活跃在夜间和白天的相对不活跃。许多其他的行为和生理的措施,也表现出的生活节奏,但在啮齿动物中,运行轮活动主生物钟,下丘脑的视交叉上核(SCN)的输出作为一个特别可靠和方便的措施。在一般情况下,通过一个过程被称为夹带,每天运行轮活动模式自然会与环境的明暗周期(LD周期, 例如 12小时光照:12小时暗)对齐。但昼夜节律是内源性产生的行为模式,表现出了〜24小时内,并坚持不断的黑暗。因此,在一个LD周期的情况下,记录和分析的行驶轮活动被用来确定主观时间 - 日期。因为这些导演的生物钟节律被称为主观时间天的昼夜时间(CT)。相反,当一个LD周期本,被称为天时间确定由环境LD周期给时的时间(ZT)。

虽然运行轮活动的昼夜节律,通常与SCN时钟6-8,也可能参与昼夜节律振荡器在许多其他地区的大脑和身体9-14日活动节律的调节。例如,生活节奏在食品预见性的活动不要求的SCN 15,16和取而代之的是,与额外的SCN振荡器17日至20日在活动中发生变化。因此,运行轮活动记录的行为提供了重要的信息不仅SCN的主时钟输出,同时也对额外的SCN振荡器的活动。下面我们DESCRIBE使用的设备和方法,记录,分析和显示啮齿类实验动物的自发活动节律昼夜。

Protocol

1。动物房

  1. 凯奇:为了记录的个人啮齿动物活动的运行轮,每个网箱应当拥有一个单一的啮齿动物和运行轮。由于正在运行的车轮可以被认为是一个形式丰富,在所有研究中的所有啮齿动物应该有类似的访问到正在运行的车轮。
  2. 床上用品的变化:动物的处理以及在笼子里或床上用品,都可以非光的昼夜节律的影响,21日至23日的 ,所以,笼网地板是理想的,因为他们尽量减少与动物的接触。尽管有这样一个托盘系统的可用性,床上用品应避免在关键阶段的实验。备选方案包括使用更持久的床上用品,这样可以让更多的罕见笼的变化,或不断变化的笼子放在一个伪随机的时间表。
  3. 隔离箱:网箱应保持在隔离箱,声音衰减,光合作ntrolled,通风良好。根据隔离框的大小和配置,在每个方块中的鸡笼的数目将通常范围从1-8。当住房在一个单一的隔离中的多个笼子里,人们应该知道,来自其他动物的各种气味和声音可以有昼夜节律的影响因子动物个体的行为。为了避免这些问题,应该尝试,以容纳一个笼子里每个隔离箱。
  4. 通风:足够的空气流动是必须的框一个舒适的家居环境为啮齿动物。在每个框中的风扇应该是罩住,以防止光到达的内部从外箱。此外,球迷们通常会去除空气从盒子里吹进了房间。小透光的通风口让空气得以进入隔离箱从几个点,并有助于避免不舒服的微风。为了验证是否有足够的通风,隔离箱内的温度(当封闭几个小时,用灯)应该是几乎相同的温度的房间里它被容纳。
  5. 照明:环境光的强度应该是相同的,在所有的笼子里。在类似的位置上面的每一个笼子里安排一个单独的光,并始终使用同一品牌/类型的灯泡。使用中等强度照明(100-300勒克斯)在笼级。避免过高的照明水平,这是更可能产生的昼夜系统, 本身例如掩模)的光,而不是直接修改应占行为。
  6. 黑暗/暗红色灯光:如果它是必要的处理或治疗动物在黑暗中( 例如,在持续黑暗或夜间),应使用夜视镜。另外,由于昼夜节律系统是相对不敏感,红色波长,昏暗的红色灯光可以使用。您使用的具体红灯应进行测试,以确保它不会ALTER播放轮活动( 屏蔽),或调整生物钟( 产生相移)。

2。数据收集(参见图1 - Vitalview硬件配置)

  1. 运行车轮的直径和人体工程学的行走轮将改变使用量24。因此,使用更小,更轻的轮毂和更大的小鼠,大鼠较重的车轮。当清洗并重新安装车轮,保证车轮​​可以旋转通畅,不要“摆动”,并记录微动开关被激活的车轮每转一圈的。
  2. 微动开关:传动轮的每个革命应该激活磁或机械微动开关。的微动开关的信息经由单个信道被发送,并记录由计算机可以纸槽随时间的数据( 例如每2,5,6,或10分钟)。
  3. 计算机硬件:我们的伦尼NG轮的记录,则与Vitalview由微型发射机( http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm )开发,硬件和软件平台。但是,也有其它记录平台如ClockLab,开发者Actimetrics( http://www.actimetrics.com/ClockLab/ )。这两个平台汇集成一个单一的计算机文件数据从许多单个频道的信号源( 例如,一个单一的微动开关由一个单一的运行轮激活)。从各个通道的数据,然后可以绘制和分析,分别在稍后的日期。

3。数据记录

  1. 文件:上面提到的软件平台可用于分离出单一的渠道,使个别文件被创建为每个运行的轮记录。这些数据是最好的可视化和图形化特别DESIGNED程序,如Actiview(Minimitter,弯曲,OR),Circadia,或Clocklab的(Actimetrics,维尔梅特,IL),它可以生产周期图和actograms。然而,单声道文件也可以打开并使用一般的电子表格程序如Excel(微软,华盛顿州雷德蒙市)进行分析。
  2. 计算昼夜时间(CT):CT 12,顾名思义,运行轮在夜间啮齿动物活动的发生。在24小时一天的同时,按照惯例,一昼夜被分解成24个昼夜小时。因此,如果自由运行的昼夜周期是24小时30分钟,所测得的壁时钟,CT 0将发生约12小时15分钟后,CT12。

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Representative Results

  1. 计算机程序:专门的计算机程序代的actograms和计算的昼夜周期中通常使用的。这些计划包括,但不限于,Actiview(弯,Minimitter,OR)和Circadia。
  2. actograms:Actograms提供每日的行驶轮活动模式的图解说明。有单密谋(x-轴= 24小时)和双绘制(x-轴= 48小时)actograms。这两种方法情节连续的天从上到下,但双绘制actograms情节两天就每一个水平线。具体而言,双,绘制actograms显示在最右边的每一行,以及在第二水平行的开始的“第2天”,依​​此类推。双绘图是特别有用的可视化非24小时节律。
  3. 从频谱分析,随着时间的推移轮活动周期图:周期图的构造。周期图显示相对战俘呃为预先设定的期间的范围内,并且通常被用于确定自由运行期间。
  4. 结果:在实验室中,啮齿动物通常装下24小时LD周期。在这些条件下,活性的节奏是夹带的,例如,每天的行驶轮活动模式与精确的24小时LD周期对准。在图2A,双绘制actogram在左侧显示了运行的老鼠,成为活跃在同一时间,每个轮活动后不久,对环境的灯都被关闭。在右侧的周期图显示强峰,在​​24小时时,与夹带到一个精确的24小时LD周期一致, 图2B示出的传动轮使用大鼠被容纳在恒定的黑暗。在这种情况下,每天的发病的行驶轮活动稍迟发生的每一天,创建一个向右“漂移”。这向右“漂移”表示,内源性的生理周期是更大的临屋区N 24小时,但它的峰值在此期间,量化的周期图。据的周期图,最大功率被观察到24.33小时。在自动化的周期图分析相反, 图3示出了一个方法来手动计算自由运行期间使用的时间的行驶轮活动的发病。重要的是要认识到,用手工计算期间,计算它与周期图可能会产生稍微不同的结果。
    的行驶轮活动的每日模式可以以多种方式被打乱, 图4示出了心律不齐的图案的运行轮活性,所产生的电解病变的SCN。这种类型的实验提供了第一个证据,SCN中的“高手”生物钟7,8。在右边的周期图证实了这一点心律失常活动期间的昼夜范围(20-30小时)等价的低功耗模式。该circad伊恩图案的行驶轮的使用也可以被打乱由住房大鼠在恒定的光。 图5示出了已经描述的几个的照明条件下顺序地暴露从大鼠actogram。首先,老鼠被安置在不断的黑暗,表现出一个跑轮活动节律约24.33小时。其次,环境光保持和大鼠被收纳在一个恒定的光环境。恒定的光被称为扰乱的基于SCN-时钟并产生心律失常的行驶轮活动模式,类似于一个SCN病变。这种由光中断,然而,超过2-3周的过程中逐渐发生。因此,当行驶轮的记录被分析后最初的3周在恒定的光时,周期图不产生一个峰值。最后,在第三阶段中,大鼠放回在12小时:12小时LD周期和运行轮活动节律几乎立即恢复。
    的量运行,并且一天中的时间,它发生小人,也可以由环境因素操纵。比如,如果啮齿动物禁食和给定的时间上有限制的用餐每天,这限制喂食时间表会诱发每天回合食物预支活性的。被称为“预期”,因为它发生之前的每日膳食的到来,并会特别明显,这顿饭是在中间的一天,是相对不活跃的时候,昼伏夜出啮齿动物。比如,如果一个实验提供了一个单一的2小时用餐的每一天,食品可以添加到笼ZT 4(4小时后,灯打开)和6(2小时后)ZT除去。此外,在笼子里的铁丝网地板也有利于这种类型的实验,因为它使得它无法隐藏食物的老鼠,并将其存储后,从而确保对大鼠实际上是消耗所有的食物在规定的吃饭时间。最后,一​​个准确的行驶轮活动记录的主要优点之一是,它允许为关联s到整个大脑和身体之间的磨合轮活动和日常振荡的生物钟基因表达中的表达。
  5. 常见的陷阱:
    1. 许多软件平台自动调整为夏令时更改。进行实验时年时间的变化的时候,这个选项是关闭的录音软件,以及计算机操作系统软件。此保护措施应有助于避免记录和外部的光周期之间的差异。
    2. 为了能够在数据上的差异或意外行为的变化来检查,让每开箱精确的时间和日期的文本文件,喂食喂水,床上用品的变化,实验操作,以及其他任何可能发生的中断。还应当注意在此文件中的数据记录的精确的开始和结束时间。
    3. 重要的是要定期检查的灯都打开和关闭t的预期时间。许多问题都可以发生,包括停电,烧坏灯泡。一些正在运行的车轮平台都配有光线感应器,但别人不确认的照明条件。

图1
图1。的Vitalview硬件配置开始,一种啮齿动物传动轮,它被设计来激活一个微动开关与每个革命。这个信息,然后传播到的QA4模块,被传递到的DP24数据端口和最后的Vitalview配备的电脑记录。该计算机运行的车轮转求和从每个通道中每10分钟;购买这些数据可以被视为作为actogram或周期图。他们根据如何的灯都成立,可以远程控制,或者由相同的Vitalview设备齐全的计算机或从任何电子商店购买的墙定时器。

图2
图2。的代表actograms和周期图雄性Wistar大鼠坐落在一个12小时:12小时LD周期(A),并在不断的黑暗(B)。双绘制actograms(左栏)示出了沿顶部的照明条件下,48小时运行轮沿X-轴的活动,和情节从顶部到底部的顺序天。周期图(右列)上的传动轮在actograms所示的数据进行频谱分析, 图1A示出的大鼠的行为,被安置下24小时LD周期。在这些条件下的大鼠变得活跃在同一时间的每一天,示出一个确切的24小时的峰值中的周期图, 图1B示出的大鼠的行为被收纳在不断的黑暗。在THES Ë条件下,老鼠是活跃的稍晚些时候的每一天,因此在actogram向右漂移,高峰周期图和24.33小时。

图3
图3。时期也可以外推的手。首先,最适合的日常活动开始(红色线)的基础上画一条线。接下来的斜坡小时/天计算,请记住,如果节奏是24小时的斜率为负值,最后加24小时。此过程会估计该动物的生理周期。在这种情况下,4 hr/10天表明动物成为活性约0.4小时后,每一天(斜率0.4小时/天)。因此,生理周期大约是24.4小时(约24小时24分)。根据CT定的任何操作,需要自由运行期间的CT作出准确的预测。

ENT“FO:保持together.within”页面=“总是”> 图4
图4。电解病变的SCN模式运行轮活动会产生心律失常。老鼠老鼠在这种情况下,设下不断的黑暗,因为“大师”生物钟已经损毁,无法显示的内源性昼夜节律的运行轮活动。在右侧的周期图证实,有在昼夜节律的范围内没有明显的节奏。

图5
图5。照明条件的模式运行的轮活动的强烈影响。在此记录,对大鼠在持续黑暗(DD),最初设表示的阴影部分的记录。在此conditi上,驱动昼夜节律生物钟的运行轮活动一段时间为24.33小时,周期图(右上)。接着,大鼠收纳恒定的光下(LL)上,如所表示的白色部分的actogram。在此条件下的内源性生物钟超过2-3周逐渐被破坏,并且如所示的周期图(右中)的大鼠变得心律失常。最后,已恢复正常12小时:12小时LD周期的运行轮活动节律恢复了一个精确的24小时节律周期图(右下)。

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Discussion

监测日活动节律运行的车轮是最常用和最可靠的方法来评估在夜间啮齿类动物的主生物钟的输出。轮运行的活动,但是,只有一个,可以连续监测的行为和生理的许多方面。虽然绝大多数的磨合轮活动发生在夜间,超过30%的总觉醒发生在白天25,26。其他端点可用于评估,包括活动,食品斌方式,饮酒,睡眠,体温的昼夜节律。因此,根据性质的研究中,研究人员记录数的节奏同时进行。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者要感谢全宗德拉RECHERCHE连接健康魁北克省(FRSQ),加拿大卫生研究院(CIHR),自然科学和工程研究理事会,加拿大(NSERC)的薪酬奖励,设备补助金,营运资金,和Concordia大学研究主席的计划(CRUC),以及在此稿件由简·斯图尔特博士颇有见地的反馈意见。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitalview Card & Software Mini Mitter #855-0030-00 (Bend, OR, USA)
DP24 Dataport Mini Mitter #840-0024-00 (Bend, OR, USA)
QA4-Module Mini Mitter #130-0050-00 (Bend, OR, USA)
Magnetic Switch Mini Mitter #130-0015-00 (Bend, OR, USA)
C-50 Cable assembly Mini Mitter #060-0045-10 (Bend, OR, USA)
Rat running wheel assembly Mini Mitter #640-0700-00 (Bend, OR, USA)
Cage and tray support Mini Mitter #640-0400-00 (Bend, OR, USA)
Useable cut away cage Mini Mitter #664-2154-00 (Bend, OR, USA)
Grid floor for cage Mini Mitter #676-2154-00 (Bend, OR, USA)
Waste tray Mini Mitter #684-2154-00 (Bend, OR, USA)
Lamp housing Microlites Scientific #R-101 (Toronto, ON, Canada)
4W Fluorescent lamps Microlites Scientific #F4T5/CW (Toronto, ON, Canada)
Isolation chambers Custom built 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine.

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Verwey, M., Robinson, B., Amir, S. Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents. J. Vis. Exp. (71), e50186, doi:10.3791/50186 (2013).More

Verwey, M., Robinson, B., Amir, S. Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents. J. Vis. Exp. (71), e50186, doi:10.3791/50186 (2013).

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