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Neuroscience

쥐에 활동 륜 실행에 녹음 및 Circadian 리듬 분석

doi: 10.3791/50186 Published: January 24, 2013

Summary

자원의 Circadian 리듬은 휠을 실행 포유류 활동은 단단히 뇌의 마스터 시계의 분자 진동에 커플 링된다. 따라서 행동이 일상 리듬이 circadian 시계의 기능에 대한 유전자, 약리, 환경 요인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

설치류가 자신의 홈 케이지에서 실행 휠을 무료로 이용하실 수 있습니다 때이 바퀴의 자발적인 사용은 일 1-5의 시간에 따라 달라집니다. 쥐, 햄스터, 그리고 마우스 등의 야행성 동물은 밤에 활성화되어 있으며 하루 동안 상대적으로 비활성. 많은 다른 행동과 생리 조치는 일상 리듬을 전시하지만, 동물에 실행 륜 활동이 마스터 circadian 시계, 시상 하부의 suprachiasmatic 핵 (SCN)의 출력 특히 안정적이고 편리한 측정 역할을합니다. 일반적으로 유입이라는 프로세스를 통해 실행 륜 활동의 일상 패턴은 자연 환경 빛 어두운주기 (; : 12 시간 - 어두운 예를 들어 12 시간 - 빛 LD 사이클)로 정렬됩니다. 그러나 circadian 리듬이 endogenously 일정한 어둠 속에서 ~ 24 시간 기간을 전시하고, 지속 행동의 패턴을 생성됩니다. 따라서, LD주기의 부재에, 실행 륜 활동의 기록 및 분석 할 수 있습니다시간의 일 주관적인를 결정하는 데 사용됩니다. 이러한 리듬은 circadian 시계가 감독하기 때문에 시간의 하루 주관적인는 circadian 시간 (중부 표준시)라고도합니다. 반면, LD주기가 존재할 때, 환경 LD주기에 의해 결정되는 시간의 하루는 zeitgeber 시간 (ZT)라고합니다.

실행 륜 활동에 circadian 리듬은 일반적으로 SCN 시계 6-8에 연결되어 있지만, 뇌와 몸 9-14의 많은 다른 지역에 circadian 발진기는 매일 활동 리듬의 규정에 관여 할 수있다. 예를 들어, 식품 예상 활동에 매일 리듬은 SCN 15,16을 필요로하지 않고 대신 추가 - SCN 발진기 17-20의 활동의 변화와 상관 있습니다. 따라서, 실행 륜 활동 녹음 마스터 SCN 시계의 출력에 대한뿐만 아니라, 매우 SCN 발진기의 활동에뿐만 아니라 중요한 행동 정보를 제공 할 수 있습니다. 우리는 descr 아래장비와 실험실 쥐에 circadian 전위의 활동 리듬을, 기록 분석하고 표시하는 데 사용할 방법을 ibe.

Protocol

1. 동물 주택

  1. 케이지 : 개별 쥐의 실행 륜 활동을 기록하기 위해, 각 케이지는 단일 쥐 및 실행 휠을 수용해야합니다. 실행 바퀴가 농축의 한 형태로 간주 될 수 있기 때문에, 모든 연구의 모든 동물은 실행 휠과 유사한 액세스 할 수 있어야합니다.
  2. 침대 변경 : 그들은 동물과의 접촉을 최소화하기 때문에 동물 처리뿐만 아니라 새장 또는 침구의 변화는 모든 circadian 리듬 21-23에 비 빛 영향을 미칠 수 있으므로, 메쉬 - 바닥이있는 케이지가 이상적입니다. 이러한 트레이 시스템의 가용성에도 불구하고, 침구 변경 사항이 실험의 중요한 단계 중에 피해야한다. 대안이 더 드문 케이지 변경 사항을 허용 오래 지속 침구, 또는 의사 난수 일정에 변경 새장을 사용하여 포함되어 있습니다.
  3. 절연 상자 : 연습장은 소리 감쇠, 빛 공동 아르 격리 상자에 보관해야합니다ntrolled, 그리고 환기가 잘되는. 격리 상자의 크기와 구성에 따라 각 상자 케이지의 수는 일반적으로 1-8까지 다양합니다. 단일 절연 상자에서 여러 새장을 주택 때, 하나는 다른 동물에서 나오는 각종 냄새와 소리가 개별 동물의 circadian 행동에 혼란 영향을 미칠 수 있다는 것을 알고 있어야한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 하나는 절연 상자 당 하나의 새장을 수용하려고 시도합니다.
  4. 환기 : 적절한 공기 흐름이 상자 설치류 동물을위한 편안한 가정 환경 만들기에 필수적입니다. 각 상자의 팬 내부에 도달 상자 외부에서 빛을 방지 할 수 있도록, 후드해야합니다. 또한 팬들은 일반적으로 상자에서 공기를 제거하고 방에 날려 것입니다. 작은 빛 빡빡 통풍구는 공기가 여러 지점에서 격리 상자를 입력 할 수 있으며 불편 바람을 방지하는 데 도움이됩니다. 적절한 환기, 절연 상자 안에 온도가 (가 있다는 것을 확인하기 위해)에 걸리면 몇 시간 동안 폐쇄는가 설치된 방에있는 온도에 거의 동일해야합니다.
  5. 조명 : 환경 광도 모든 케이지에서 동일해야합니다. 각 케이지 위의 비슷한 위치에서 하나의 빛을 정렬하고, 항상 같은 브랜드 / 전구 유형을 사용합니다. 케이지 수준에서 중간 강도 조명 (100-300 룩스)를 사용합니다. 오히려 circadian 시스템 이라기보다는 (예 : 마스킹)보다 빛에 기인 행동에 직접 변경 사항을 생산할 가능성이 더 높습니다 과도하게 높은 조명 수준을, 피하십시오.
  6. 암흑 / 흐리게 붉은 색 조명 :이 어둠 속에서 동물 (상수 어둠 또는 밤에 등) 처리하거나 처리 할 필요가있는 경우, 나이트 비전 고글을 사용합니다. circadian 시스템이 붉은 파장 상대적으로 문자를 구분하기 때문에 또는, 희미한 붉은 조명을 사용할 수 있습니다. 사용 특정 붉은 빛이 그 alte하지 않는지 확인하기위한 테스트해야R 실행 - 휠 활동 (예 : 마스킹) 또는 circadian 시계를 조정 (예 : 위상 편이를 생성).

2. 데이터 수집 (그림 1 참조 - Vitalview 하드웨어 구성)

  1. 바퀴를 실행하면 : 직경 실행중인 휠의 인체 공학적는 사용 24의 양이 변경됩니다. 따라서, 마우스의 작고 가벼운 바퀴를 사용하며, 쥐에 대한 큰 무거운 바퀴. 바퀴를 세척하고 다시 설치하는 경우, 바퀴가 탁 트인, "동요"하지 않으며, 녹화 마이크로 스위치 휠의 각 회전에 의해 활성화되는 돌리고 할 수 있습니다 있는지 확인하십시오.
  2. 마이크로 스위치 : 실행중인 휠의 각 혁명은 자기 또는 기계적 마이크로 스위치를 활성화해야합니다. 마이크로 스위치의 정보는 하나의 채널을 통해 전송하고 컴퓨터에 의해 기록 된 수 빈 시간이 지남에 따라 데이터 (예 : 매 2, 5, 6, 또는 10 분).
  3. 컴퓨터 하드웨어 : 우리 runniNG 륜 녹음 Vitalview, 미니 Mitter (에 의해 개발 된 하드웨어 및 소프트웨어 플랫폼을 만들어 http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). 그러나, 이러한 Actimetrics (에 의해 개발 ClockLab 같은 다른 녹음 플랫폼 있습니다 http://www.actimetrics.com/ClockLab/가 ). 두 플랫폼은 하나의 컴퓨터 파일에 많은 단일 채널 소스에서 데이터를 (예를 들어 하나의 실행 휠에 의해 활성화 한 마이크로 스위치) 함께 가져. 개인 채널의 데이터는 그래프로 작성할 수 있으며 나중에 개별적으로 분석 할 수 있습니다.

3. 데이터 레코딩

  1. 파일 : 위에서 언급 한 소프트웨어 플랫폼은 개별 파일은 각각의 실행 륜 기록이 생성되는 수 있도록 하나의 채널을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 데이터는 가장 시각화과 특별히 고안와 그래프이러한 Actiview (Minimitter, 벤드, OR), Circadia, 또는 모든 periodograms과 actograms를 생성 할 수 있습니다 Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL)와 같은 D 프로그램. 그러나, 단일 채널 파일도 열 및 엑셀 (마이크로 소프트, 레드몬드, WA)와 같은 일반적인 스프레드 시트 프로그램을 사용 분석 할 수 있습니다.
  2. Circadian 시간 (중부 표준시) 계산 : 중부 표준시 12은, 정의에 의해, 야행성 동물에서 실행 륜 활동의 발병입니다. 24 시간 하루와 병렬로, 국제 대회에서 한 circadian 일 24 circadian 시간으로 나뉩니다. circadian 자유 실행 기간이 벽 시계에 의해 측정으로 24 시간 30 분 인 경우 따라서,, CT 0 CT12 후 약 12​​ 시간 15 분 발생합니다.

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Representative Results

  1. 컴퓨터 프로그램 : 전문 컴퓨터 프로그램은 일반적으로 actograms와 circadian 기간의 계산의 생성에 사용됩니다. 이 프로그램은 포함하지만, (Minimitter, 벤드, OR)와 Circadia Actiview에 제한되지 않습니다.
  2. Actograms : Actograms가 실행 륜 활동의 일상 패턴 그래픽 그림을 제공합니다. 단일 해본 (x-축 = 24 시간) 두 번 해본 (x-축 = 48 시간) actograms가 있습니다. 두 가지 방법은 위에서 아래로 플롯 연속 일하지만, 두 번 해본 actograms 계획 각 수평 라인에 두 일. 특히, actograms는 등등까지 각 줄의 오른쪽뿐만 아니라, 두 번째 수평 라인의 시작시에 "둘째 날"을 표시하고, 두 번 꾸몄다. 두 번 플로팅은 비-24 시간의 리듬을 시각화 할 특히 유용합니다.
  3. Periodogram : A periodogram 시간이 지남에 실행중인 휠 활동의 스펙트럼 분석에서 구성되어 있습니다. Periodograms은 상대적으로 탕을 보여미리 설정된 기간의 범위에 대한 어,하고는 일반적으로 무료로 실행 기간을 결정하는 데 사용됩니다.
  4. 검색 결과 : 실험실에서 동물은 보통 24 시간 LD주기에 따라 자리 잡고 있습니다. 이러한 조건에서 활동의 리듬이 실행 륜 활동의 일상 패턴이 정확한 24 시간 LD주기에 맞게 정렬되도록 혼입 된 것입니다. 그림 2A에서이 왼쪽에 actogram을 두 번 해본는 환경 불이 꺼져 된 직후, 같은 시간에 매일 활성화 된 쥐의 실행 륜 활동을 보여줍니다. 오른쪽에있는 periodogram은 정확한 24 시간 LD주기에 유입과 일치 24 시간에서 강한 피크를 보여줍니다. 그림 2B는 끊임없이 어둠에 자리 잡고 된 쥐의 실행 휠 사용을 보여줍니다. 이 경우에는 실행 륜 활동의 매일 증상은 rightward "드리프트"를 작성, 매일 약간 나중에 발생했습니다. 이 rightward "드리프트"는 내생 circadian 기간이 더 THA을 나타냅니다N 24 시간,하지만이 기간을 단정 지을 periodogram의 피크입니다. periodogram에 따르면, 최대 전력은 24.33 시간에 관찰된다. 자동 periodogram 분석 대조적으로, 그림 3은 수동으로 실행 륜 활동의 발병의 시간을 사용하여 무료로 실행 기간을 계산하는 방법을 보여줍니다. 그것은 손으로 기간을 계산하고 periodogram로 계산하는 것은 약간 다른 결과를 얻을 수 있다는 것을 염두에 두어야합니다.
    실행 륜 활동의 일상 패턴은 여러 가지 방법으로 중단 할 수 있습니다. 그림 4는 SCN의 전해 병변에 의해 생산 실행 륜 활동의 arrhythmic 패턴을 보여줍니다. 실험이 유형의 SCN은 "마스터"circadian 시계 7,8를 포함하는 첫 번째 증거의 일부를 제공했습니다. 오른쪽에있는 periodogram은 circadian 범위 (20-30 시간)의 모든 기간 동안 equivalently 낮은 전력을 보여주는 활동이 arrhythmic 패턴을 확인합니다. circad실행 - 휠 사용 이안 패턴은 일정한 빛의 주택 쥐가 중단 될 수 있습니다. 그림 5는 이미 설명 된 조명 조건의 여러에 순차적으로 노출 쥐에서 actogram을 보여줍니다. 첫째, 쥐가 지속적으로 어둠에 자리하고 약 24.33 시간에서 실행중인 휠 활동 리듬을 전시했다. 둘째, 환경 빛에 보관하였으며, 쥐가 일정한 빛 환경에 자리 잡고되었습니다. 지속적인 빛이 SCN 기반 시계를 방해하고 SCN의 병변과 유사한 실행 륜 활동 arrhythmic 패턴을 생산하는 것으로 알려져 있습니다. 빛으로이 중단 그러나, 2-3 주에 걸쳐 점차적으로 발생합니다. 따라서 실행 륜 기록이 일정한 빛의 초기 3 주 후에도 분석 할 때, periodogram는 피크를 얻을하지 않습니다. 마지막으로, 세 번째 단계에 쥐가 12 시간에 다시 넣어되었습니다 : 12 시간 LD주기와 실행중인 휠 활동 리듬은 거의 즉시 복구 할 수 있습니다.
    실행의 양, 그리고 하루의 시간이 OCcurs은 또한 환경 요인에 의해 조작 할 수 있습니다. 설치류는 금식과 매일 시간적 제한 식사를 제공하는 경우 예를 들어,이 제한된 먹이를 일정 식품 예상 활동의 매일 시합을 유발합니다. 그것은이 매일 식사의 도착하기 전에 발생하기 때문에 "예상"이라고한다, 그리고 식사가 하루의 중간에 야행성 동물은 비교적 운영 중지 된 시간을 제공 할 때 특히 분명 있습니다. 실험 매일 하나의 2 시간 식사를 제공하는 경우 예를 들어, 음식 ZT 4 (4 시간 불이 켜져 후)에서 케이지에 추가 할 수 있으며, ZT 6 (2 시간 이상)에 삭제되었습니다. 이게 불가능 쥐가 음식을 숨겨 나중에를 위해 저장, 따라서 쥐가 실제로 소정의 식사 내의 모든 음식이 소요됩니다 것을 보장 할 수있게하기 때문에 또한, 케이지의 철망 바닥은 이런 유형의 실험에 바람직하다. 마지막으로, 정확한 실행 륜 활동 기록의 주요 장점 중 하나는 상관 관계에 대한 수 있다는 것입니다S는 뇌와 몸 전체에 circadian 시계 유전자 발현의 표현에서 실행 륜 활동 및 일상 진동 사이에 만들 수 있습니다.
  5. 일반적인 함정 :
    1. 대부분의 소프트웨어 플랫폼이 자동으로 시간이 변경 사항을 저장하지 일광을 위해 조정할 수 있습니다. 매년 시간이 변경시에 실험을 수행 할 때이 옵션이 레코딩 소프트웨어뿐만 아니라 컴퓨터 운영 체제 소프트웨어에서 해제되어 있는지 확인합니다. 이러한 예방책은 녹음 및 외부 빛을주기 사이의 불일치를 방지하는 데 도움이됩니다.
    2. 데이터 또는 행동의 예상치 못한 변화에 차이를 확인 할 수 있도록, 침구 변경, 실험 조작, 그리고 발생할 수있는 다른 혼란을 공급하고, 물, 모든 상자 열기의 정확한 시간과 날짜가있는 텍스트 파일을 보관. 정확한 시작과 끝 데이터 녹화 시간은이 파일에 또한 주목해야한다.
    3. 그것은 불이와 해제되어 있는지 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다t 예상 시간. 대부분의 문제는 전구에서 정전 및 점화를 포함하여 발생할 수 있습니다. 일부 실행 륜 플랫폼은 빛 센서가 장착되어 있지만 다른 조명 조건을 확인하지 않습니다.

그림 1
그림 1. Vitalview 하드웨어 구성은 각 혁명과 마이크로 스위치를 활성화하기 위해 설계되었습니다 쥐 실행 휠,로 시작합니다. 이 정보는 다음 QA4 모듈을 여행하고 DP24의 데이터 포트에 중계되고 마지막으로 Vitalview 시설이 완비 된 컴퓨터에 의해 기록됩니다. 컴퓨터가 매 10 분마다 채널에서 실행 륜 회전을 표현,이 데이터는 actogram 또는 periodogram로 나중에 볼 수 있습니다. 조명이 설정되는 방법에 따라, 그것들은 같은 Vitalview에 의해 원격하거나 제어 할 수 있습니다시설이 완비 된 컴퓨터 또는 전자 제품 가게에서 구입 한 벽 타이머에 의해.

그림 2
그림 2는 12 시간에 자리 잡은 남성 Wistar 쥐에 대한 대표 actograms 및 periodograms :. 12 시간 LD 사이클 (A) 지속적인 어둠 속에서 (B). actograms (왼쪽 열)가 조명 상단의 조건, X-축을 따라 실행 륜 활동 48 시간, 그리고 위에서 아래로 플롯 연속 일을 설명 두 번 꾸몄다. Periodograms (오른쪽 열)은 actograms에 도시 된 실행 휠 데이터를 스펙트럼 분석을 수행합니다. 그림 1A는 24 시간 LD주기에 따라 자리 잡고 된 쥐의 동작을 보여줍니다. 이러한 조건에서 쥐가 periodogram으로 정확한 24 시간 피크를 보여주는, 동시에 매일에 사용하실 수 있습니다. 그림 1b는 지속적으로 어둠에 자리 잡고 된 쥐의 동작을 보여줍니다. thes 아래 전자 조건은 쥐가 약간 나중에 따라서 rightward actogram에서 표류하고 periodogram에서 24.33 시간 피크 매일 활동했다.

그림 3
그림 3. 기간도 손으로 추정 할 수 있습니다. 첫 번째 작업의 일상 발병 (빨간색 선)에 따라 최적의 선을 그립니다. 다음 H / 일의 기울기를 계산, 리듬을 <24 시간 인 경우 경사가 음수 값이 될 것 기억, 마지막 24 시간을 추가합니다. 이 절차는 동물 circadian 기간의 추정치를 제공합니다. 이 경우, 4 hr/10 일 동물은 약 ​​0.4 시간 후에 매일 (경사 0.4 시간 / 일) 활성화되고 있습니다하는 것이 좋습니다. 따라서 circadian 기간은 약 24.4 시간 (또는 약 24 시간, 24 분)입니다. 중부 표준시에 따라 예정되어 모든 조작은 중부 표준시의 정확한 예측을 할 수 무료로 실행 기간을 필요로합니다.

다닐 "강한 : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 4
SCN의 그림 4. 전해 병변이 실행 륜 활동 arrhythmic 패턴을 생성합니다. "마스터"circadian 시계가 lesioned 되었기 때문에이 경우에는 쥐가 일정한 어둠 아래 자리 잡고 있으며되고, 쥐가 실행 륜 활동 내생 circadian 리듬을 표시하지 못합니다. 오른쪽에있는 periodogram은 circadian 범위에 상당한 리듬이없는 것을 확인합니다.

그림 5
그림 5. 조명 조건은 휠 활동을 실행의 패턴에 강력한 효과가 있습니다. 이 기록에서 쥐가 처음 레코드의 그늘진 부분에 의해 표시된대로, 일정한 어둠 (DD)에서 자리 잡고 있습니다. 이 conditi 아래에, circadian 시계는 periodogram (오른쪽 상단)로 표시 24.33 시간의 기간과 실행 륜 활동에 circadian 리듬을 조절합니다. actogram의 흰색 부분에 의해 표시된대로 다음, 쥐가 일정한 빛 (LL) 아래 자리 잡고 있습니다. 이 조건에서 내생 circadian 시계는 2~3주을 통해 점진적으로 중단되고, 같은 쥐 arrhythmic됩니다 periodogram (가운데 오른쪽)이 표시. 마지막으로, 일반 12 시간은 : 12 시간 LD 사이클은 복원되었으며 periodogram (오른쪽 하단)에 의해 그림과 같이 실행 륜 활동 리듬이 정확한 24 시간 리듬으로 복원되었습니다.

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Discussion

실행 바퀴를 사용하여 매일 활동 리듬을 모니터링하는 것은 야행성 동물의 마스터 circadian 시계의 출력을 평가하기위한 가장 일반적으로 사용하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 휠 - 실행 활동은, 그러나, 행동과 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다 생리학의 여러 측면 중 하나입니다. 실행 륜 활동의 대부분은 밤에 발생하지만, 총 잠이 오지 않음의 30 % 이상이 낮 25,26 동안 발생합니다. 다른 끝점은 ​​일반적으로 활동, 식품 빈 접근 음주, 수면, 그리고 체온 등의 circadian 리듬을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 연구의 특성에 따라, 연구자가 동시에 여러 리듬을 기록 할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

저자는, 드 라 공들인 실내 santé 퀘벡 (FRSQ), 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC) Fonds에서 급여 상, 장비 보조금, 운영 자금을 인정하고 싶습니다 그리고 Concordia는 대학 연​​구 의자 프로그램 (CRUC)뿐만 아니라, 박사 제인 스튜어트에서이 원고에 대한 의견.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitalview Card & Software Mini Mitter #855-0030-00 (Bend, OR, USA)
DP24 Dataport Mini Mitter #840-0024-00 (Bend, OR, USA)
QA4-Module Mini Mitter #130-0050-00 (Bend, OR, USA)
Magnetic Switch Mini Mitter #130-0015-00 (Bend, OR, USA)
C-50 Cable assembly Mini Mitter #060-0045-10 (Bend, OR, USA)
Rat running wheel assembly Mini Mitter #640-0700-00 (Bend, OR, USA)
Cage and tray support Mini Mitter #640-0400-00 (Bend, OR, USA)
Useable cut away cage Mini Mitter #664-2154-00 (Bend, OR, USA)
Grid floor for cage Mini Mitter #676-2154-00 (Bend, OR, USA)
Waste tray Mini Mitter #684-2154-00 (Bend, OR, USA)
Lamp housing Microlites Scientific #R-101 (Toronto, ON, Canada)
4W Fluorescent lamps Microlites Scientific #F4T5/CW (Toronto, ON, Canada)
Isolation chambers Custom built 28"H x 20"W x 28"D ½" Black Melamine.

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References

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Verwey, M., Robinson, B., Amir, S. Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents. J. Vis. Exp. (71), e50186, doi:10.3791/50186 (2013).More

Verwey, M., Robinson, B., Amir, S. Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents. J. Vis. Exp. (71), e50186, doi:10.3791/50186 (2013).

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